王春麗，柳 偉

(1.華東理工大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200237;2.上海市新藥設(shè)計重點實驗室，上海 200237)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1，tyrosinase，TYR)又稱多酚氧化酶、兒茶酚氧化酶、陳干酪酵素等，是1種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含多亞基的含銅氧化還原酶，廣泛存在于微生物、動植物和人體中［1］。酪氨酸酶具有多種生物學(xué)功能，近年來對其在醫(yī)藥、美容、食品和環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用，引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。筆者結(jié)合近年來國內(nèi)外有關(guān)酪氨酸酶的研究成果，對酪氨酸酶的作用機(jī)制、提取制備以及應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述，以期為有關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)以及其深入應(yīng)用提供參考。

1 酪氨酸酶的作用機(jī)制

酪氨酸酶活性中心呈現(xiàn)出雙核銅中心結(jié)構(gòu)(圖1)，由2個銅離子位點組成，與蛋白質(zhì)中的組氨酸殘基結(jié)合，并且由1個內(nèi)源橋基將2個銅離子聯(lián)系起來。當(dāng)酪氨酸等物質(zhì)和酶過渡絡(luò)合時，主要是羥基和酶的活性中心上的原子鍵合發(fā)生作用［2］。在黑色素的催化反應(yīng)過程中，將其分為氧化態(tài)(Eoxy)、還原態(tài)(Emet)和脫氧態(tài)(Edeoxy)3種形式［3］，區(qū)別在于雙核銅離子活性中心的結(jié)構(gòu)不同。

圖1 酪氨酸酶活性中心的雙核銅中心結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of the active center containing Cu of tyrosinase

酪氨酸酶(菌類)催化反應(yīng)具有單酚酶和雙酚酶活性，能催化氧化單酚和雙酚成為苯醌(圖2)。在單酚酶循環(huán)中，Eoxy與單酚反應(yīng)生成苯醌和Edeoxy，后者與O2結(jié)合，最終又重新生成 Eoxy。在雙酚酶循環(huán)中，Eoxy與雙酚反應(yīng)生成苯醌和Emet，后者將另一種雙酚轉(zhuǎn)化為苯醌，其自身轉(zhuǎn)化為Edeoxy形態(tài)，雙酚是Edeoxy形成的必要因素。

酪氨酸酶的單酚酶活性表現(xiàn)出特異的時滯，直到Eoxy提供足夠的雙酚。時滯長短受酶的來源、單酚酶濃度等影響，濃度增大，時滯縮短，但不可完全消除，而雙酚可以完全消除時滯［4］。

圖2 酪氨酸酶的反應(yīng)機(jī)制Fig.2 Reaction mechanism of tyrosinase

酪氨酸酶催化酪氨酸氧化成多巴，多巴氧化形成多巴醌反應(yīng)，控制黑色素細(xì)胞的活性，是黑色素合成的關(guān)鍵酶(圖3)。酪氨酸酶抑制劑的濃度增大，酶活力受到抑制而使得催化效率降低。根據(jù)抑制機(jī)制的不同，將酪氨酸酶抑制劑一般分為競爭型、非競爭型、反競爭型和混合型［5］。

圖3 酪氨酸酶催化黑色素的生物合成過程Fig.3 Process of melanin biosynthesis catalyzed by tyrosinase

2 酪氨酸酶的制備及其活性研究

迄今為止，成功分離出酪氨酸酶的生物主要有真菌(包括霉菌、食用傘菌、酵母菌等)、細(xì)菌、裸子植物、被子植物，昆蟲，脊索動物類，哺乳動物(包括人)［6］。但從植物中提取制備酪氨酸酶的報道較少，實驗中以食用菌與水果為主要酶源，常見原料包括蘑菇、馬鈴薯和蘋果等。實驗中所用的酪氨酸酶純酶大多為國外進(jìn)口，價格昂貴且不宜大規(guī)模應(yīng)用。

