賴 婧，張 波，姚日生，3

(1.合肥工業(yè)大學 醫(yī)學工程學院，合肥 230009;2.合肥工業(yè)大學 化學工程學院，合肥 230009;3.農產品生物化工教育部工程研究中心，合肥 230009)

脂肪酸是重要的有機化工和精細化工原料，以脂肪酸為原料生產的下游衍生物廣泛應用于紡織印染、食品、醫(yī)藥、日用化工、石油化工和橡塑加工等許多領域。目前，世界脂肪酸的主要來源是從天然動植物油脂經水解、精餾得到［1］。

微生物油脂，又稱單細胞油脂(single cell oil，SCO)，是指由微生物在一定條件下將碳水化合物、碳氫化合物等基質轉化為菌體內大量貯存的油脂［2－4］。與生產動、植物油脂相比，微生物油脂的生產有許多優(yōu)點［5］:微生物細胞增殖快，生產周期短;生長所需的原料豐富，價格便宜;所需勞動力少，不受季節(jié)、氣候變化的限制;能連續(xù)大規(guī)模生產，生產成本低等。因此，利用微生物發(fā)酵方法，把一些廉價易得的農副產品及食品工業(yè)的廢棄物轉化為所需油脂已日益成為許多研究者關注的熱點［6－7］。

目前，微生物利用淀粉質原料產油脂的一般過程為先將淀粉水解成糖再發(fā)酵產油脂，其中淀粉的水解通常采用雙酶法［8］，在此期間需經過2次pH調節(jié)，過程復雜、繁瑣;而本研究采用實驗室自篩的長孢被孢霉(M.elongate)可直接利用淀粉質原料。針對M.elongate的這一特性，對其發(fā)酵過程進行研究可使微生物發(fā)酵產油脂這一過程大為簡化。

筆者對長孢被孢霉利用淀粉質原料發(fā)酵過程進行研究，并重點研究補料發(fā)酵方案，以期提高微生物油脂的生產利用率。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

M.elongate PFY，合肥工業(yè)大學久易化工研究所自篩;4℃保藏于斜面培養(yǎng)基。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 30、酵母膏 8、K2HPO40.5、ZnSO40.5、MgSO40.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉(待考察)、玉米漿(待考察)、K2HPO40.5、ZnSO40.5、MgSO40.5。

1.1.3 主要試劑

所用玉米漿為市售;酵母膏，北京奧博星生物技術有限責任公司;其他試劑均為分析級。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體培養(yǎng)

種子培養(yǎng):將活化后的菌體挑取2環(huán)接種到100 mL滅菌種子培養(yǎng)基中，置250 mL搖瓶，于28℃、150 r/min轉速下培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng):取培養(yǎng)24 h的種子，按2%的接種量接種到100 mL滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，置250 mL搖瓶，于28℃、150 r/min轉速下，培養(yǎng)一定時間，定時取樣，測定其油脂含量。

1.2.2 菌體生物量的測定

采用細胞干質量［9］(dry cell weight，DCW)法測定菌體生物量。發(fā)酵液過濾、洗滌，得到的細胞于60℃下烘干至恒質量后稱質量，以干菌體質量濃度ρ(DCW)(g/L)表示。

1.2.3 殘?zhí)菨舛鹊臏y定

發(fā)酵液過濾后，濾液進行適當稀釋，采用蒽酮比色法測定發(fā)酵液中總糖殘余量［10］。

1.2.4 菌體內油脂含量的測定及成分分析

選用索氏提取法測定油脂含量［11］:采用沸程30～60℃的石油醚提取干菌體內的油脂，并于90℃下烘干殘余的石油醚，測定油脂質量。油脂含量以菌體內油脂量占菌體干質量的百分數表示，按式(1)計算。

采用GC-MS法分析油脂成分［12］:將油脂進行甲酯化后進行GC-MS分析，測定其中飽和與不飽和脂肪酸的比例。

2 結果與討論

2.1 油脂成分分析

對發(fā)酵所得微生物油脂進行甲酯化處理后進行GC-MS分析，結果顯示該微生物油脂中含有多種脂肪酸組分，其主要成分含量(質量分數):硬脂酸39.90%，油酸31.70%和亞油酸27.30%。

2.2 可溶性淀粉濃度對發(fā)酵產油脂的影響

在維持發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮比不變的前提下，考察可溶性淀粉質量濃度對發(fā)酵產油脂的影響，結果見圖1。

圖1 C源對微生物油脂產量的影響Fig.1 Effects of soluble starch concentration on lipid production

