袁春偉，何艷春，張勝利，張震宇

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122)

羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)屬于手性分子，共有4種立體異構(gòu)體。本文中所涉及的L-羥脯氨酸為 反 式-4-羥 基-L-脯 氨 酸 (trans-4-hydroxy-L-proline)，以下均簡稱L-羥脯氨酸。L-羥脯氨酸的分布很廣，是膠原、明膠、植物細(xì)胞壁蛋白質(zhì)和微生物次生代謝產(chǎn)物的重要組成成分［1］。近些年來L-羥脯氨酸在食品、醫(yī)藥、化妝品方面發(fā)揮了不可替代的作用［2］，可以作為嬰幼兒食品［3］和一些非哺乳動物的飼料添加劑，還起到調(diào)節(jié)脂肪乳化［4］、抗腫瘤、抗高血壓［5］等作用，另外在化妝品方面也具有抗氧化、抗輻射的作用［6］。

L-羥脯氨酸是哺乳動物膠原的重要成分［7］，目前國內(nèi)生產(chǎn)L-羥脯氨酸的方法主要是利用水解法直接從膠原中提取。至于化學(xué)合成法，由于生產(chǎn)成本高昂，一般不被采用。水解法存在眾多負(fù)面作用［8］，例如:生產(chǎn)和純化的步驟較多導(dǎo)致最終產(chǎn)率很低、在生產(chǎn)過程中必須加入一些有毒害作用的溶劑或試劑(亞硝酸等)、有廢料產(chǎn)生等。微生物發(fā)酵法以脯氨酸(proline，Pro)為底物，運用流加葡萄糖的方法產(chǎn)L-羥脯氨酸，避免了這些負(fù)面影響，且對發(fā)酵底物的利用率高，過程無毒害，是一種替代傳統(tǒng)水解法的理想方法。本文中筆者擬利用自主構(gòu)建的組成型重組大腸桿菌BL21(pUC19-Hyp)為出發(fā)菌株，運用間歇流加、指數(shù)流加和恒速流加3種流加C源的方式進行補料分批培養(yǎng)，為其大規(guī)模培養(yǎng)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

大腸桿菌BL21(pUC19-Hyp)由筆者所在實驗室成員自主構(gòu)建，其中脯氨酸羥化酶基因［9］由多拷貝質(zhì)粒pUC19攜帶轉(zhuǎn)入宿主菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10、酵母提取物5、瓊脂20、NaCl 10;pH 7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10、甘油5、胰蛋白胨8、(NH4)2SO45、K2HPO41、NaCl 2。以下分開滅菌:MgSO40.2 g/L、FeSO43 mmol/L、CaCl20.015 g/L、脯氨酸400 mmol/L。

補料培養(yǎng)基Ⅰ:葡萄糖400 g/L。

補料培養(yǎng)基Ⅱ:質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%左右的氨水。

培養(yǎng)基在接種前加入0.05 g/L的氨芐青霉素(AMP)。

1.1.3 主要設(shè)備

BioFlo415 7 L發(fā)酵罐(NBS公司);SBA-40 C型生物傳感分析儀((山東省科學(xué)院生物研究所));L-8900型氨基酸分析儀(日產(chǎn)公司)。

1.2 培養(yǎng)方法

菌種活化:將冷藏于－80℃冰箱的菌種劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，用活化后的菌種制備斜面種子，保存待用。

種子制備:從斜面培養(yǎng)基挑取單菌落，接種至裝有30 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角搖瓶中，37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)8 h。

