秦 軼 侯小楨 章 斌 鄧其海 丁 心 鄒利運(yùn)

（1.廣東中興綠豐發(fā)展有限公司，廣東 河源 517000；2.韓山師范學(xué)院生物學(xué)系，廣東 潮州 521041）

檸檬是蕓香科柑橘屬水果，在全球范圍內(nèi)均有栽培；其果肉富含VC和礦物質(zhì)，有極佳的食療功效，如預(yù)防糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等［1］。近年來，中國檸檬種植面積不斷擴(kuò)大，產(chǎn)量逐漸增加，市售的檸檬制品種類也日益豐富，包括有檸檬果酒、檸檬果醋、檸檬干片等［2－4］。檸檬加工過程產(chǎn)生的皮渣等廢棄物，富含揮發(fā)性精油、果膠、色素、黃酮類化合物等功能性成分［1，5］，如對其加以高值化綜合開發(fā)與利用，在減小對污染環(huán)境的同時(shí)，也可獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益。

植物精油是重要的植物源次生代謝物，是從植物的果皮、花、葉、莖、根、全草或果實(shí)等部位提取的一種揮發(fā)性油狀液體物質(zhì)；具有獨(dú)特的清香和天然、安全無毒等特點(diǎn)［6］，且含具有抗氧化、抑菌等性能的生理活性成分，應(yīng)用前景十分廣闊。目前，有關(guān)檸檬精油的研究［7－10］多見于提取與組分檢測等方面；本研究擬采用冷壓法從檸檬果皮中提取精油物質(zhì)并檢測其化學(xué)組成；同時(shí)對其在油脂抗氧化與清除自由基方面的性能進(jìn)行研究，旨在為檸檬精油的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

檸檬果皮精油（LEO）：采用冷壓法提取，廣東中興綠豐發(fā)展有限公司；

花生油、豬油：市售。

對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、檸檬酸鈉、鹽酸、亞硝酸鈉、硫酸鈉、無水乙醇、乙醚、氯仿、冰乙酸、碘化鉀：分析純，廣州化學(xué)試驗(yàn)廠；

可溶性淀粉、二甲胺、碳酸鈉、α－萘胺、硫代硫酸鈉、酚酞、檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、過氧化氫：分析純，廣東西隴化工有限公司；

BHT、VC、VE、PG、TBHQ：食品級，河北百味生物科技有限公司；

氣質(zhì)聯(lián)用儀：TRACE GC－MS型，美國Finnigan公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UFJ－7200型，上海尤尼科儀器有限公司；

冷壓榨離心分離機(jī)：HH－2型，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；

pH計(jì)：PHS－3C型，上海雷磁儀器廠；

電熱恒溫水浴鍋：HH－2型，常州華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；

紫外分析儀：WFH－203型，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE－52型，上海亞榮生化儀器廠；

電子分析天平：AUW120型，日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 GC—MS檢測分析條件

（1）色譜條件［11］：色譜柱為 DB－1（30m×0.25mm，0.25μm），載氣為高純氦氣（99.999%），流速為1mL／min，分流比為40∶1，進(jìn)樣口溫度220℃，進(jìn)樣量0.1μL。柱溫從50℃以3℃／min升溫至220℃，保持2min。

（2）質(zhì)譜條件［11］：傳輸線溫度220 ℃，EI離子源，電子能量70eV，離子源溫度230℃，m／z 掃面范圍29～400amu。

1.2.2 超氧陰離子（O－2·）生成抑制能力的測定 用乙醇配制2，4，6，8，10mg／mL的檸檬精油、TBHQ溶液、VC溶液各5mL為樣品溶液。取0.05mol／L的 Tris—HCl（pH＝8.2）緩沖液3mL于試管中，（25±0.5）℃水浴平衡20min后，加入0.1mL上述配制好的各濃度樣品液，然后立即加入7mmol／L的鄰苯三酚0.3mL，振蕩使之充分反應(yīng)4min后，加入10mol／L HCl 1mL終止反應(yīng)，在420nm 處測定吸光度（A1），平行測定3次，按式（1）計(jì)算抑制率［12］：