由圖1可以看出，C源的用量對菌體發(fā)酵產油脂的影響較大。隨著可溶性淀粉濃度的增大，菌體干質量不斷增加;而油脂產量則出現先升高后降低的趨勢，并在可溶性淀粉質量濃度為20 g/L時達最大，為198.21 mg/L，且此時底物利用率最高，達0.99%。這是由于當底物濃度較低時，發(fā)酵過程中供能不足，菌種長勢不良，使油脂合成受影響;當底物濃度過高時，菌株長勢較旺，種群密度過大，造成發(fā)酵后期體系溶氧不足，影響油脂合成。

2.3 玉米漿濃度對發(fā)酵產油脂的影響

固定可溶性淀粉質量濃度20 g/L，考察不同玉米漿質量濃度對發(fā)酵產油脂的影響，結果見圖2。

圖2 玉米漿對微生物油脂產量的影響Fig.2 Effects of corn syrup concentration on lipid production

由圖2可以看出:由于N源對菌體生長有促進作用，隨著玉米漿濃度的升高，生物量不斷增加，但油脂含量則呈現先升高后降低的趨勢，并于玉米漿質量濃度為3 g/L時達最大，為278.39 mg/L，且此時底物利用率最高，為1.39%。這是由于在碳氮比低的情況下更有利于菌體的生長和生物量的提高。隨著碳氮比的增加，C源和N源優(yōu)先用于菌體生長，當N源耗盡后，N源成為限制性營養(yǎng)素，細胞不能再繼續(xù)擴增，就把所吸收的C源物質轉化成脂類物質，作為能源物質儲存起來［13－14］。因此，當玉米漿濃度過低時，N源消耗過快，菌體長勢不佳，影響油脂合成;當玉米漿濃度過高時，C源和N源被優(yōu)先用于菌體生長，油脂產量下降。

2.4 發(fā)酵特性曲線

在20 g/L可溶性淀粉、3 g/L玉米漿的條件下，監(jiān)測發(fā)酵7 d內的菌體生物量(以菌體干質量表示)、油脂含量、殘?zhí)菨舛群蚿H變化，結果見圖3～圖4。

由圖3可知:隨著發(fā)酵的進行，菌體濃度和油脂產量不斷增加，糖濃度不斷降低，至發(fā)酵第5天，菌體生物量和油脂產量達最大，且培養(yǎng)基中的C源基本耗盡，殘?zhí)琴|量濃度僅為2 g/L;此后，菌體細胞進入饑餓狀態(tài)，制約生長甚至自溶，造成菌體干質量和油脂產量下降，殘?zhí)菨舛融呌诓蛔儭Ｒ虼?，可確定單批發(fā)酵的最適發(fā)酵時間為120 h。

圖3 發(fā)酵特性曲線Fig.3 Biomass variation with fermentation process

圖4 pH隨發(fā)酵過程的變化Fig.4 Effects of fermentation process on pH

由圖4可知:隨著發(fā)酵的進行，體系pH呈現先降低后升高的趨勢，且在發(fā)酵48～96 h處有一平臺期，此平臺期也是油脂產量升高和殘?zhí)菨舛冉档妥羁斓臅r期。造成這一現象的原因可能是:隨著菌體細胞生長，發(fā)酵液中N源物質逐漸消耗，體系pH下降;當N源消耗殆盡時，菌體細胞開始油脂合成，體系pH基本維持不變;隨著C源物質的進一步消耗，菌體細胞進入衰亡期，菌體自溶，一些胞內物質釋放到發(fā)酵液中，使pH上升。因此，可通過監(jiān)測體系pH變化，確定發(fā)酵結束時間。

2.5 補料發(fā)酵對發(fā)酵產油脂的影響

由菌體生物量和殘?zhí)菨舛入S發(fā)酵的變化曲線可看出，菌體在發(fā)酵48～96 h，底物利用速度較快，故分別選擇發(fā)酵48、72和96 h作為補料開始的時間點，考察僅補C源和同時補加C源和N源對油脂產量的影響。即每隔24 h補料，補料3次，單次補料量為可溶性淀粉2 g，玉米漿補加量隨C/N比變化，結果見圖5。

圖5 補料對微生物油脂產量的影響Fig.5 Effects of fed-batch on lipid yield

由圖5可知:各種補料方案對油脂產量均較不補料組有大幅度提高，且以僅補C源組增幅最大。這是由于補充N源后，培養(yǎng)基中N源增加，C源和N源被優(yōu)先用于菌體生長，隨著N源逐漸被利用，N源成為限制性營養(yǎng)因素，這時，菌體才開始把所吸收的C源物質大部分轉化成油脂。在發(fā)酵48 h和發(fā)酵72 h開始補料，油脂產量和底物利用率相差不大。發(fā)酵48 h開始補料，油脂產量最大為598.96 mg/L，底物利用率為2.3%;發(fā)酵72 h開始補料，油脂產量最大，為 611.63 mg/L，底物利用率為2.35%。但結合發(fā)酵周期及經濟效益，發(fā)酵48 h開始補料發(fā)酵周期比發(fā)酵72 h開始補料發(fā)酵周期短，經濟效益較大。因此，選擇發(fā)酵48 h作為補料開始時間，且可監(jiān)測發(fā)酵過程pH變化，在pH 2.5時開始補料。