研究者通常借鑒國內(nèi)外常用提取酪氨酸酶的方法，選用國內(nèi)低價常用原料來制備酶液。例如王寧芳［7］以 pH 為7.2的 Na2HPO4-HCl緩沖溶液為體系，通過研磨擠壓、過濾、離心分離，提取馬鈴薯中的酪氨酸酶，用分光光度計在480 nm處測定馬鈴薯提取液的吸光度，以吸光度對時間的變化率為反應(yīng)速率，建立多巴溶液的轉(zhuǎn)換動力學(xué)曲線;發(fā)現(xiàn)所測數(shù)據(jù)波動小，酪氨酸酶的催化活性穩(wěn)定性高，準(zhǔn)確度高且效果好，但是多巴價格昂貴。魯衛(wèi)斌等［8］則以鄰苯二酚(兒茶酚)為底物研究自制馬鈴薯酪氨酸酶，發(fā)現(xiàn)其催化產(chǎn)物的最大吸收波長為410 nm，最佳反應(yīng)條件為 pH 6.8、30℃;并用其處理羊毛織物，發(fā)現(xiàn)酪氨酸殘基被催化氧化為多巴醌結(jié)構(gòu)，且能與含有—NH2的物質(zhì)反應(yīng)，為進(jìn)一步研究羊毛改性奠定了基礎(chǔ)。樊倩等［9］以新鮮馬鈴薯、紅富士蘋果、紅蛇果、秀珍菇和紫茄子為研究對象，從中分別提取酪氨酸酶并測定其酶活力，發(fā)現(xiàn)紫茄子的酪氨酸酶活力最為理想，并選擇鄰苯二酚作為紫茄子酪氨酸酶底物;而后研究了有機(jī)合成、無機(jī)鹽和天然提取物3大類抑制劑對酪氨酸酶的催化影響，發(fā)現(xiàn)有機(jī)合成化合物效果最佳。Faridi等［10］從產(chǎn)自伊朗北部的花生中提取酪氨酸酶?；ㄉ砸簯B(tài)氮為體系，隨后通過(NH4)2SO4沉淀和透析。電泳顯示存在2個可能的同工酶。酶活性在純化的不同階段中進(jìn)行測定，也測量一些具有重要物理性質(zhì)的酶。結(jié)果表明，花生酪氨酸酶的最佳pH為5.2、最適溫度為40℃。動力學(xué)研究也確定了米氏常數(shù) Km=257.5 mmol，最大反應(yīng)速度Vmax=0.004 21 mmol/min。

目前，已從各種微生物中分離出不同特性的酪氨酸酶，但要用于商業(yè)目的，其成本高、效率低、產(chǎn)量少仍是棘手問題。隨著生物技術(shù)的成熟發(fā)展，利用基因工程構(gòu)建大量高效的酪氨酸酶工程菌已成為可能。Dolashki等［11］對土壤細(xì)菌產(chǎn)酪氨酸酶進(jìn)行分離和鑒定。通過離心分離，而后經(jīng)過(NH4)2SO4沉淀法和超濾法獲得粗酶，除去褐色素(可能黑色素)后，通過體積排阻色譜進(jìn)一步分離天然蛋白質(zhì)混合物獲得純化酶。雙酚基質(zhì)L-多巴、多巴胺以及單酚基質(zhì)L-酪氨酸的動力學(xué)參數(shù)已確定，即 Km為4.5、1.5 和0.055 mmol/L，純化酶最大活性條件為pH 6.8。王戈林等［12］在微生物產(chǎn)黑色素的發(fā)酵條件研究中，將嗜麥芽假單胞菌的酪氨酸酶基因用重組DNA技術(shù)轉(zhuǎn)入大腸桿菌HB101中，獲得了酪氨酸酶基因表達(dá)較好的工程菌WY8。何偉等［13］采用比較酪氨酸酶的同源保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的方法設(shè)計引物，從蘇云金芽孢桿菌4D11中通過PCR擴(kuò)增得到了包含酪氨酸酶基因的DNA片段，并在大腸桿菌中獲得了表達(dá)，驗證了該基因產(chǎn)生的黑色素可在一定程度上保護(hù)菌體免受紫外輻射，為構(gòu)建產(chǎn)黑色素殺蟲基因工程菌提供了有益的參考。Ren等［14］基于 V.spinosum中的酪氨酸酶基因在大腸桿菌中的成功克隆，建立了1個酪氨酸酶在大腸桿菌中高效表達(dá)的有效模式，并對溫度、誘導(dǎo)物濃度以及不同操作模式下誘導(dǎo)的啟動時間進(jìn)行了研究，經(jīng)過28 h的孵化獲得大約3 g/L活性的酪氨酸酶。

3 酪氨酸酶的應(yīng)用研究

作為1種重要的生物資源，酪氨酸酶有著廣泛的用途，在生物體內(nèi)具有多種重要的生理功能，特別在皮膚美白、抗氧化作用等方面表現(xiàn)尤為突出。另外，結(jié)合固定化［15］、生物傳感器等技術(shù)，在有機(jī)合成、環(huán)境保護(hù)、生物檢測等領(lǐng)域，利用酪氨酸酶進(jìn)行催化氧化、處理工業(yè)廢水、檢測化合物等方向已經(jīng)逐漸成為目前國內(nèi)外研究的熱點。