式中：

I——抑制率，%；

A0——以0.1mL蒸餾水代替樣品液的吸光度；

A1——樣品組的吸光度；

A2——用0.3mL蒸餾水代替鄰苯三酚的吸光度。

1.2.3 OH·自由基清除能力的測定 在一系列50mL容量瓶中加入0.4mmol／L結(jié)晶紫溶液1.5mL、1.0mmol／L的FeSO4溶液2.0mL、2.0mmol／L的 H2O2溶液1.0mL，調(diào)pH 4.0，定容并靜置30min，580nm處測吸光度；同時(shí)測定不加H2O2時(shí)的吸光度，及在上述反應(yīng)體系中加H2O2之前加入LEO溶液和VC溶液的吸光度，按式（2）計(jì)算羥自由基清除率［13，14］：

式中：

R1——羥自由基清除率，%；

A——加H2O2溶液所測的吸光度；

A0——不加H2O2時(shí)所測的吸光度；

A1——加H2O2之前加VC和LEO反應(yīng)液的吸光值。

1.2.4 食用油脂過氧化值（POV）和酸價(jià)值（AV）的測定

分別取0.02%BHT、0.02%PG和0.02%LEO各加入50.00g豬油和50.00g花生油，攪拌均勻，置于60℃電熱恒溫烘箱，每24h交換其在烘箱中的位置，并做空白對照試驗(yàn)，每隔2d取樣測定過氧化值和酸價(jià)；測定和計(jì)算方法按GB／T 5538—2005《動(dòng)植物油脂過氧化值測定》和 GB／T 5009.37—2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》的規(guī)定進(jìn)行。

1.2.5 對NaNO2清除率和亞硝胺阻斷率的測定

（1）NaNO2標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 的 繪 制［15］：分 別 準(zhǔn) 確 吸 取5μg／mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液 0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00，2.50mL 于50mL 比 色 管，加 入2mL 0.4%對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5min后，加入1mL 0.2%鹽酸萘乙胺溶液，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置15min后，于波長540nm處測吸光度；同時(shí)以蒸餾水為空白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y＝0.008 7x－0.000 6。

（2）對 NaNO2清除率的測定［15］：將0.5mol／L的檸檬酸鈉—鹽酸緩沖液（pH 3.0）5.0mL置于10mL容量瓶中，加入100mg／kg的NaNO2溶液1mL，再分別加入一定量的VE、VC和LEO，定容至刻度，37℃下反應(yīng)1h。取1mL反應(yīng)液于50mL容量瓶中，加入0.4%對氨基苯磺酸溶液2mL，0.2%鹽酸萘乙胺溶液1mL，搖勻放置15min后，以蒸餾水為參比液，于540nm處測吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按式（3）計(jì)算NaNO2清除率。

式中：

R2——NaNO2清除率，%；

A0——不加 VE、VC、LEO的空白試驗(yàn)的吸光值；

Ax——不同用量 VE、VC、LEO的反應(yīng)液的吸光值。

（3）對亞硝胺阻斷率的測定［15］：量取1%VE、1%VC和1%LEO 溶液各0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8mL 于25mL比色管中，加入pH 3.0的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液10mL，1mmol／L NaNO2溶液1.0mL和1mmol／L 二甲胺溶液1.0mL，稀釋至刻度并于37℃恒溫水浴1h。然后吸取1.0mL上述反應(yīng)液至50mL燒杯，加入0.5%Na2CO3溶液0.5mL，于紫外分析儀上照15min；取出后加入1%對氨基苯磺酸1.5mL，0.1% α－萘胺1.5mL和蒸餾水0.5mL，靜置15min，525nm波長下測吸光度，同時(shí)測定以去離子水代替亞硝酸鈉標(biāo)液的空白試驗(yàn)吸光度，及以去離子水代替VE、VC和LEO的空白試驗(yàn)吸光度。按式（4）計(jì)算亞硝胺阻斷率：

