劉長根，徐 飛，賈紅華，周 華，韋 萍

(南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，南京 211800)

苯甲醛是一種重要的化工原料，廣泛地應用于醫(yī)藥、農藥、香料及染料等行業(yè)。生產苯甲醛的傳統(tǒng)生產方法是采用芐叉二氯水解法［1］和甲苯氧化法［2］。其中，芐叉二氯水解法存在工藝流程長、產物分離困難、產品中含氯元素且排放出腐蝕性氣體等不足，污染環(huán)境嚴重;甲苯氧化法是利用金屬催化劑直接選擇性氧化制備苯甲醛，雖然工藝過程簡單，但產物產率較低。

漆酶在氧化反應中的應用研究較多，但主要偏重研究酚類、胺類和木質素類等［3-6］化合物的氧化，目前對醇類化合物的氧化研究較少，而且主要側重于對氧化反應機制的研究［7-11］，專門針對苯甲醇的氧化研究偏少，尤其是對反應底物濃度(一般底物反應濃度為20 mmol/L，偏低)、氫受體種類及反應溶劑等反應工藝參數優(yōu)化的研究更未見報道。

為此，筆者以自制的高活性漆酶為催化劑，研究苯甲醇催化氧化制備苯甲醛，通過氧化反應條件的優(yōu)化研究，為苯甲醛的高效綠色合成奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

苯甲醇(分析純)，上海凌峰化學試劑有限公司;2，2-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)(98%)，東京化成工業(yè)株式會社;2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)(98%)，阿拉丁公司;無水1-羥基-苯并-三氮唑(HBT)(98%)，上海晶純試劑有限公司;紫脲酸(VLA)(97%)，F(xiàn)luka公司;其他試劑均為市售分析純。

1.1.2 主要儀器

SP-6890型氣相色譜儀(山東魯南瑞虹化工儀器有限公司)，HTZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩器(太倉市實驗設備廠)，PHS-3C型pH計(上海雷磁儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 漆酶的發(fā)酵及提取方法

以筆者所在實驗室篩選的白腐菌Coriolus versicolor ZHH為菌種，經搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后得到含酶發(fā)酵液，離心去除菌體等固形物，加入(NH4)2SO4、離心獲得沉淀，經冷凍干燥獲得漆酶干粉，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 苯甲醇氧化反應方法

初始氧化反應條件:在25 mL的反應瓶中加入20 mmol/L苯甲醇溶液和40 U/mL漆酶，總反應體積為10 mL，30℃、通O20.5 h后密閉振蕩反應24 h;反應結束后取樣測定底物和產物濃度，計算反應轉化率。

1.2.3 漆酶酶活的測定方法

以ABTS為底物，在420 nm條件下測定漆酶酶活，具體方法參照文獻［12-13］。

1.2.4 底物與產物的檢測方法

反應結束后轉化液用二氯甲烷萃取3次，去除水相，含底物和產物的有機相直接利用氣相色譜測定濃度。色譜柱為安捷倫DB-225毛細管色譜柱(30 m×0.32 mm ×0.25 um)，具體分析方法參照文獻［14］。

2 結果與討論

2.1 介質體系對苯甲醇氧化反應的影響

2.1.1 介質體系的選擇

漆酶的氧化還原電勢較低，苯甲醇結構較穩(wěn)定，必須借助電子傳遞介質能夠完成反應。故在初始反應條件下，考察不同電子傳遞介質ABTS、HBT、VLA和TEMPO(10 mmol/L)對苯甲醇氧化反應的影響，結果見圖1。

圖1 介質體系對苯甲醛產率的影響ig.1 Effects of medium system of on yield of benzaldehyde

從圖1可看出，介質TEMPO的加入對漆酶催化苯甲醇制備苯甲醛氧化反應的效率最高(58%)，故以下實驗均加入TEMPO作為氧化反應介質體系。

2.1.2 TEMPO的用量對苯甲醛產率的影響

考察TEMPO的用量對苯甲醛產率的影響，結果見圖2。由圖2可知:當TEMPO與苯甲醇的質量摩爾比為1∶4時，苯甲醛的產率最高，達到71%。

圖2 TEMPO與苯甲醇的摩爾濃度比對苯甲醛產率的影響Fig.2 Effects of TEMPO and benzene methanol molar concentration ratio on yield of benzaldehyde