3.1 有機(jī)合成方面

酪氨酸酶的氧化反應(yīng)可廣泛用于有機(jī)合成領(lǐng)域，可以利用其選擇性羥基化、催化生成活潑中間體合成新化合物等，合成化學(xué)方法難以一步合成的化學(xué)物質(zhì)或難以實現(xiàn)的化學(xué)反應(yīng)過程。如Müller等［16］報道了在氯仿中由固定化酪氨酸酶催化苯酚串聯(lián)羥基化/氧化/Diels-Alder反應(yīng)生成二環(huán)［2.2.2］辛烯二酮的一系列合成;徐迪等［17］發(fā)現(xiàn)用固定化酪氨酸酶催化4-取代烷基或烷氧基單酚類化合物的氧化反應(yīng)可得到相應(yīng)的4-取代鄰苯醌，這類鄰苯醌能和芳香胺發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，烷基或烷氧基從醌環(huán)4位上脫落，繼而得到三取代胺的化合物。將抗炎藥布洛芬引入到單酚的苯環(huán)4位上，在酪氨酸酶和芳香胺同時存在的條件下，也得到脫布洛芬的加成取代產(chǎn)物，顯示4-羥基布洛芬苯酚酯可作為布洛芬藥物載體;另外，以對芐氧基苯酚、對芐基苯酚和對苯氧基苯酚為底物，初步探討了在無溶劑體系中酪氨酸酶催化與鄰氨基苯甲醚的氧化-邁克爾加成反應(yīng)，并考察了各因素對該反應(yīng)速率的影響［18］;Casella 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸酶對苯硫基甲烷(茴香硫醚)具有硫化氧化作用，可以獲得高對映體過剩值的(R)-亞砜。這一發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了酪氨酸酶催化底物的范圍，也為生物法生產(chǎn)高光學(xué)純度的手性化合物開辟了一條新途徑;Stratford等［20］發(fā)現(xiàn)4-氟鄰苯二酚在水緩沖液中由酪氨酸酶催化氧化生成的4-氟-1，2-苯醌，可通過鄰位親核試劑(水或兒茶酚類)快速進(jìn)行替換，并釋放氟離子。4-氯及4-溴鄰苯二酚也有類似反應(yīng);Brooks等［21］實現(xiàn)了蘑菇酪氨酸酶催化生成1個手性乙醇——1-(3，4-二羥苯基)乙醇，這是從非手性底物通過酪氨酸酶產(chǎn)生的第一個手性產(chǎn)品。

3.2 醫(yī)藥美容方面

3.2.1 國內(nèi)研究近況

陳景華等［22］的實驗結(jié)果表明，0.5 ～2 g/L 當(dāng)歸提取物能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(P＜0.01);0.25～2 g/L質(zhì)量濃度可明顯抑制黑素合成(P＜0.05或P＜0.01);不同濃度提取物均能顯著抑制酪氨酸酶，其中1、2 g/L試驗組抑制作用比熊果苷組(P＜0.01)弱，0.125、0.25 和0.5 g/L 試驗組和熊果苷組相當(dāng)。樸香蘭等［23］將連翹用乙醇回流提取，用二氯甲烷、正丁醇和水萃取其有效成分，并檢測出它們均呈濃度依賴性的抑制酪氨酸酶活性。通過硅膠色譜柱法分離成分，利用質(zhì)譜、核磁共振分析手段鑒定出酪氨酸酶抑制成分為白樺脂酸，為五環(huán)三萜類化合物，其 IC50值為(138.5 ± 1.6)μmol/L。唐建陽等［24］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10.5 μg/mL 時，砂仁的30%乙醇提取物(體積分?jǐn)?shù))可使單酚酶的穩(wěn)定態(tài)酶活力下降40%，遲滯時間延長了3.12倍;對二酚酶活力的抑制作用也呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系，酶活力下降60%，IC50值為64 μg/mL，作用機(jī)制為可逆混合型抑制，抑制常數(shù)K1和 K1S分別為41.85和98.51 μg/mL。穆燕等［25］研究發(fā)現(xiàn)，以體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇水溶液為溶劑的白附子粗提物對酪氨酸酶的抑制作用最強(qiáng)，抑制率可達(dá)96.35%;與酪氨酸酶抑制率可達(dá)90.7%的恒溫水浴振蕩提取法相比，超聲波輔助提取法的抑制率達(dá)98.1%。在此提取條件下所得的白附子粗提物的 IC50值為 24.69 μg/mL。孫培冬等［26］測定出藤茶中二氫楊梅素對酪氨酸酶單酚酶的抑制率為95.87%，抑制作用表現(xiàn)為酶催化反應(yīng)的遲滯時間延長;二氫楊梅素對二酚酶的抑制率為69.01%，抑制作用表現(xiàn)為可逆混合型抑制，對游離酶的抑制常數(shù)和對酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)分別為150和83 μmol/L。沈曉佳等［27］研究發(fā)現(xiàn)，紫娟茶的3種提取物對酪氨酸酶單酚酶和二酚酶均有較好的抑制作用，尤其是含有花青素和茶多酚混合物的提取物I。嚴(yán)航等［28］通過添加8倍量的體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇提取2 h，以進(jìn)行優(yōu)化工藝，測定得出提取2次得到的薏苡仁提取物對酪氨酸酶的抑制率達(dá) 33.3%，IC50值為 1.4 mg/mL;Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖顯示，薏苡仁提取物對酪氨酸酶的抑制作用屬于線性混合型抑制。李紅艷等［29］的篩選結(jié)果顯示，紅花水提物的酪氨酸酶抑制作用較強(qiáng)，推測其中9種成分可能具有酪氨酸酶抑制作用，選取驗證并確認(rèn)了羥基紅花黃色素A對酪氨酸酶的抑制作用較為明顯。

