姚 遠，董慶利，葉 維，胡孟晗

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是導(dǎo)致肉類腐敗的優(yōu)勢菌之一［1］，同時又是條件致病菌，常引起皮膚黏膜的感染，如角膜潰瘍、外耳道炎，感染傷口形成綠色膿液等［2］。因此，研究天然防腐劑對銅綠假單胞菌的抑制作用在肉類保鮮上具有現(xiàn)實意義。

乳酸鈉、茶多酚和殼聚糖是當(dāng)前研究較多的天然食品防腐劑。熊成等［3］研究了乳酸鈉對銅綠假單胞菌的特定抑制作用。姚遠等［4］從乳酸鈉影響細胞膜的功能結(jié)構(gòu)完整性和胞內(nèi)ATP合成兩方面研究了乳酸鈉抑制銅綠假單胞菌生長的機制。孫京新等［5］以假單胞菌為研究對象，結(jié)果顯示茶多酚對假單胞菌有很強的抑菌作用。Yan等［6］研究了殼聚糖對金黃色葡萄球菌和假單胞菌細胞膜滲透性的影響，研究表明殼聚糖能增加金黃色葡萄球菌和假單胞菌細胞膜的滲透性，從而殺死細菌。

根據(jù)柵欄技術(shù)的原理［7］，將不同種類的防腐劑綜合運用，發(fā)揮其協(xié)同效應(yīng)，不僅可以增強其抑菌效果，而且可以降低單一防腐劑的使用量，從而減少其對食品品質(zhì)的影響，提高其應(yīng)用的安全性。如楊勝平等［8］將1.0%殼聚糖與0.4%茶多酚對帶魚進行復(fù)配涂膜保鮮，顯著延長了帶魚的保鮮期。徐世明等［9］運用響應(yīng)面法復(fù)配出Nisin、乳酸鈉和山梨酸鉀最優(yōu)組合，顯著延長了燒雞貨架期。Yu［10］利用響應(yīng)面法對Nisin、茶多酚和殼聚糖進行復(fù)配組合，應(yīng)用于冷卻羊肉中，研究其交互作用，確定復(fù)合保鮮劑最佳配比。

基于筆者所在課題組前期對乳酸鈉抑菌效果的研究［3－4］，其是否與茶多酚和殼聚糖復(fù)配后對銅綠假單胞菌具有協(xié)同抑制效果有待明確，本試驗通過常量肉湯稀釋法和瓊脂擴散法測定乳酸鈉、茶多酚和殼聚糖在培養(yǎng)基中對銅綠假單胞菌的抑制效果，并進行協(xié)同抑菌實驗，確定3種防腐劑抑制銅綠假單胞菌的最優(yōu)配比，為實際食品中防腐劑優(yōu)選提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑與設(shè)備

1.1.1 菌株來源及菌懸液制備

銅綠假單胞菌分離自市售冷鮮豬肉中，實驗時進行平板劃線，在27℃下活化3次，選擇性培養(yǎng)基的配制參照文獻［11］。取一環(huán)菌苔接種于300 mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～18 h使菌密度達到8lg(個/mL)，經(jīng)無菌生理鹽水分別稀釋制得5lg(個/mL)和4lg(個/mL)的菌懸液備用［12］。

1.1.2 主要試劑

茶多酚(純度≥98%)，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;殼聚糖(脫乙酰度92.2%)、乳酸鈉(純度53.4%)，上海國藥化學(xué)集團有限公司。

1.1.3 設(shè)備

YXQ-LS-SⅡ型全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);SW-CJ-2FD型無菌操作臺(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);HWS-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海比朗儀器有限公司);PHS-25型pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的測定

MIC被定義為在特定環(huán)境下孵育24 h，可抑制銅綠假單胞菌分別出現(xiàn)明顯增長的最低乳酸鈉、殼聚糖和茶多酚的濃度［13］。利用二倍稀釋法配制成不同濃度的防腐劑溶液，在每管內(nèi)加入前述5lg(個/mL)菌懸液各1 mL、37℃培養(yǎng)24 h，通過肉眼觀察無細菌生長的防腐劑濃度，即為此種防腐劑的MIC。

1.2.2 單一防腐劑對銅綠假單胞菌的抑制作用

利用瓊脂擴散法測定乳酸鈉、茶多酚、殼聚糖的抗菌活力［14］。移取前述4lg(個/mL)的銅綠假單胞菌懸液100 μL均勻涂布在培養(yǎng)基上，應(yīng)用二倍稀釋法稀釋3種防腐劑溶液(乳酸鈉0.5～250 mg/mL、茶多酚 0.10～50 mg/mL、殼聚糖0.013～6.25 mg/mL)，并分別移取200 μL的防腐劑置于瓊脂平板上的牛津杯中(不銹鋼柱體:外徑(7.8±0.1)mm、內(nèi)徑(6.0±0.1)mm、高 10.00 mm)。37℃培養(yǎng)24 h后用游標卡尺測量各抑菌圈的大小(直徑mm)。