在確定補料成分后，考察單次補料量對油脂產量的影響，結果見表1。

由表1可知:隨著單次補料量的增加，油脂產量逐漸增加，直至單次補料量為4 g時，油脂產量最高，此后，隨著單次補料量的進一步增加，油脂產量降低。這是由于補料量過大時，體系黏度較大，溶氧不足，影響油脂合成。因此單次補加4 g可溶性淀粉為最適補料量，此時底物利用率高，且油脂產量最大，油脂產量較不補料時增加521.74 mg，增長率為237.1%。

表1 補料濃度對微生物油脂產量的影響Table 1 Effects of feeding culture concentration on lipid yield

3 結論

通過研究得出如下結論:

1)發(fā)酵所得微生物油脂，其主要成分含量為硬脂酸39.90%，油酸31.70%和亞油酸27.30%。

2)單批發(fā)酵的最適可溶性淀粉為20 g/L，最適玉米漿為3 g/L;N源對菌體增長有促進作用。

3)油脂合成主要在發(fā)酵48～96 h進行，單批發(fā)酵最佳時間為5 d。

4)通過補料工藝研究可知，最適起始補料時間點為發(fā)酵48 h，最適單次補料量為4 g，此時，油脂產量可增加521.74 mg，增長率為237.1%。

通過研究表明，N源對菌株的生長有促進作用，N源濃度較大時，培養(yǎng)基中C源和N源優(yōu)先用于菌體細胞生長，采用限氮補料工藝可大幅度提高微生物油脂的產量。發(fā)酵所得微生物油脂富含硬脂酸、油酸和亞油酸，均是重要的化工原料，可廣泛應用于橡膠、醫(yī)藥和日用品等行業(yè)。

［1］ 陸蠡珠.我國脂肪酸的生產和應用［J］.精細與專用化學品，2007，15(1):24-29.

［2］ Ratledge C.Microorganisms for lipid［J］.Acta Biotechnol，1991，11(5):429-438.

［3］ Ratledge C，Wynn J.The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation inoleaginous microorganisms［J］.Adv Appl Microbiol，2002，51:1-51.

［4］ Ratledge C.Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for single cell oil production［J］.Biochimie，2004，86(11):807-815.

［5］ 李小松，余揚帆.微生物油脂［J］.食品科技，1997(5):8-9.

［6］ 趙宗保，華艷艷，劉波.中國如何突破生物柴油產業(yè)的原料瓶頸［J］.中國生物工程雜志，2005，25(11):1-6.

［7］ 孟祥梅.制取生物柴油的新型原料油源的探討［J］.現代化工，2006，26(22):1-4.

［8］ 劉幸.雙酶法水解淀粉生產葡萄糖工藝條件的探討［J］.福建化工，1991(4):6.

［9］ Zhu Min，Yu Longjiang，LiWei，etal.Optimization of arachidonicacid production by fed-batch culture of Mortierella alpina based on dynamic analysis［J］.Enzyme Microb Technol，2006，38:735-740.

［10］ 郭欣，高向東，楊曉兵.酸性多糖中的葡萄糖醛酸與中性糖的含量測定［J］. 中國生化藥物雜志，2004，25(2):100-101.

［11］ 熊望賢，楊濤，劉光燁.擲孢酵母發(fā)酵紅薯淀粉酶解液產油脂的發(fā)酵條件［J］.應用與環(huán)境生物學報，2008，14(4):558-561.

［12］ Jin M J，Huang H，Xiao A H，et al.Enhancing arachidonic acid production by Mortierella alpina ME-1 using improved mycelium aging technology［J］.Bioproc Eng，2009，32(1):117-122.

［13］ Park E Y，Koike Y，Higashiyama K，et al.Effect of nitrogen source on mycelia morphology and arachidonic acid production in cultures of Mortierella alpina［J］.J Biosci Bioeng，1999，88:61-67.

［14］ Bajpai P K，Bajpai P，Ward O P.Optimization of production of docosahexaenoic acid by Thraustochytrium aureum ATCC34304［J］.JAOCS，1991，68(7):509-514.