7 L發(fā)酵罐中補料分批培養(yǎng):將種子以6%的接種量接種于裝液量為4 L的7 L發(fā)酵罐中，溫度為35℃，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的氨水控制pH為6.5以上，通氣量為1～3 vvm(vvm表示每分鐘通氣量與罐體實際料液體積的比值)，攪拌轉(zhuǎn)速為400～900 r/min，在發(fā)酵過程中，將通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速一同與溶氧關(guān)聯(lián)，控制發(fā)酵罐中的溶氧水平在40%以上，當(dāng)?shù)竭_(dá)一定時間不能滿足40%的溶氧時，便保持最高通氣量和最大攪拌速率。每次取樣測定A600及發(fā)酵液中剩余葡萄糖含量等參數(shù)，以殘?zhí)堑暮谋M為標(biāo)志開始補料，在8 h時，殘?zhí)墙档偷讲荒軡M足菌體需求，此時運用不同的流加方式開始補料。

1.3 檢測與分析

溶氧測定:本實驗中溶氧電極校準(zhǔn)方法為轉(zhuǎn)速和通氣量均設(shè)為初始值(400 r/min、1 vvm)，斷開溶氧電極與電腦的連接線，此時校準(zhǔn)為0，然后所有料液添加完畢，溶氧穩(wěn)定之后，接種前校準(zhǔn)為100%。

葡萄糖濃度測定:發(fā)酵液12 000 r/min、4℃冷凍離心2 min后，取上清，用SBA-40 C型生物傳感分析儀測定。

全氨基酸測定:L-8900型氨基酸分析儀。

細(xì)胞干質(zhì)量測定方法 :分光光度計測定OD600值，然后依照文獻(xiàn)［10］的方法，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)擬合細(xì)胞干質(zhì)量(dry cell weight，DCW)和菌液 OD600值的回歸方程:ρ(DCW)=0.54OD600。

L-羥脯氨酸的測定采用氯胺 T法，參照文獻(xiàn)［11］。

2 結(jié)果與討論

在發(fā)酵8 h時殘?zhí)腔竞谋M，經(jīng)測定葡萄糖質(zhì)量濃度為0.05 g/L，但此時的溶氧并未出現(xiàn)上升的跡象，主要是因為脯氨酸在羥基化的過程中需要大量O2的參與(圖1)，這也是發(fā)酵過程中溶氧始終維持較低水平的一個重要原因，從而確定初次流加培養(yǎng)基的標(biāo)志不是溶氧的突然上升，而是殘?zhí)堑幕竞谋M。

圖1 羥脯氨酸的生物轉(zhuǎn)化Fig.1 Biotransformation of trans-4-hydroxy-L-proline

2.1 間歇流加方式

間歇流加是將流加操作分為幾個間斷進行，在各個流加間斷的起始即完成流加，其余時間均為分批發(fā)酵。間歇流加可以迅速補糖，對發(fā)酵的各個間斷的葡萄糖消耗情況加以控制，間歇發(fā)酵又可分為基于指數(shù)關(guān)系的間歇流加、基于恒速關(guān)系的間歇流加和基于反饋方式的間歇流加等，本實驗中采用基于恒速關(guān)系的間歇流加。實驗分兩組進行，間隔2 h補料1次，Ⅰ組每次流加20 g葡萄糖溶液，Ⅱ組每次流加40 g葡萄糖溶液，間隔4 h取1次樣(除葡萄糖濃度在補料前后都測定外，其余參數(shù)在補料前取樣測定)。結(jié)果如圖2所示。

流加葡萄糖后Ⅰ組和Ⅱ組的葡萄糖瞬時質(zhì)量濃度分別接近5和10 g/L，但是每次取樣在補料前進行，所以測得的葡萄糖濃度是經(jīng)過菌體一段時間消耗后的殘?zhí)菨舛?。由圖2可知:Ⅰ組葡萄糖在每次補料前基本耗盡，Ⅱ組的葡萄糖呈現(xiàn)累積的趨勢，說明菌體消耗葡萄糖的速率介于二者之間。在發(fā)酵8～16 h時，低濃度的葡萄糖有利于菌體生長;隨著菌體的生長，葡萄糖含量逐漸成為Ⅰ組菌體生長的限制性因素，而Ⅱ組在16 h后可較快速生長。但是Ⅱ組在44 h后由于副產(chǎn)物、代謝產(chǎn)物的生成和殘?zhí)菨舛冗^高等一系列因素導(dǎo)致生長趨于穩(wěn)定，Ⅰ組菌體密度繼續(xù)呈上升趨勢。在44 h之前，Ⅱ組的L-羥脯氨酸產(chǎn)量略高于Ⅰ組，之后Ⅱ組略低于Ⅰ組，并且2組L-羥脯氨酸產(chǎn)量均有所降低，主要是副產(chǎn)物或菌體自溶產(chǎn)生的物質(zhì)將L-羥脯氨酸分解所致，最終Ⅰ組在44 h獲得最高 L-羥脯氨酸產(chǎn)量，為27.546 g/L。