式中：

B——亞硝胺阻斷率，%；

A0——空白試驗(yàn)的吸光值；

A1——以去離子水代替亞硝酸鈉標(biāo)液的空白試驗(yàn)吸光值；

A2——以去離子水代替VE、VC和LEO的空白試驗(yàn)吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬果皮精油成分分析

按1.2.1條件經(jīng)GC—MS分析采集圖譜，得LEO揮發(fā)性成分色譜圖見圖1，分析鑒定出的LEO化學(xué)組分見表1。由表1可知，LEO中共有23種化合物被鑒定出，占精油總含量的95.43%，其中相對含量較高的組分主要為dl－檸檬烯（47.53%）、γ－萜品烯（11.19%）、α－蒎烯（5.38%）、α－松油醇（4.09%）、Z－檸檬醛（4.07%）、E－檸檬醛（3.99%）等。

圖1 LEO揮發(fā)性成分色譜圖Figure 1 Chromatorgram map of volatile compounds of lemon peel essential oil

2.2 檸檬果皮精油的自由基清除效果

2.2.1 清除羥自由基（OH·）作用 羥基自由基具有極強(qiáng)的氧化能力，可破壞機(jī)體組織中的糖類、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)而引起氧化性損傷。VC具有較強(qiáng)的還原能力，可與OH·發(fā)生氧化還原反應(yīng)而降低其危害；同時(shí)，LEO中的萜烯類化合物含有不飽和鍵，亦可被OH·氧化而對其起到一定的清除效用［16］。由圖2可知，LEO和VC對OH·的清除效果均隨其濃度增大而逐漸增強(qiáng)，且分別在0.4，0.3μg／mL時(shí)趨于平緩，清除率可分別高達(dá)95.14%和98.51%；同時(shí)，可能是由于LEO中所含的萜烯類化合物相對含量不高，以致LEO對OH·的清除效果在試驗(yàn)濃度下略低于同濃度的VC。

2.2.2 抑制超氧陰離子（O－2·）生成作用 抗氧化劑可通過基于H原子轉(zhuǎn)移法（即抗氧化劑通過提供H原子淬滅自由基）和基于電子轉(zhuǎn)移法（即抗氧化劑通過轉(zhuǎn)移電子使自由基被還原）清除O－2·［17］。由圖3可知，VC和LEO對O－2·的抑制效果均隨濃度增大而逐漸增強(qiáng)，其中VC抑制作用的增幅相對較小，抑制率穩(wěn)定在83%～89%；LEO在10mg／mL用量 下 的 抑 制 率 達(dá) 到 最 大 ，為6 1.3 5% 。對 比 明 顯 的 是TBHQ的抑制率隨其濃度增大而呈下降趨勢（這與陳瑩［17］的研究結(jié)論一致），且逐漸與LEO的清除作用接近；造成這一結(jié)果的可能原因是由于TBHQ主要是通過4位羥基給O－2·自由基提供氫原子而達(dá)到清除效果，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

表1 冷壓法所提LEO的揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components of LEO extracted by cold－pressing method

圖2 VC和LEO清除·OH能力Figure 2 Ability of VCand LEO to remove·OH

圖3 VC、TBHQ和LEO清除O－2·能力Figure 3 Ability of VC，TBHQ and LEO to remove O－2·

2.3 對食用油脂的抗氧化作用

由圖4和圖5可知，LEO對食用油脂有一定的抗氧化效果，且總體的抗氧化能力較BHT和PG差。LEO對油脂的抗氧化效果有兩方面的綜合作用：①LEO含有的萜烯類化合物可消耗部分氧而減緩油脂的氧化進(jìn)程［18，19］；②LEO在60℃高溫下因逐漸揮發(fā)，導(dǎo)致其抗氧化能力迅速下降；且LEO在高溫作用下可部分水解產(chǎn)生游離脂肪酸，使油脂體系中的總游離脂肪酸含量較其它試驗(yàn)組略高，一定程度上加快了總油脂體系的氧化進(jìn)程［18，19］。