2.2 底物濃度對氧化反應的影響

目前，漆酶氧化醇類化合物的研究中底物濃度一般選擇為20 mmol/L，較低的底物及產物濃度必將給工藝放大與應用帶來諸多麻煩，因此提高底物的反應濃度對于苯甲醛的酶法制備具有積極意義。在反應體系中考察不同底物濃度(20、40、60、80和100 mmol/L)，加入40 U/mL漆酶和上述濃度的TEMPO，30 ℃、通O20.5 h密閉振蕩反應24 h，測定反應體系中苯甲醛的產率，結果見圖3。

圖3 苯甲醇濃度對苯甲醛產率的影響Fig.3 Effects of concentration of benzyl alcohol on yield of benzaldehyde

由圖3可知:隨著底物濃度的提高，氧化反應收率仍保持較高的水平，表明漆酶對高濃度底物有較好的耐受性，當底物苯甲醇的濃度為60 mmol/L，反應體系的苯甲醛產率最高，可達到76%。

2.3 漆酶用量對氧化反應的影響

為進一步提高氧化反應得率、降低漆酶用量，在上述優(yōu)化實驗基礎上，在反應體系中采用不同漆酶用量(10、40、60、80、100 和 150 U/mL)進行氧化反應，測定苯甲醛的產率，結果見圖4。

圖4 漆酶用量對苯甲醛產率的影響Fig.4 Effects of concentration of laccase on yield of benzaldehyde

由圖4可知:苯甲醛的產率并未隨著漆酶用量的增加而增加，當反應體系中加入80 U/mL的漆酶時，苯甲醛的產率達到80%。

2.4 氫受體對氧化反應的影響

氫受體能夠接受電子被還原，從而促進苯甲醇的氧化反應。在前面優(yōu)化條件基礎上，考察不同氫受體(丙酮、甲醛、戊二醛和乙醛)對苯甲醛產率的影響，結果見圖5。由圖5可知:丙酮作為氫受體效果最好。同時，考察不同丙酮濃度對苯甲醛產量的影響，結果見圖6。由圖6可知，當丙酮的加入量為60 mmol/L時，苯甲醛產率最高，達到89%。

圖5 氫受體對苯甲醛產率的影響Fig.5 Effects of hydrogen acceptor on yield of benzaldehyde

圖6 丙酮濃度對苯甲醛產率的影響Fig.6 Effects of acetone concentration on yield of benzaldehyde

2.5 助溶劑對氧化反應的影響

由于產物苯甲醛不溶于水，反應體系中加入少量有機溶劑可以促進苯甲醛向有機相的轉移，推動反應向產物方向進行，提高產物的轉化得率。在上述優(yōu)化實驗條件基礎上，考察不同有機溶劑(丁二酸二甲酯、環(huán)氧己烷、四氫呋喃、乙腈、乙酸乙酯和正丁酸，0.5 mol/L)對氧化反應的影響，結果見圖7。由圖7可知:助溶劑的加入對苯甲醛的收率提高沒有促進作用，結合下游產物分離成本，故反應中不考慮添加助溶劑。

2.6 通氧方式對反應的影響

O2是氧化反應的必要因素，由于O2在反應溶液中溶解度較低，故不同的供氧方式影響氧化反應的得率。在上述優(yōu)化實驗的基礎上，通O20.5 h后，再考察不同通氧方式(密封、敞開和連續(xù)通氧等)對氧化反應的影響，結果見圖8。

由圖8知:通O20.5 h后密閉反應時，苯甲醛的產率最高，達94%。敞開反應時，苯甲醛的產率最低。這可能是氧化反應需要一定量O2的參與，但過高的O2濃度對酶會產生中毒作用、導致反應率下降。

圖7 助溶劑對苯甲醛產率的影響Fig.7 Effects of different solvent system on yield of benzaldehyde

圖8 供氧方式對苯甲醛產率的影響Fig.8 Effect of oxygen supply mode on yield of benzaldehyde

同時考察反應時間對苯甲醛產率的影響，發(fā)現(xiàn)反應36 h苯甲醛的最高產率為98%(圖9)。

圖9 反應時間對苯甲醛產率的影響ig.9 Effects of reaction time of on yield of benzaldehyde

3 結論

以自制的高活性漆酶為催化劑，開展了漆酶催化苯甲醇制備苯甲醛的合成工藝優(yōu)化研究。經過優(yōu)化得到的最佳工藝條件為以80 U/mL的漆酶為催化劑，在檸檬酸/檸檬酸鈉反應體系中，以 TEPMO為介質體系(TEMPO與底物苯甲醇的最佳摩爾濃度比為1∶4)、60 mmol/L的丙酮為氫受體，60 mmol/L的苯甲醇在通O20.5 h后密閉反應36 h，最終苯甲醛的產率達98%，為酶法制備苯甲醛的工藝放大與應用奠定了良好基礎。

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