圖2 間歇流加時殘?zhí)菨舛?、吸光度及L-羥脯氨酸濃度變化Fig.2 Variation tendency of residual glucose concentration，absorbance and Hyp concentration during intermittent flow addition fermentation

間歇發(fā)酵過程中，葡萄糖濃度變化劇烈，雖然有些發(fā)酵實驗中，間歇流加取得了較好的結(jié)果，但是本實驗證明間歇流加并不利于L-羥脯氨酸的生產(chǎn)，因此就需要尋求另外的流加方式來進一步優(yōu)化，從本實驗中可以看出菌體的耗糖量在10～20 g/h之間。

2.2 指數(shù)流加方式

菌體的生長需要一個合適的流加速率，流加速率過高容易產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物，流加速率過低影響生產(chǎn)強度的提高。指數(shù)流加是一種基于物料平衡理論對某些參數(shù)進行合理假設(shè)的前置流加控制策略，可使底物的流加與發(fā)酵罐中菌體的增長相適應(yīng)。流加速率F的計算公式［12］:

式中:μ為比生長速率(h－1)，t為流加時間(h)，X0為細(xì)胞質(zhì)量濃度(g/L)，V0為培養(yǎng)物體積(L)，(X0V0)也就是在每次流加前測量的發(fā)酵罐中細(xì)胞量(g)，Y為細(xì)胞得率(g/g)，SF為流加培養(yǎng)基質(zhì)量濃度(g/L)，S為底物質(zhì)量濃度(g/L)。

表1 指數(shù)流加策略中相關(guān)參數(shù)的設(shè)定Table 1 Setting values of relevant parameters in index flow addition strategy

為滿足菌體生長時的物料平衡，在菌體的快速生長期采用對數(shù)流加策略，快速生長期過后則保持前段時間的流加速率，采用恒速流加。由于流加速率F是一個與時間t有關(guān)的指數(shù)函數(shù)，采用流加軟件控制流加速率，使流加速率F隨時間t的改變而時時改變。根據(jù)間歇發(fā)酵的平均比生長速率，該實驗分3組進行，比生長速率μ的設(shè)定分別為0.12(Ⅰ組)、0.08(Ⅱ組)和0.05(Ⅲ組)h－1。

利用式(1)計算出相應(yīng)時刻的流加速率F(L/h)，并以此速率流加發(fā)酵。結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知:在8～12 h由于流加速度較慢，此時殘?zhí)腔竞谋M，在12～20 h根據(jù)比生長速率的不同，殘?zhí)菨舛戎饾u出現(xiàn)差距。定時取樣測定殘?zhí)菨舛群图皶r調(diào)控流加速率F可以有效避免葡萄糖過量積累，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組分別在12、16和28 h開始恒速流加，流加速率 F分別為0.561、0.439和0.393 g/L。恒速流加后殘?zhí)菨舛扰c發(fā)酵時間基本呈一次函數(shù)上升，說明后期葡萄糖的單位時間消耗量基本恒定。從發(fā)酵液吸光度方面來看，在流加初期Ⅰ組流加速率較快，C源供應(yīng)充分，細(xì)胞密度迅速上升，其余2組細(xì)胞密度隨殘?zhí)堑慕档投档?，但是后期高濃度的殘?zhí)呛痛x副產(chǎn)物共同影響菌體生長，細(xì)胞密度又隨殘?zhí)菨舛鹊脑龃蠖鴾p小。至于L-羥脯氨酸的產(chǎn)量，由于殘?zhí)菨舛冗^高帶來的危害導(dǎo)致3組L-羥脯氨酸均過早降解，第Ⅲ組在40 h時L-羥脯氨酸的最大產(chǎn)量為24.809 g/L，盡管指數(shù)流加較間歇流加平穩(wěn)得多，但最終產(chǎn)量卻并不理想。