1.2.3 復(fù)合防腐劑配比的確定

采用 Design-Expert 8.0.5b軟件中的 Box-Behnken試驗設(shè)計(表1)，根據(jù)1.2.2的測定結(jié)果確定防腐劑濃度，對防腐劑的抑菌效果進行響應(yīng)面優(yōu)化，考察乳酸鈉、茶多酚和殼聚糖的復(fù)合防腐效果。應(yīng)用逐步回歸方法(引入水平為0.05，去除水平為0.10)建立抑菌圈對因素乳酸鈉、茶多酚和殼聚糖的響應(yīng)曲面模型。

1.2.4 響應(yīng)曲面法(response surface methodology，RSM)線性回歸方程的驗證

獲得顯著的多元回歸方程后，在設(shè)定的實驗條件范圍內(nèi)(乳酸鈉 31.7～62.5 mg/mL、茶多酚6.25～12.5 mg/mL、殼聚糖1.58～3.17 mg/mL)設(shè)置10組隨機數(shù)據(jù)組合，再隨機選取5組數(shù)據(jù)進行組合，按上述方法代入線性回歸方程，計算抑菌圈。

表1 Box-Behnken試驗分析因素與水平設(shè)計表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸鈉、茶多酚和殼聚糖最小抑菌濃度的確定

通過實驗發(fā)現(xiàn):3種防腐劑的最小抑菌濃度(MIC)分別為茶多酚 0.79 mg/mL，乳酸鈉4.00 mg/mL和殼聚糖0.40 mg/mL。本文的茶多酚MIC略高于劉書亮等［15］的研究結(jié)果，其原因可能是茶多酚的純度，抑菌方法、培養(yǎng)基等不同所致。殼聚糖MIC與劉書亮等［15］報道也有所差異，其原因除試驗方法不同外，還可能與殼聚糖的脫乙酰度、相對分子質(zhì)量大小等有關(guān)［16］。

2.2 乳酸鈉、茶多酚和殼聚糖對銅綠假單胞菌的抑制作用

比較3種防腐劑的抑菌效果，結(jié)果見圖1。由圖1可知:乳酸鈉的抑菌效果最明顯，茶多酚次之，殼聚糖最差。而3種抑菌劑隨著濃度的增加，抑菌效果均明顯增強，其中以乳酸鈉最為明顯。因此，選擇乳酸鈉的質(zhì)量濃度為31.70、47.10和62.50 mg/mL，茶多酚的質(zhì)量濃度為6.25、9.38和12.50 mg/mL，殼聚糖的質(zhì)量濃度為1.58、2.38和3.17 mg/mL，進行響應(yīng)面實驗(表1)。

2.3 3種抑菌劑在培養(yǎng)基中復(fù)合使用的抑菌效果

乳酸鈉是一種弱有機酸，其非解離成分在保鮮中起主要作用，低pH有利于NaL解離平衡向乳酸分子形成方向移動，提高乳酸分子濃度，從而影響細菌生長［17］。筆者將乳酸鈉溶液的pH調(diào)至4.0左右，一方面在3種防腐劑復(fù)配后不會較大程度的改變pH，同時也會增強乳酸鈉的抑菌效果。茶多酚和殼聚糖是當(dāng)前研究較多的天然食品防腐劑，采用響應(yīng)面法(Box-Behnken的中心組合設(shè)計)，研究乳酸鈉和茶多酚、殼聚糖復(fù)配后對銅綠假單胞菌的抑制效果，并對三者的最佳配比組合進行優(yōu)化，響應(yīng)曲面試驗結(jié)果見表2。

圖1 乳酸鈉、茶多酚和殼聚糖對在培養(yǎng)基中銅綠假單胞菌的抑菌效果Fig.1 Effects of sodium lactate，tea polyphenols，and chitosan on the autibacterial activities of P.aeruginosa in culture medium

建立抑菌圈(Y)對A、B、C的響應(yīng)曲面模型，見式(1)。

對構(gòu)建的模型方差分析表明，所得的Y回歸方程高度顯著(P=0.0002)，且失擬檢驗不顯著(P=0.15)。從模型方差分析結(jié)果(表3)可以看出乳酸鈉對抑菌圈的影響，A的一次項效應(yīng)、二次項效應(yīng)以及與B和C交互效應(yīng)顯著;B只有和A的交互效應(yīng)對抑菌圈大小影響顯著;C的一次項以及和A的交互項對抑菌圈影響顯著。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