3.2.2 國外研究近況

Dung等［30］評估了金銀花的花、葉、枝各部分的乙醇提取物的酚類物質(zhì)、抗氧化性以及酪氨酸酶的抑制活性。實驗結(jié)果顯示，花、葉、枝的酚類物質(zhì)提取率分別為30.00、18.57 和9.12 mg/g;抑制酪氨酸酶活性的 IC50值分別為(11.16 ±2.61)、(15.81 ±3.89)和(17.18 ± 1.76)μg/mL，對照品曲酸為(3.50 ±0.94)μg/mL。Zhang 等［31］從靈芝的乙醇可溶性酸性成分(ESACs)分離出赤芝酸 F甲酯(methyl lucidenate F)，以鄰苯二酚為底物測定酪氨酸酶的抑制活性，結(jié)果顯示為非競爭性抑制作用，Lineweaver-Burk 圖中 Vmax為 0.436 7 min-1，Km為6.765 mmol/L，非競爭性抑制常數(shù)(KI)為 19.22 μmol/L，同時赤芝酸F甲酯顯示出高度酪氨酸酶抑制活性，其 IC50值為 32.23 μmol/L。Kim 等［32］從黃芪中分離出毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡糖苷，檢測出其酪氨酸酶抑制活性的IC50值為68 μmol/L，其降低Melan-A 細(xì)胞黑色素含量的 IC50值為 75.78 μmol/L。Ding等［33］對牡丹根皮提取物(Ps-1到 Ps-8)的抗氧化性能和抗黑色素生成進(jìn)行評價，其中Ps-8的清除自由基能力、鏊合離子能力、還原能力以及抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)較強(qiáng)，可能是因為含有豐富的黃酮類和酚類;提取物Ps-1，尤其是提取物Ps-6大大抑制了B16細(xì)胞酪氨酸酶和多巴氧化酶的活性，并且通過減少黑素皮質(zhì)受體-1(MC1R)、眼球相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)、酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1(TRP-1)的表達(dá)來減少B16細(xì)胞中黑色素的含量。Li等［34］在銀合歡中發(fā)現(xiàn)抗氧化劑羽扇豆醇和酪氨酸酶抑制劑脫鎂葉綠酸a甲酯，二者均顯示出清除DPPH·的有效活性(維生素C為對照)以及蘑菇酪氨酸酶的抑制作用(曲酸為對照)。Zheng等［35］在小葉桑的根中發(fā)現(xiàn)包括austraone A在內(nèi)的22種新化合物，并通過質(zhì)譜和核磁共振譜確定其結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在酪氨酸酶活性抑制的測試中，其中氧化白藜蘆醇、桑白皮素D、桑根酮T以及桑酮O的酪氨酸酶抑制作用比曲酸強(qiáng)。Chen等［36］的結(jié)果表明，紅花黃色素以劑量依賴性方式抑制蘑菇酪氨酸酶活性，其 IC50值約為(1.01 ±0.03)mg/mL;動力學(xué)研究顯示為競爭性抑制模式，KI為0.607 mg/mL;細(xì)胞活力分析表明，1.0～4.0 mg/mL的紅花黃色素質(zhì)量濃度對B16F10黑色素瘤細(xì)胞并無細(xì)胞毒性作用，使用4.0 mg/mL的紅花黃色素可使B16F10黑色素瘤細(xì)胞的黑素產(chǎn)生降至(82.3±0.4)%。

