劉 穎 梁 盈 林親錄

LIU Ying 1，2 LIANG Ying 1，2 LIN Qin－lu 1，2

魯 倩1，2 田明慧1，2 朱鳳霞1，2

LU Qian 1，2 TIAN Ming－h(huán)ui 1，2 ZHU Feng－xia 1，2

（1.中南林業(yè)科技大學，湖南 長沙 410004；2.稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004）

（1.Center South University of Forestry ＆ Technology，Changsha，Hunan 410004，China；2.National Engineering Laboratory for Rice and By－product Deep Processing，Changsha，Hunan 410004，China）

南瓜又名麥瓜、番瓜、倭瓜、金冬瓜，為葫蘆科屬植物，含有淀粉、蛋白質、胡蘿卜素、維生素VB、VC和鈣、磷等營養(yǎng)成分，不僅具有較高的食用價值，還具有良好的降血糖、降血壓、防癌保健等藥用價值［1］。其中的主要成分為南瓜多糖。南瓜多糖是一種非特異性免疫增強劑，能提高機體免疫功能，促進細胞因子生成，通過活化補體等途徑對免疫系統(tǒng)發(fā)揮多方面的調節(jié)作用［2］。南瓜多糖具有降血糖、降血脂、抗癌、抗氧化等作用［3－6］，此外，它還可以清除機體在代謝過程中產生的多種自由基包括超氧陰離子自由基（O）、羥自由基（·OH）及其活性衍生物H2O2等［7］。文章擬以南瓜多糖為研究對象，對近年來國內外在南瓜多糖分離提取技術、抗氧化活性及分子修飾對其抗氧化功能帶來的影響等方面的研究進行概括闡述，以期為尋找和開發(fā)一種新型的天然抗氧化劑提供理論參考。同時也為南瓜多糖在食品和醫(yī)藥方面的應用研究提供理論依據。

1 南瓜多糖的提取方式

1.1 熱水浸提法

熱水浸提法是一種常用提取方法，其操作簡單，但耗時長，得率低。游見明［8］對南瓜多糖的熱水浸提工藝進行了優(yōu)化。結果表明，在料液比1∶12（m∶V），提取溫度65℃下提取150 min，南瓜多糖的提取率為2.1%左右。王強等［9］將南瓜于65℃下進行干燥，粉碎得南瓜皮粉，再在液料比25∶1（V∶m），提取溫度95℃熱水中提取2次，每次提取2 h，并采用Sevage法脫蛋白（8次），其南瓜多糖得率為3.52%。推測前者提取率略低的原因可能是材料未經過預處理，導致南瓜多糖溶出不充分；此外，原料來源不同也可能是造成提取率不同的原因之一。

1.2 超聲輔助法

超聲輔助法是在不改變提取物生物活性的前提下，先利用超聲波破壞植物細胞壁，來縮短提取時間，但因設備限制難以規(guī)模化生產。向燦輝［10］以80℃下干燥、粉碎制備的南瓜粉為原料，對其多糖的超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化。結果表明，在低功率，提取溫度80℃，提取時間6 h的條件下，南瓜多糖的提取率為5.32%。王強等［9］以于65℃下干燥、粉碎制備的南瓜皮粉為原料，對其多糖的超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化。結果表明，在功率600 W，提取溫度65℃，提取次數2次，每次提取時間1 h的條件下，南瓜多糖的提取率約為4.43%。二者存在差異的原因可能是在高功率的超聲處理下，南瓜中的糖類成分有所流失（如單糖、低聚糖等小分子物質），造成得率減少。當然原料來源不同也可能是造成提取率不同的原因之一。

1.3 微波輔助法

微波輔助法同樣可以縮短提取時間，但也因設備原因，難以實現規(guī)模化生產。趙二勞等［11］對南瓜多糖的微波輔助提取工藝進行了優(yōu)化，得出最佳的提取工藝為料液比1∶110（m∶V），微波功率360 W，提取時間3 min。該條件下南瓜多糖的提取率可達3.54%。王強等［9］以于65℃下干燥、粉碎制備的南瓜皮粉為原料，在功率600 W條件下微波處理6 min，并進行Sevage法脫蛋白（8次），其南瓜多糖的得率為4.52%。上述試驗說明，原料來源、微波功率、微波作用時間均可能會對南瓜多糖的提取率造成影響。