菌體不適合指數(shù)流加，對此筆者進一步分析，在菌體生長階段采用指數(shù)流加必須具備一些條件，其一:菌體的生長遵循Monod方程［13］。

圖3 指數(shù)流加時殘?zhí)菨舛?、吸光度及L-羥脯氨酸濃度變化Fig.3 Variation tendency of residual glucose concentration，OD600and Hyp content during index flow addition fermentation

式中:μmax為最大比生長速率，S為限制性基質(zhì)濃度，KS為基質(zhì)半飽和常數(shù)，即細(xì)胞比生長速率為μmax的一半時的基質(zhì)濃度。該方程是用來描述無抑制的細(xì)胞生長模型，脯氨酸羥化酶為生長耦聯(lián)型，在羥基化反應(yīng)中與細(xì)胞競爭O2，明顯抑制了細(xì)胞生長。在接種后5 h，發(fā)酵罐中的溶解氧降低到4%左右，從而使得溶解氧成為菌體生長時不可忽略的因素之一。一般發(fā)酵時，隨著菌體密度的增大，葡萄糖消耗量也隨之增大，但是本實驗中脯氨酸羥化酶的量也在增大，相應(yīng)需要更多O2參與脯氨酸的羥基化，從而使得菌體生長受到一定抑制，很難正常指數(shù)生長，進而確定該發(fā)酵過程不是無抑制的菌體生長，不適合指數(shù)流加方式。從殘?zhí)菨舛瓤闯?，菌體對葡萄糖的利用基本恒定，下面采用恒速流加方式進行優(yōu)化。

2.3 恒速流加方式

恒速流加相對于指數(shù)流加在操作上更為簡單，只需在補料開始時設(shè)定流加速率，不必在過程中改變流加速率。恒速流加時遵循以下物料平衡方程［13］。

式中:V為培養(yǎng)物體積(L)，X為培養(yǎng)基中細(xì)胞密度(g/L)，rx為細(xì)胞生長速率(g/(L·h))，S 為培養(yǎng)基中C源質(zhì)量濃度(g/L)，rs為 C源的消耗速率(g/(L·h))，F(xiàn) 為流加速率(L/h)，S0為補料培養(yǎng)基C源質(zhì)量濃度(g/L)，P為培養(yǎng)基中產(chǎn)物質(zhì)量濃度(g/L)，rp為產(chǎn)物形成速率(g/(L·h))，t為時間(h)。實驗時對初始流加葡萄糖速率進行控制，測定發(fā)酵液中的殘留葡萄糖濃度，然后再結(jié)合各項指標(biāo)確定最適流加速率。實驗分3組進行，設(shè)定的流加速率F分別為0.20(Ⅰ組)、0.30(Ⅱ組)和0.40(Ⅲ組)g/min。

關(guān)于溶氧問題，以恒速流加的第Ⅱ組為例進行分析，初始設(shè)定溶氧不低于40%，但是在發(fā)酵第6小時攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量均為最大才能滿足，在第7小時溶氧便迅速降到4%，且以后一直保持這種低溶氧狀態(tài)，直到發(fā)酵結(jié)束，菌體開始自溶后，溶氧才略有上升的趨勢。其他流加方式和流加速率的溶氧也與此種類似，流加速率較低的，溶氧略高點，如:恒速流加的第Ⅲ組由于C源不足，溶氧從7 h的4%上升到放罐時的30%。細(xì)胞只有在葡萄糖濃度合適的情況下才能既保證自身的生長，又有足夠的能量和O2合成L-羥脯氨酸，如果葡萄糖不足，細(xì)胞只能維持自身的生長，從而沒有多余的能量用來合成L-羥脯氨酸。