3.3 環(huán)境保護(hù)方面

酪氨酸酶能夠催化氧化單酚化合物，Wada等［37］研究表明，其清除水溶液中取代苯酚的速率依次為鄰苯二酚、對甲苯酚、對氯苯酚、苯酚和對甲氧基苯酚。酪氨酸酶不僅能除去酚類物質(zhì)，還能去除有機(jī)胺等多種有機(jī)物，最終形成沉淀而易被處理。因此，可以利用微生物中的酪氨酸酶，用于工廠、醫(yī)院等環(huán)境工程領(lǐng)域中來以降解處理酚類及胺類廢水［38］。

隨著處理工藝的不斷摸索，其反應(yīng)條件逐漸得到優(yōu)化。Ikehata等［39］觀察到蘑菇酪氨酸酶去除廢水中酚類化合物最大催化活性的pH為7，超過最佳活性50%的pH范圍為5～8。酪氨酸酶在高溫和酸性條件下不穩(wěn)定，以L-酪氨酸為底物，在pH為7的條件下熱鈍化酪氨酸酶的活化能為1.85 kJ/mol。Yamada等［40］發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶與殼聚糖組合去除人工廢水中酚類化合物的效果較好。酪氨酸酶催化氧化苯酚化合物成為醌的衍生物，隨后化學(xué)吸附到殼聚糖膜上。對甲基苯酚而言，決定醌吸附的最佳條件是pH為7，溫度為45℃。某些烷基取代酚，比如對甲基苯酚、對乙基苯酚、對丙基苯酚、對丁基苯酚和對氯苯酚的去除率可達(dá)93%。另外，Palma等［41］開發(fā)了1種在攪拌容器中使用純酪氨酸酶的新型經(jīng)濟(jì)酶法工藝處理酚類污染物，確定了最佳反應(yīng)條件(溫度45 ℃、pH 6.6、轉(zhuǎn)速400 r/min、初始苯酚質(zhì)量濃度0.000 1 mol/L和酶質(zhì)量濃度50 U/mL)下酪氨酸酶的氧化效率為88.1%，初始氧化速率為10.2 mg/(L·min)，以及達(dá)到反應(yīng)終點所需時間為40 min。

固定化技術(shù)的普及，使得固定化材料具有廣大的發(fā)展空間。將酪氨酸酶固定化到疏水基團(tuán)修飾的瓊脂珠上，蛋白吸附率和酶活力回收分別達(dá)到了90%和80%［42］;而通過酶中的氨基基團(tuán)固定于陽離子交換樹脂的酪氨酸酶可重復(fù)使用，2 h后苯酚完全移除并且重復(fù)使用10次之后其活性幾乎沒有減弱［37］;固定于改性的鋁硅酸鈉(NaA)和鋁硅酸鈣(CaA)的酪氨酸酶也可使用多次且活性沒有絲毫下降［43］。邵健等［44］將酪氨酸酶固定于海藻酸鈉/二氧化硅(ALG/SiO2)凝膠復(fù)合物中，發(fā)現(xiàn)pH為7.0時，固定化酪氨酸酶的比酶活為1 120 U/g，25℃時以鄰苯二酚為底物的Km為10.6 mmol/L。相對于游離酶和海藻酸鈉固定化酶，該雜化凝膠固定酪氨酸酶具有良好的熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性及連續(xù)使用性。Bayramoglu等［45］使用天然生物礦化硅藻開發(fā)了1個新型酪氨酸酶固定化系統(tǒng)，使得有望替代傳統(tǒng)合成的高分子材料。Xu等［46］采用實用又經(jīng)濟(jì)的交聯(lián)法，又稱無載體固定化法，獲得交聯(lián)酪氨酸酶聚集體作為催化劑，有效治理污水中的酚類化合物。同時，納米材料與多酚氧化酶形成的復(fù)合物可有效減少傳統(tǒng)酶處理污水的缺點［47］。