圖4 豬油在不同抗氧化劑作用下的POV值Figure 4 POV of lard under different antioxidants

圖5 花生油在不同抗氧化劑作用下的POV值Figure 5 POV of peanut oil under different antioxidants

2.4 清除NaNO2和阻斷亞硝胺生成的作用

2.4.1 對NaNO2的清除作用 亞硝酸鈉是肉制品加工中的常用發(fā)色劑，過量使用會引起食物中毒；還可在腸胃中與胺結(jié)合成強(qiáng)致癌物質(zhì)亞硝胺［20］。其分子中—NO2基團(tuán)所含的N為中間化合態(tài)，既具氧化性也有還原性；VC等抗氧化劑有較強(qiáng)的供氫活性，可將亞硝酸鹽分子中—NO2基團(tuán)所含的N還原為—NH＋4，以達(dá)到清除效果降低其潛在毒性危害［21］。

由圖6可知，VE、VC和LEO對亞硝酸鈉均有明顯的清除作用，且清除率均隨其用量增加而迅速增大，當(dāng)用量超過0.1g／mL時(shí)，三者的清除效果趨于平緩上升；LEO用量增至0.7g／mL時(shí)，對亞硝酸鈉的清除效果與VE、VC接近，達(dá)87.50%。

圖6 VE、VC和LEO清除NaNO2效果Figure 6 Effect of VE，VC，LEO to remove NaNO2

2.4.2 對亞硝胺生成的阻斷作用 亞硝胺是一類廣泛存在于啤酒和熏臘食品中的化學(xué)污染物，可引起強(qiáng)烈的致癌、致畸和致突變作用；VC等抗氧化活性物質(zhì)可與胺競爭性結(jié)合亞硝酸鹽，從而阻斷亞硝胺的產(chǎn)生［20］。由圖7可知，VE、VC和LEO對亞硝胺的阻斷作用呈隨用量增大而增強(qiáng)的劑量—效應(yīng)關(guān)系，且LEO的阻斷效果明顯低于VE與VC；在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，LEO的最大阻斷率可達(dá)56.91%。

圖7 VE、VC和LEO阻斷亞硝胺效果Figure 7 Effect of VE，VC，LEO to block nitrosamine

3 結(jié)論

（1）檸檬果皮精油中共有23種化合物被鑒定出，占精油總含量的95.43%；含量較高的主要組分為dl－檸檬烯（47.53%）、γ－萜品烯（11.19%）、α－蒎烯（5.38%）、α－松油醇（4.09%）、Z－檸檬醛（4.07%）和 E－檸檬醛（3.99%）等。精油得率及其化學(xué)組成受提取方法等因素影響而有一定差異，為進(jìn)一步優(yōu)選檸檬精油提取的工藝條件與合理利用其香氣資源，后續(xù)需繼續(xù)開展冷壓法與其它提取方法對精油化學(xué)成分影響的比較研究。

（2）合成抗氧化劑具有潛在毒性作用，開發(fā)理化性質(zhì)穩(wěn)定、已成行業(yè)發(fā)展趨勢。因此，對清除OH·和O－2·自由基及延緩油脂貨架期有較好抗氧化作用的檸檬精油不失為良好的來源之一。

（3）亞硝酸鹽是肉制品加工中常用的發(fā)色劑，但過量使用可引起人體的致癌、致畸等毒性危害；如何降低其在肉制品中的殘留量和尋求等效的替代物已成為行業(yè)普遍關(guān)心的熱點(diǎn)問題。LEO對亞硝酸鈉清除作用（清除率可達(dá)87.50%，遠(yuǎn)高于芹菜籽精油［22］、芫荽莖葉精油［23］和佛手柑精油［24］等）和亞硝胺阻斷作用（清除率可達(dá)56.91%）的試驗(yàn)結(jié)果可為其在香腸等肉制品加工中的實(shí)際應(yīng)用提供借鑒。

1 龔曉，張有捷，李赤翎，等.幾種柑橘類水果功能性營養(yǎng)物質(zhì)測定與比較分析［J］.食品與機(jī)械，2012，28（2）：36～39.