從殘?zhí)欠矫娣治?，如圖4所示，前2組殘?zhí)嵌挤€(wěn)定在一定范圍，其中Ⅰ組殘?zhí)菨舛染S持在0.05～0.10 g/L，Ⅱ組殘?zhí)菨舛染S持在0.10～0.20 g/L，但是當(dāng)流加速率再次提高時，殘?zhí)呛坎辉倮^續(xù)穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)，而是產(chǎn)生積累現(xiàn)象，例如:Ⅲ組在16 h之后殘?zhí)菨舛葞缀醭梢淮魏瘮?shù)趨勢上升，說明此時在物料平衡方面，C源的輸入已經(jīng)大于細(xì)胞的消耗，葡萄糖濃度隨時間的增長成一次函數(shù)上升，說明細(xì)胞對葡萄糖的消耗為勻速消耗，即:

式中:F為流加速率，rs為C源的消耗速率，k為發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛鹊脑鲩L速率。由圖4可知殘?zhí)菨舛入S時間的增長成一次函數(shù)上升，說明k近似為常數(shù)，又因為該流加方式為恒速流加，所以F也是一個恒定值，因此rs也近似為恒定值。

圖4 恒速流加時殘?zhí)菨舛?、吸光度及L-羥脯氨酸濃度變化Fig.4 Variation tendency of residual glucose concentration，absorbance and Hyp concentration during constant speed flow fermentation

在菌體密度方面，如圖4所示。Ⅰ組由于C源嚴(yán)重不足，限制菌體的生長，生長速率和最大細(xì)胞密度都不如其他2組;Ⅲ組由于殘?zhí)菨舛冗^高，易產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物，影響菌體生長，菌體密度低于Ⅱ組，大致趨勢相似，在36 h達(dá)到穩(wěn)定期。最后在L-羥脯氨酸方面進行分析。在24 h之前，3組數(shù)據(jù)幾乎近似一樣，沒有明顯差距，在穩(wěn)定期(36 h后)差距較為明顯，Ⅱ組在44 h時出現(xiàn)最大L-羥脯氨酸產(chǎn)量，42.5 g/L，Pro轉(zhuǎn)化率為81%，可見，0.30 g/min的流加速率對于穩(wěn)定期產(chǎn)L-羥脯氨酸比較有利，與同種流加方式的其他2種流加速率拉開了較大差距。結(jié)合菌體密度和L-羥脯氨酸濃度變化曲線可以看出，L-羥脯氨酸的產(chǎn)生是非生長依賴型的，Ⅱ組的L-羥脯氨酸在發(fā)酵中后期產(chǎn)率迅速上升，和其他2組迅速拉開差距，但是在細(xì)胞密度方面和Ⅲ組幾乎相似，從而可以確定，由于溶氧的限制，合適的流加速率在細(xì)胞生長方面幫助較小，在L-羥脯氨酸的產(chǎn)率和穩(wěn)定性方面有較大幫助。

在工業(yè)生產(chǎn)中較低的糖酸比(發(fā)酵中消耗的葡萄糖質(zhì)量與產(chǎn)生的L-羥脯氨酸質(zhì)量之比)能給企業(yè)節(jié)約生產(chǎn)成本，帶來更大的經(jīng)濟效益，在裝液量為4 L的7 L發(fā)酵罐中以上述3種流加速率進行恒速流加時的糖酸比如表2所示。