3.4 生物檢測方面

生物傳感器作為生物檢測的1種新興技術(shù)，是將酶、DNA、抗體、細(xì)胞等作為分子識別物質(zhì)固定在傳導(dǎo)器上，將化學(xué)變化、熱變化等轉(zhuǎn)變成電信號的分析器件，具有靈敏、專一、微量、快速和準(zhǔn)確等特點，被廣泛應(yīng)用于空間生命科學(xué)、食品工業(yè)、環(huán)境工程、發(fā)酵工程以及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域［48］。柳亞玲［49］探討了非導(dǎo)電聚合物固定的酪氨酸酶生物傳感器檢測滅菌磷、甲基氯吡硫磷、二嗪磷和碘硫磷4種有機(jī)磷農(nóng)藥的效果;Wu等［50］利用納米級石墨烯為基本成分的酪氨酸酶生物傳感器快速檢測到雙酚A;Yang等［51］研制了1種基于殼聚糖-碳包覆鎳復(fù)合膜的新型酪氨酸酶生物傳感器，用于檢測兒茶酚，具有快速、可重復(fù)使用以及穩(wěn)定性好的特點;Jiang等［52］基于層層組裝技術(shù)，創(chuàng)建了固定化毛細(xì)管酪氨酸酶反應(yīng)器，用于篩選酪氨酸酶抑制劑，并經(jīng)19種天然中藥提取物進(jìn)行篩選驗證，發(fā)現(xiàn)固定酶能夠承受連續(xù)25次檢測，而僅失去12%的活性;Sigolaeva等［53］也通過層層組裝技術(shù)，利用聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDDA)/酪氨酸酶/戊二醛石墨基質(zhì)生物傳感器測定血液中羧酸酯酶和神經(jīng)病變靶酯酶的活性，表現(xiàn)出了良好的再現(xiàn)性;Singh等［54］提出了1種利用表面等離子體激元共振(SPR)建立的光纖生物傳感器，用于檢測水溶液中的酚醛化合物。通過熱蒸發(fā)技術(shù)將銀膜沉積在光纖芯上以制備傳感探頭，而后使用凝膠誘捕技術(shù)固定酪氨酸酶。

4 展望

酪氨酸酶具有操作條件溫和、反應(yīng)專一、可重復(fù)使用等特點，被廣泛用于食品、美容、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域。由于酪氨酸酶在生物體內(nèi)含量低，目前由植物來制備酪氨酸的研究未見詳細(xì)報道，實驗室用作制備酪氨酸酶的原料較為單一(蘑菇、馬鈴薯、蘋果)。針對進(jìn)口純酶價格昂貴且需求量大的問題，今后的主要研究任務(wù)是提高國內(nèi)生產(chǎn)酪氨酸酶的能力，擴(kuò)展該酶來源物種種類。同時，應(yīng)用基因重組等生物學(xué)技術(shù)制備優(yōu)質(zhì)高效表達(dá)酪氨酸酶基因的工程菌是其制備技術(shù)的發(fā)展方向，有望提高酪氨酸酶的產(chǎn)量。

作為國內(nèi)外皮膚美白產(chǎn)品的重點研究對象，以天然產(chǎn)物為來源的酪氨酸酶抑制劑，具有廣闊的應(yīng)用前景，對其增效減毒、美白機(jī)制等的研究也將是重點方向。另外，隨著對酪氨酸酶性質(zhì)和功能的深入了解，以固定化技術(shù)為代表的酶工程技術(shù)的應(yīng)用，已經(jīng)成為開發(fā)新型材料的研究熱點之一。隨著化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多學(xué)科及相關(guān)多技術(shù)的不斷發(fā)展、交叉和融合，將有利于拓展酪氨酸酶的研究和應(yīng)用。

［1］ Sánchez F á，Neptuno R L J，García C F，et al.Tyrosinase:a comprehensive review ofitsmechanism［J］.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology，1995，1247(1):1-11.

［2］ Durán N，Rosa M A，D'Annibale A，et al.Applications of laccases and tyrosinases(phenoloxidases)immobilized on different supports:a review［J］.Enzyme and Microbial Technology，2002，31(7):907-931.

［3］ Fenoll L G，Rodr?'guez L J N，Garc?'a S F，et al.Analysis and interpretation of the action mechanism of mushroom tyrosinase on monophenols and diphenols generating highly unstable o-quinones［J］.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology，2001，1548(1):1-22.

［4］ 李溯，丁勁松.黑色素生物合成與酪氨酸酶抑制劑的研究進(jìn)展［J］.中南藥學(xué)，2013，11(4):278-282.

［5］ 官興麗，羅理勇，曾亮.天然產(chǎn)物的美白作用及其機(jī)理研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(5):432-435，439.

［6］ Yao J，Liu Y，Wang T Z，et al.Microcalorimetic study on tyrosinase oxidation catalyzed by tyrosinase［J］. Chinese Chemical Letters，2003，14(6):619-622.

［7］ 王寧芳.酪氨酸酶的提取及其催化活性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(20):9315-9316.

［8］ 魯衛(wèi)斌，王樹根，范雪榮，等.馬鈴薯酪氨酸酶的制備及其對羊毛的改性［J］.紡織學(xué)報，2009，30(7):69-72.