2 謝林，張泗淮，王平先.檸檬酒的研制［J］.釀酒科技，2002（2）：94.

3 王毅，劉學(xué)文，伍學(xué)明，等.檸檬果醋醋酸發(fā)酵工藝的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2011，32（1）：75～78.

4 范蘭娣.凍干檸檬片生產(chǎn)工藝的研究［J］.食品科技，2009，34（5）：54～56.

5 付復(fù)華，李忠海，單楊，等.柑橘皮渣綜合利用技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品與機(jī)械，2009，25（5）：178～184.

6 章斌，秦軼，鄧其海，等.檸檬果皮精油的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2013，34（21）：119～122.

7 A Verzera，P Dugo，L Mondello，et al.Extraction technology and lemon oil composition［J］.Italian Journal of Food Science，1999，11（4）：361～370.

8 Yoshiaki Miyake，Masanori Hiramitsu.Isolation and extraction of antimicrobial substances against oral bacteria from lemon peel［J］.Journal of Food Science and Technology，2011，48（5）：635～639.

9 Fausto Gironi，Marco Maschietti.Continuous countercurrent deterpenation of lemon essential oil by means of supercritical carbon dioxide：Experimental data and process modelling［J］.Chemical Engineering Science，2008，63（3）：651～661.

10 廖玉琴，包清彬，李松柏，等.檸檬精油提取工藝的優(yōu)化及其GC—MS分析［J］.食品與機(jī)械，2012，28（1）：186～189.

11 趙文紅，黃桂穎，陳悅嬌，等.檸檬果皮精油揮發(fā)性成分的GC—MS分析［J］.食品工業(yè)科技，2009，30（12）：113～115.

12 劉婷，厙文波，王婷，等.水蒸氣蒸餾和超臨界萃取薰衣草精油抗氧化作用研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（12）：3 035～3 037.

13 林燕如，丁利君.番石榴葉中黃酮類物質(zhì)提取及其抗氧化性研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2007，23（10）：58～61.

14 索金玲，彭秧，張縱圓，等.石榴葉總黃酮提取工藝及體外抗氧化性研究［J］.生物技術(shù)，2009，19（1）：63～65.

15 梁英岳，傅亮，孫穎鶯，等.模擬胃液條件下紅豆多肽清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（4）：40～44.

16 謝田偉.枇杷花黃酮與精油的提取及其性質(zhì)分析研究［D］.福建：集美大學(xué)，2012.

17 陳瑩.抗氧化劑的抗氧化活性評價(jià)方法研究［D］.江蘇：江南大學(xué)，2012.

18 侯濱濱，李悅.柑橘類精油對食用油脂的抗氧化研究［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31（11）：234～236.

19 張薇薇.高壓電場和抗氧化劑處理對油脂抗氧化作用效果評價(jià)［D］.山西：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

20 趙二勞，王曉妮，張海容，等.山楂清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（10）：29～31.

21 黃葦，李遠(yuǎn)志，趙玲華，等.消除梅菜中亞硝酸鹽的方法研究［J］.中國調(diào)味品，2003（6）：22～25.

22 陸占國，張懷濤，李偉.芹菜籽精油成分以及清除亞硝酸鈉作用研究［J］.化學(xué)與黏合，2008，30（6）：38～40.

23 陸占國，郭紅轉(zhuǎn)，李偉.索氏法提取芫荽莖葉精油和成分解析以及清除亞硝酸鈉作用［J］.食品科學(xué)，2007，28（5）：29～32.

24 章斌，侯小楨，饒強(qiáng)，等.佛手精油的超聲提取及清除亞硝酸鈉作用研究［J］.食品研究與開發(fā)，2011，32（12）：43～47.