表2 恒速流加時的糖酸比Table 2 Sugar-acid ratio during constant speed flow fermentation

對本實驗中的發(fā)酵液進行氨基酸分析，分析發(fā)酵過程中是否有其他氨基酸產(chǎn)生以及脯氨酸的殘留量。測得最終發(fā)酵產(chǎn)物中主要氨基酸及濃度如表3所示。

從表3可以看出，除羥脯氨酸和脯氨酸以外的其他氨基酸的含量都很低，其中苯丙氨酸(Phe)的質(zhì)量濃度為0.098 g/L，在除Pro外的雜氨基酸中含量最高。

表3 氨基酸分析結(jié)果Table 3 Analysis results of amino acids

3 結(jié)論

利用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-羥脯氨酸過程中，以0.30 g/min恒速流加葡萄糖溶液使L-羥脯氨酸的產(chǎn)量達(dá)到了42.50 g/L。殘?zhí)琴|(zhì)量濃度對菌體的生長特別是最終產(chǎn)物產(chǎn)量影響較大，將殘?zhí)琴|(zhì)量濃度控制在0.10～0.20 g/L可使菌體保持較低的比生長速率，有效緩解了菌體因快速生長造成的溶氧不足和代謝抑制物過多帶來的危害。L-羥脯氨酸的生物轉(zhuǎn)化是一個耗氧過程，比生長速率的降低可減少氧氣用于菌體自身的生長，從而滿足HYP生物轉(zhuǎn)化過程中的溶氧需求。

盡管菌體的比生長速率較低，但是溶氧卻一直很難滿足菌體生長的需要，實驗中通入的是無菌空氣沒有使用純氧，整個發(fā)酵過程溶氧都成為限制性因素，之后的優(yōu)化可以在增加溶氧方面展開，如:在菌體中導(dǎo)入血紅蛋白基因提高細(xì)胞的氧氣利用率、增加罐壓和通入純氧等。

［1］ Gorres K L，Raines R T.Prolyl 4-hydroxylase［J］.Crit Rev Biochem Mol Biol，2010，45(2):106-124.

［2］ 張自強，趙東旭，楊新林.羥脯氨酸的研究與開發(fā)［J］.氨基酸和生物資源，2006，28(1):55-58.

［3］ Wu G，Bazer F W，Davis T A，et al.Arginine metabolism and nutrition in growth，health and disease［J］.Amino Acids，2009，37(1):153-168.

［4］ 吳顯榮.氨基酸營養(yǎng)［J］.氨基酸和生物資源，1988(2):2-3.

［5］ 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院.生化藥物·藥品集:第七分冊［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1984:56.

［6］ Lam M，Sulindro M.Aging skin［J］.Anti-Aging Research Brief，Academy of Anti-Aging Research MMIII，2001(1):1-8.

［7］ Kuttan R， Radhakrishnan A N. Biochemistry of the hydroxyprolines［J］.Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol，1973，37:273-347.

［8］ Ryotaro H，Kuniki K.Characterization of novel 2-oxoglutarate dependent dioxygenases converting L-proline to cis-4-hydroxy-L-proline［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，379(4):882-886.

［9］ 劉合棟，袁春偉，張震宇.高產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸重組大腸桿菌的構(gòu)建以及發(fā)酵條件優(yōu)化［EB/OL］.［2013－01－23］.http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201301 －989.

［10］ Korz D J，Rinas U，Hellmuth K.Simple fed-batch technique for high cell density cultivation of Escherichia coli［J］.J Biotechnol，1995，39(1):59-65.

［11］ 彭亞鋒，周耀斌，任蕾蕾，等.比色法測定醬油中羥脯氨酸含量的探討［J］.中國調(diào)味品，2010，35(2):100-101.

［12］ 陳堅，李寅.面包酵母培養(yǎng)過程解析和流加模式研究［J］.藥物生物技術(shù)，1995，2(4):37-42.

［13］ 陳堅，堵國成，衛(wèi)功元，等.微生物重要代謝產(chǎn)物:發(fā)酵生產(chǎn)與過程解析［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:23-24.