1.4 酶法

酶提取法是一種較為有效的提取方法，它可分解細胞壁使多糖更易析出，且可以降解蛋白質，具有條件溫和、雜質易除和得率高等優(yōu)點。常用的酶有纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶等。于翠芳等［12］采用纖維素酶對南瓜多糖的酶法提取條件進行了優(yōu)化。結果表明，在料液比1∶30（m∶V），纖維素酶濃度0.7%，提取溫度50℃，冷凍時間30 h的條件下，南瓜多糖的提取率為12.15%。孫婕等［13］對南瓜多糖的復合酶法提取工藝進行了優(yōu)化。結果表明：采用纖維素酶1.0%，果膠酶1.5%，木瓜蛋白酶1.0%的復合酶，在溫度40℃，p H 4.6，料液比1∶30（m∶V），時間30 min條件下南瓜多糖的提取率可達到20.13%。前者僅采用纖維素酶，而后者采用纖維素酶、果膠酶及木瓜蛋白酶，其提取率約是前者的1.65倍，且操作更簡便。說明多種酶協(xié)同提取效果優(yōu)于單一酶。

1.5 其他方法

緩凍可以使植物細胞內產生冰晶，使細胞組織易受損破碎，能強化多糖的提取，且不會破壞物質結構和性質。于斐等［14］研究表明緩凍處理可以有效提高南瓜多糖得率。向燦輝等［10］將于80℃下干燥制備的南瓜粉凍結處理24 h后，取出迅速融化，并于80℃下提取6 h，經脫色和脫蛋白處理后，南瓜多糖得率為5.74%；而在凍融提取法的基礎上輔以超聲處理南瓜多糖提取率為6.05%。丁宏偉等［15］對微波輔助超聲提取南瓜多糖的工藝條件進行優(yōu)化。結果表明，在料液比1∶4（m∶V），微波處理3 min，超聲處理30 min，溫度70℃的條件下，南瓜多糖的提取率為3.65%。刁文超等［16］對超聲波協(xié)同復合酶法提取南瓜多糖的工藝條件進行了優(yōu)化。結果表明，其最佳的工藝條件為功率440 W、提取溫度51.5℃、液料比7∶1（V∶m）、p H 4.4，此條件下，南瓜多糖的得率為4.39%。上述研究表明，微波、超聲、酶法協(xié)同提取時，可能對南瓜多糖結構和性質產生了破壞，導致其得率下降。

綜上所述，原料不同導致的提取率差異不大，但不同方法所帶來的提取率差異較為明顯。如表1所示，酶法提取南瓜多糖的得率最高，其次是超聲波輔助法，提取率最低的是傳統(tǒng)水浴法。這是因為在水浴條件下，無法破壞細胞壁，導致南瓜多糖不能完全釋放出來。與單一提取方法相比，超聲協(xié)同復合酶法卻沒有復合酶法提取率高，這可能是由于超聲對酶造成結構破壞，導致酶活性部分喪失，故提取率下降。微波與超聲波協(xié)同使用沒有單獨提取得率高，這是因為微波處理后破壞了植物的細胞壁，使大量的多糖流出，再用超聲處理就會導致多糖結構的破壞，而無法被收集。相比較幾種提取方法，凍融輔助法相較其他協(xié)同方法是最為理想的方式，該方式提取率高，不破壞多糖結構，且提取率成本低。

表1 不同方法提取南瓜多糖的比較Table 1 Comparison of different methods to extract Pumpkin Polysaccharide