［9］ 樊倩，韋慶益，袁爾東，等.植物中酪氨酸酶的篩選及不同抑制劑對其活性的影響［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(10):91-93.

［10］ Faridi M，Sariri R，Jafarian V，et al.Extraction and charaterization of tyrosinase from peanut grown in north of Iran［J］.Iranian Journal of Plant Biology，2010，2(1):49-62.

［11］ Dolashki A，Voelter W，Gushterova A，et al.Isolation and characterization of novel tyrosinase from Laceyella sacchari［J］.Protein and Peptide Letters，2012，19(5):538-543.

［12］ 王戈林，寧華，沈萍，等.酪氨酸酶基因工程菌產(chǎn)黑色素的發(fā)酵條件研究［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1999，30(4):150-154.

［13］ 何偉，阮麗芳，孫明，等.蘇云金芽孢桿菌酪氨酸酶基因的克隆表達(dá)及應(yīng)用初探［J］.微生物學(xué)報，2004，44(6):824-826.

［14］ Ren Q，Henes B，F(xiàn)airhead M，et al.High level production of tyrosinase in recombinant Escherichia coli［J］.BioMed Central Biotechnology，2013，13(1):18.

［15］ 屈佳玉.微生物固定化技術(shù)及其在污水處理領(lǐng)域的研究進(jìn)展［J］.工業(yè)水處理，2010，30(10):14-16.

［16］ Müller G H，Lang A，Seithel D R，et al.An enzyme-initiated hydroxylation-oxidation carbo Diels-Alder domino reaction［J］.Chemistry-A European Journal，1998，4(12):2513-2522.

［17］ 徐迪，龐朝樂，郭新東，等.酪氨酸酶催化對位取代苯酚和芳香胺的反應(yīng)及其意義［J］.有機(jī)化學(xué)，2003，23(7):724-727.

［18］ 徐迪，黃成紅，郭新東，等.無溶劑體系酪氨酸酶催化對位苯酚類化合物與芳香胺的反應(yīng)研究［J］.分子催化，2004，18(1):10-14.

［19］ Casella L，Granata A，Monzani E，et al.New aspects of the reactivity of tyrosinase［J］.Micron，2004，35(1/2):141-142.

［20］ Stratford M R L，Riley P A，Ramsden C A.Rapid halogen substitution and dibenzodioxin formation during tyrosinasecatalyzed oxidation of 4-halocatechols［J］.Chemical Research in Toxicology，2011，24(3):350-356.

［21］ Brooks S J，Nikodinovic J，Martin L，et al.Production of a chiral alcohol，1-(3，4-dihydroxyphenyl)ethanol， by mushroom tyrosinase［J］，Biotechnology Letters，2013，35(5):779-783.

［22］ 陳景華，王興焱，王雪，等.當(dāng)歸提取物對黑素瘤細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)模型黑素合成的影響［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18(17):205-208.

［23］ 樸香蘭，楊靜，樓彩霞，等.連翹對酪氨酸酶的抑制活性［J］.中央民族大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2012，21(4):19-22.

［24］ 唐建陽，蘇明星，劉鳳嬌，等.砂仁提取物對蘑菇酪氨酸酶活力的抑制效應(yīng)［J］.廈門大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2012，51(2):258-262.

［25］ 穆燕，魏海柳，李琳，等.白附子酪氨酸酶活性抑制成分的提取與分離［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(11):247-249.

［26］ 孫培冬，王小洪.二氫楊梅素對酪氨酸酶抑制作用研究［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2013，25(6):871-874.

［27］ 沈曉佳，趙黎明，周家春，等.紫娟茶提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(24):75-80.

［28］ 嚴(yán)航，唐婷，干麗，等.薏苡仁提取物對酪氨酸酶抑制作用［J］.中成藥，2013，35(4):696-699.

［29］ 李紅艷，劉艷杰，王倩，等.紅花中酪氨酸酶抑制成分的快速篩選和分析［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2013，28(2):170-174.

［30］ Dung N T，Bajpai V K，Rahman A，et al.Phenolic contents，antioxidantand tyrosinase inhibitory activities ofLonicera Japonica Thumb［J］.Journal of Food Biochemistry，2011，35(1):148-160.

［31］ Zhang L，Ding Z Y，Xu P，et al.Methyl lucidenate F isolated from the ethanol-soluble-acidic components of Ganoderma lucidum is a noveltyrosinase inhibitor［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2011，16:457-461.

［32］ Kim J H，Lee E S，Lee C H.Melanin biosynthesis inhibitory effects of claycosin-7-O-β-D-glucoside isolated from Astragalus(Astragalus membranaceus)［J］. Food Science and Biotechnology，2011，20(6):1481-1485.