乳酸鈉分別與茶多酚和殼聚糖對抑菌圈影響結(jié)果見圖2。由圖2可知:等高線曲率比較小，形狀近似橢圓，說明乳酸鈉和茶多酚、殼聚糖的相交影響顯著。當(dāng)乳酸鈉含量趨近62.50 mg/mL時，隨著茶多酚含量的增加，抑菌圈逐漸減小，說明乳酸鈉和茶多酚之間存在明顯的拮抗作用;當(dāng)乳酸鈉含量趨近62.50 mg/mL時，隨著殼聚糖含量的增加，抑菌圈逐漸增大，說明乳酸鈉和殼聚糖之間存在明顯的協(xié)同作用;國內(nèi)外對乳酸鈉和茶多酚、殼聚糖之間的交互作用研究較少，本實驗得出，當(dāng)乳酸鈉達到一定濃度，茶多酚和乳酸鈉之間存在明顯的拮抗作用，姚遠等［4］研究了乳酸鈉抑制銅綠假單胞菌生長的機制，認為一定濃度的乳酸鈉會影響銅綠假單胞菌細胞膜(壁)結(jié)構(gòu)完整性和胞內(nèi)ATP的合成，從而抑制銅綠假單胞菌的生長;Yi等［18］認為用茶多酚處理銅綠假單胞菌過后，菌的細胞膜滲透性會增加，從而釋放一些小分子物質(zhì)來瓦解細胞。當(dāng)二者共同作用于銅綠假單胞菌時，可能存在競爭現(xiàn)象，從而導(dǎo)致二種防腐劑共同作用時會產(chǎn)生拮抗作用。茶多酚和殼聚糖之間交互作用不顯著，與Yu等［10］研究的一致。

表3 RSM模型系數(shù)顯著性檢驗表Table 3 Significance test of RSM model

圖2 乳酸鈉+茶多酚及乳酸鈉+殼聚糖對抑菌圈影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface for inhibition zones of sodium lactate+tea polyphends and sodium lactate+chitosan

由以上分析可得，在實際應(yīng)用中，應(yīng)使乳酸鈉和殼聚糖的濃度保持在最高濃度，即乳酸鈉取62.50 mg/mL，殼聚糖取3.17 mg/mL，抑菌圈達到最大，抑菌效果最好。

2.4 RSM線性回歸方程的驗證

應(yīng)用建立的RSM線性回歸預(yù)測方程分別對建模的10組處理(表4)和驗證的5組處理(表5)進行驗證，結(jié)果顯示，此線性回歸預(yù)測方程可靠性較高，能夠較好的預(yù)測在本實驗條件下不同濃度的乳酸鈉、茶多酚、殼聚糖復(fù)配后對銅綠假單胞菌抑制效果，證明該模型預(yù)測值與實測值吻合較好［19］。

表4 不同濃度的乳酸鈉、茶多酚和殼聚糖復(fù)配對銅綠假單胞菌抑菌圈的觀測值和預(yù)測值Table 4 Observed and predicted inhibition zones toward P.aeruginosa by RSM on different concentrations of combined sodium lactate，tea polyphenols and chitosan

表5 乳酸鈉、茶多酚和殼聚糖復(fù)配用于驗證對銅綠假單胞菌抑菌圈的觀測值和預(yù)測值Table 5 Observed and predicted inhibition zones toward P.aeruginosa by RSM for validation on different concentrations of combined sodium lactate，tea polyphenols and chitosan

當(dāng)茶多酚不添加時，乳酸鈉和殼聚糖取最大濃度時，預(yù)測結(jié)果和實際結(jié)果相差較大，可能是因為實驗中測量誤差較大。

3 結(jié)論

從建立的RSM的預(yù)測模型來看，乳酸鈉對銅綠假單胞菌的抑制效果最好，其次是殼聚糖和茶多酚，將3種防腐劑復(fù)配后，當(dāng)乳酸鈉達到62.50 mg/mL時，乳酸鈉和茶多酚之間存在明顯的拮抗作用，乳酸鈉和殼聚糖之間存在明顯的協(xié)同作用，當(dāng)乳酸鈉為62.50 mg/mL，殼聚糖為3.17 mg/mL，茶多酚不添加時，復(fù)合保鮮劑的抑菌效果最好，并且驗證實驗中模型預(yù)測值與實測值吻合較好。

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