2 南瓜多糖體外抗氧化活性

2.1 消除自由基的能力

自由基的清除是利用氧自由基的氧化或還原性質，使反應體系中的某種反應物發(fā)生氧化或還原反應，生成物在紫外或（和）可見光范圍內某一特定波長下具有最大吸收峰，通過測定反應體系在這一波長下的吸光度的變化，間接測定氧自由基的含量。其常用方法有DPPH（1，1－二苯基－2－三硝基苯肼）法、水楊酸法、超氧陰離子法等。孫婕等［6］在用不同方法提取的南瓜多糖進行清除羥自由基試驗時得出：相同質量濃度下，復合酶法提取所得的南瓜多糖清除羥基自由基（OH·）的能力最強，在南瓜多糖濃度0.3 mg／m L時清除率為40%左右，在1.8 mg／m L時可達83.2%。在清除超氧陰離子試驗中，濃度為20 mg／m L時，酶法提取的多糖清除率可達62.3%。丁宏偉等［15］采用微波輔助超聲技術提取南瓜多糖，并測定南瓜多糖對·OH、O及DPPH自由基的清除效果。結果顯示，不同濃度南瓜多糖對自由基均有較好的清除效果，特別是4 mg／m L以上時，清除效果顯著，清除超氧陰離子的效果最為顯著。綜上所述，不同提取方法對南瓜多糖清除自由基能力的效果不同，酶法提取的能力最強，而采用微波輔助超聲提取清除超氧陰離子的效果最好。

2.2 還原能力

測定物質還原能力一般采用FRAP法，其中Fe3＋吡啶三吖嗪可被樣品中還原物質還原為二價鐵形式，呈現出藍色，并于593 nm處具有最大吸收，根據吸光度大小計算樣品的抗氧化活性的強弱。李筱泉等［17］通過FRAP法測定了南瓜多糖的總還原能力。發(fā)現隨著多糖濃度的增加，總還原能力逐漸增強。當南瓜多糖濃度為8 mg／m L時，其總還原能力相當于0.66 mmo L／L Fe2＋。刁文超等［18］用 FRAP法測定南瓜多糖的總還原能力，得出南瓜粗多糖的總還原能力為0.182 mmo L／g，說明南瓜多糖具有一定的還原能力。

2.3 離體抗氧化活性能力

目前篩選及評價抗氧化活性成分的體外試驗方法主要包括化學測定法和細胞模型法［19］?；瘜W測定法主要通過化學方法測定樣品對脂類物質氧化的抑制能力，或對人工生成自由基的清除能力，繼而進行活性評價。而以細胞培養(yǎng)為基礎的活性篩選模型是用來研究藥物分配進入細胞膜、藥物吸收、與載體或酶等生物大分子相互作用以及清除細胞內氧自由基的有效方法，能更準確地闡述在生物體內的抗氧化反應機理［20］。李俊麗［21］研究了南瓜多糖體外抗氧化活性能力，發(fā)現南瓜多糖可抑制紅細胞的氧化損傷，保護紅細胞膜；當南瓜多糖濃度為625～2 500μg／m L在415 nm下紅細胞溶血率為68.08%～34.99%，溶血率隨多糖濃度的增加而降低。同時，不同劑量的南瓜多糖可以抑制小鼠肝中的丙二醛（MAD）含量，在濃度為2 500μg／m L其 MDA抑制率可達64.09%，抑制率與多糖濃度呈正相關。研究南瓜多糖對Vc＋Fe2＋誘導小鼠肝線粒體腫脹抑制作用過程中，當南瓜多糖濃度達3.75 mg／m L時，幾乎可以完全抑制Vc＋Fe2＋誘導作用，其變化與正常組一致。王運強［22］在溫度為80，60，40，20℃水浴條件下提取南瓜中的多糖（pumpkin polysaccharide，PP），得到4種水溶性南瓜多糖 PP4、PP3、PP2和PP1，經小鼠體外抗氧化試驗，發(fā)現南瓜多糖濃度的逐漸增大，對小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質過氧化抑制能力逐漸加強。其中抑制能力最強的是PP1。當4種水溶性南瓜多糖濃度均為2 mg／m L時，對小鼠肝線粒體腫脹有抑制作用。效果最顯著的也是PPl。推測是由于溫度過高對南瓜多糖提取造成負影響，造成其活性物質的部分損失，導致其細胞內清除自由基的能力降低，因此低溫提取條件得到的南瓜多糖脂質過氧化抑制能力最強。