［33］ Ding H Y，Chou T H，Lin R J，et al.Antioxidant and antimelanogenic behaviors of Paeonia suffruticosa［J］.Plant Foods for Human Nutrition，2011，66:275-284.

［34］ Li H T，Ruan S W，Huang J C，et al.Antioxidant and tyrosinase inhibitor from Leucaena leucocephala［J］.African Journal of Biotechnology，2012，11(77):14182-14185.

［35］ Zheng Z P，TanH Y，WangM F.Tyrosinaseinhibition constituents from the roots of Morus australis［J］.Fitoterapia，2012，83:1008-1013.

［36］ Chen Y S，Lee S M，Lin C C，et al.Kinetic study on the tyrosinase and melanin formation inhibitory activities of carthamus yellow isolated from Carthamus tinctorius L.［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2013，115(3):242-245.

［37］ Wada S，Ichikawa H，Tatsumi K.Removal of phenols from wastewater by soluble and immobilized tyrosinase［J］.Biotechnology and Bioengineering，1993，42(7):854-858.

［38］ 段穗芳，萬學(xué)勤.酪氨酸酶的固定化技術(shù)在醫(yī)院污水處理中的應(yīng)用［J］.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2010，10(4):513-514.

［39］ Ikehata K，Nicell J A.Characterization of tyrosinase for the treatment of aqueous phenols［J］.Bioresource Technology，2000，74(3):191-199.

［40］ Yamada K，Akiba Y，Shibuya T，et al.Water purification through bioconversion of phenol compounds by tyrosinase and chemical adsorption by chitosan beads［J］.Biotechnology Progress，2005，21(3):823-829.

［41］ Palma M S A，Horn H，Zilli M，et al.A new enzymatic process for the treatment of phenolic pollutants［J］.Brazilian Archives of Biology and Technology，2013，56(4):653-662.

［42］ 安林坤，馬林，全軍民，等.固定化酪氨酸酶去除水中酚及胺類物質(zhì)的研究［J］.中山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2000，39(5):1-5.

［43］ Seetharam G B，Saville B A.Degradation of phenol using tyrosinase immobilized on siliceous supports［J］.Water Research，2003，37(2):436-440.

［44］ 邵健，王亞玲，季美娟.ALG/SiO2雜化凝膠固定酪氨酸酶處理含酚廢水［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2007，19(10):1169-1172.

［45］ Bayramoglu G，Akbulut A，Yakup A M.Immobilization of tyrosinase on modified diatom biosilica:enzymatic removal of phenoliccompoundsfrom aqueoussolution［J］.Journalof Hazardous Materials，2013(244/255):528-536.

［46］ Xu D Y，Yang Z.Cross-linked tyrosinase aggregates for elimination ofphenolic compoundsfrom wastewater［J］.Chemosphere，2013，92(4):391-398.

［47］ Mukherjee S，Basak B，Bhunia B，et al.Potential use of polyphenol oxidases(PPO)in the bioremediation of phenolic contaminants containing industrial wastewater［J］.Reviews in Environmental Science and Biotechnology，2013，12(1):61-73.

［48］ 郭小群.生物傳感器應(yīng)用與發(fā)展［J］.廣東化工，2012，39(12):9-10.

［49］ 柳亞玲.酪氨酸酶生物傳感器的研制及其應(yīng)用于有機(jī)磷類農(nóng)藥的檢測［D］.廣州:廣東工業(yè)大學(xué)，2012.

［50］ Wu L D，Deng D H，Jin J，et al.Nanographene-based tyrosinase biosensor for rapid detection of bisphenol A［J］.Biosensors and Bioelectronics，2012，35(1):193-199.

［51］ Yang L J，Xiong H Y，Zhang X H，et al.A novel tyrosinase biosensor based on chitosan-carbon-coated nickel nanocomposite film［J］.Bioelectrochemistry，2012，84:44-48.

［52］ Jiang T F，Liang T T，Wang Y H，et al.Immobilized capillary tyrosinase microreactor for inhibitor screening in natural extracts by capillary electrophoresis［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2013，84:36-40.

［53］ Sigolaeva L V，Dubacheva G V，Porus M V，et al.A layer-by-layer tyrosinase biosensor for assay of carboxylesterase and neuropathy target esterase activities in blood［J］.Analytical Methods，2013，5(16):3872-3879.

［54］ Singh S，Mishra S K，Gupta B D.SPR based fibre optic biosensor for phenolic compounds using immobilization of tyrosinase in polyacrylamide gel［J］.Sensors and Actuators B:Chemical，2013，186:388-395.