3 南瓜多糖的體內抗氧化活性研究

3.1 南瓜多糖的消化率

南瓜中所含果膠為天然的低甲氧果膠，在沒有糖存在的情況下可以形成穩(wěn)定的凝膠，保護胃粘膜，加快潰瘍面愈合，對消化道潰瘍具有一定療效。另一方面南瓜所含成分（如多糖、膳食纖維等）能促進膽汁分泌，加強胃腸蠕動，幫助食物消化［23］。金暉等［24］探討了南瓜多糖在體外模擬人工胃液中的動態(tài)變化過程，發(fā)現隨胃酸與胃酶作用時間的延長，還原糖的量緩慢增加，高效凝膠滲透色譜結果顯示作用30 min時出現小分子糖，其還原糖量為0.259 8μg／μL，作用90 min時大分子量多糖出現明顯變化，得出南瓜多糖在攝入人體30 min內就被人體所消化吸收，而同樣條件下紅薯淀粉在人工胃液中的還原糖量為0.087 55μg／μL，可以推測出南瓜多糖是較易被人體消化吸收的［25］。

3.2 動物試驗

眾所周知，隨著年齡的增長，體內自由基含量增多，T細胞受損，免疫功能下降，導致衰老，同時帶來心腦血管疾病的隱患。研究發(fā)現某些多糖既可以從整體上提高機體的免疫功能［26］；又可以抑制脂質過氧化、增強機體對自由基的清除能力［27］，延緩衰老［28］，抑制心腦血 管疾病的發(fā)生［29］。朱 紅艷等［30］建立了用胰島素和高糖來誘導的胰島素抵抗脂肪細胞模型，并驗證南瓜多糖對胰島素抵抗脂肪細胞是否具有保護作用。結果表明，南瓜多糖可以增加胰島素抵抗脂肪細胞對葡萄糖的消耗，而胰島素抵抗脂肪細胞中PPARγ表達明顯低于正常對照組。說明南瓜多糖可能通過提高PPARγ的表達來改善胰島素抵抗脂肪細胞模型的胰島素抵抗性。潘洪志等［31］采用灌胃的方式來觀察染鉛小鼠抗氧化系統(tǒng)的改變及南瓜提取物對抗氧化酶系統(tǒng)的影響。結果得出鉛中毒可以引起小鼠過氧化損傷，南瓜多糖可以減輕鉛中毒引起的脂質過氧化，提高小鼠機體的抗氧化能力。劉穎等［32］將糖尿病大鼠根據血糖和體重隨機分為糖尿病組和南瓜多糖組，同時與正常組進行對照，并分別給予蒸餾水和南瓜多糖灌胃，每周測量體重1次，4周后測定大鼠的血清總膽固醇、空腹血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯、游離脂肪酸和低密度脂蛋白的含量。結果表明，糖尿病組大鼠的高密度脂蛋白、甘油三酯、游離脂肪酸和低密度脂蛋白含量顯著增加，血液中高密度脂蛋白含量明顯降低，補充南瓜多糖后，甘油三酯、總膽固醇、游離脂肪酸和低密度脂蛋白含量明顯降低，而高密度脂蛋白含量升高，南瓜多糖的降脂效果明顯。證明南瓜多糖能夠有效預防心腦血管疾病的發(fā)生。

4 通過分子修飾提高南瓜多糖的抗氧化活性

南瓜多糖除本身具有抗氧化功效外，將其分子進行適當的化學修飾后得到的多糖較修飾前具有更高的活性或者產生新的活性。

4.1 羧甲基化

甲基化方法是分析多糖及其綴合物中糖結構和性質的重要方法，可將多糖中各種單糖結構中的游離羥基全部甲基化，并將甲基化多糖進行水解得到部分甲基化的單糖，通過分析水解后的單糖，來推測多糖分子中各單糖間連接位置［33］。多糖甲基化方法很多，如Purdie法、Cicanu法、Menzies法、Haworth法、Hakomori法及液氨甲基化等。柳紅等［34］采用超聲輔助法提取南瓜多糖并對其進行分離和羧甲基化；鄰苯三酚自氧化法測定羧甲基南瓜多糖對超氧陰離子自由基的清除作用，結果證明羧甲基化后的南瓜多糖具有更好的抗氧化活性。

4.2 硫酸化

在結構修飾中，硫酸酯化是一個頗為有效的修飾手段，多糖大分子中單糖的某些羥基用硫酸根取代，進而加強了多糖分子的固有生物活性。但其穩(wěn)定性還需進一步研究。謝佳等［35］采用氯磺酸—吡啶法，對南瓜粗多糖和分離得到的南瓜PP1多糖進行硫酸酯化，結果表明水提南瓜多糖、水提南瓜AP1多糖（采用十六烷基三甲基溴化銨沉淀法，即CTAB法沉淀得到南瓜多糖為南瓜AP1多糖）、硫酸酯化水提南瓜多糖、硫酸酯化水提南瓜AP1多糖南瓜多糖均能有效清除·OH，隨著濃度的上升，清除效果愈明顯，且采用水法提取的南瓜粗多糖對·OH清除作用明顯優(yōu)于另外3種多糖。而南瓜AP1多糖和南瓜粗多糖對O的清除作用不顯著，但經硫酸酯化的多糖可以有效清除O，且呈量效關系?？踪坏龋?6］采用三氧化硫—吡啶法對南瓜多糖PL2－1進行硫酸酯化修飾，但硫酸酯化修飾取代度不高。其原因可能是南瓜多糖的游離羥基不多，供硫酸酯化的機會較低。

4.3 磷酸化

多糖不僅本身具有多種生物活性，它們的衍生物也具有獨特的作用。磷酸酯是多糖衍生物中重要的一類，也是研究多糖構效關系的重要組成部分，對開發(fā)多糖藥物具有深遠意義。常用于多糖磷酸化的試劑有：三氯氧磷、磷酸及其酸酐、磷酸鹽等。吳瓊等［37］用三氯氧磷（POCl3）對銀耳多糖進行處理，并在60℃恒溫水浴鍋中反應40 min，分離得到了4種磷酸化銀耳多糖。銀耳多糖中羥基的取代度越大，溶解性越好，并進行體外清除自由基試驗，結果表明，修飾后的銀耳多糖與修飾前的相比清除DPPH自由基能力明顯增強。由此推測南瓜多糖也可做類似修飾來改變其分子結構，進而提高或改變其化學性質和生理活性，為今后的應用提供了方向。

從上述結果可以看出無論是經過羧甲基化、硫酸酯化還是磷酸化都提高了南瓜多糖體外清除自由基的作用。硫酸酯化與多糖中游離羥基含量有關，而磷酸化產物結構可控性較差，增加了難度。多糖的硫酸酯化和磷酸化同為聚陰離子修飾，卻因其合成方面的瓶頸而沒有得到廣泛而系統(tǒng)的研究。而羧甲基化制備過程簡單，試劑成本低，產物無毒性等特點，是一種比較理想的衍生方法。

5 展望

多糖為非細胞毒性物質，藥物質量可通過化學手段進行控制，并且毒副作用小，在醫(yī)藥學研究領域有著相當廣闊的應用前景。由于南瓜多糖成本低廉，操作簡單深受企業(yè)的青睞，為其開發(fā)利用提供了廣闊的市場。目前對其研究報道主要集中在降血糖、降血脂方面，而對南瓜多糖抗氧化活性及其作用機制的研究還未見詳細報道，其體內水平、動物水平、細胞水平及分子水平的抗氧化活性機理的研究均不透徹，還有待進一步深入探討。此外，關于南瓜多糖結構修飾及其帶來的影響還不夠清晰，對南瓜多糖進行結構修飾而改變其抗氧化性、溶解性等其他功能性質，也是后續(xù)的研究方向之一。

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