鄭小娟，孫 楊，陳萬河，靳魁奇，潘 龍，劉宇鵬

(1.河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物工程研究所，開封 475004;2.保定九孚生化有限公司，保定 071052)

二羥基丙酮(1，3-dihydroxyacetone，DHA)是一種簡單的酮糖，化學(xué)性質(zhì)活潑，是重要的醫(yī)藥原料、農(nóng)藥合成中間體、化妝品原料、飼料添加劑、食品保鮮劑、制革工業(yè)中皮革保護(hù)劑、功能性食品添加劑等，具有廣泛的應(yīng)用前景［1－4］。DHA 生產(chǎn)方法有化學(xué)法和微生物發(fā)酵法。與化學(xué)法相比，微生物發(fā)酵法反應(yīng)條件溫和、原料利用率高、產(chǎn)品純度高、工藝簡單、易于控制、環(huán)境友好，因此顯得更有生命力。從20世紀(jì)70年代起，在德國、日本、美國、丹麥等國家，生物轉(zhuǎn)化法甘油生產(chǎn)DHA在工業(yè)上得到大規(guī)模應(yīng)用［5］，國內(nèi)DHA產(chǎn)業(yè)尚處于起步階段。

近些年來，生物柴油作為清潔能源得到了大力發(fā)展［6］，在生物柴油的生產(chǎn)過程中，每生產(chǎn)10 t生物柴油有大約1 t的甘油產(chǎn)生［7］，這些粗甘油如果不經(jīng)過嚴(yán)格的精制提純就不能被重新利用。但純化過程繁瑣，成本極高。出于對(duì)環(huán)境和生態(tài)保護(hù)，利用生物柴油粗甘油生產(chǎn)一些高附加值的產(chǎn)品是發(fā)酵產(chǎn)業(yè)所努力的目標(biāo)，到目前為止，已經(jīng)有以生物柴油副產(chǎn)物粗甘油生產(chǎn)乙醇［8］、丙二醇［1］和丁二醇［9］等的報(bào)道。

由于國內(nèi)大多數(shù)生物柴油企業(yè)生產(chǎn)原料主要是餐飲廢油，從而導(dǎo)致副產(chǎn)物粗甘油純度較低，利用其生產(chǎn)下游產(chǎn)品困難;而且粗甘油中含有大量金屬離子及甲醇、游離脂肪酸等有毒物質(zhì)［10］，導(dǎo)致微生物生長受到抑制，不能直接被利用生產(chǎn)DHA。筆者利用本實(shí)驗(yàn)室成員篩選出的耐高濃度甘油、高轉(zhuǎn)化能力的弗托氏葡糖桿菌(Gluconobacter frateurii)CGMCC5397［11］，對(duì)餐飲廢油為來源的生物柴油副產(chǎn)物粗甘油生產(chǎn)DHA生產(chǎn)工藝條件進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 菌種

弗托氏葡糖桿菌(Gluconobacter frateurii)，河南大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室自主篩選，中國普通微生物保藏中心保藏號(hào):CGMCC5397。

1.2 生物柴油副產(chǎn)物粗甘油及其預(yù)處理

生物柴油(由餐飲廢油制備)副產(chǎn)物粗甘油是由唐河金海生物技術(shù)有限公司提供。甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為53%，各種離子含量(g/L):SO2－443.9、Zn2+2.848、Ca2+2.800、K+0.315、Fe2+1.730、Fe3+1.800、Cl－4.800、Na+49，pH 1.1。

預(yù)處理方法:5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為7，沉淀8 h，抽濾，濾液分別通過732陽離子交換樹脂和D315陰離子交換樹脂，流速為2 mL/min，稀釋為10%甘油溶液待用。

1.3 培養(yǎng)基

一級(jí)種子培養(yǎng)基組成(%):甘油5.0、酵母浸粉1.5、KH2PO40.3，pH 6.0;二級(jí)種子培養(yǎng)基組成(%):甘油3.0、酵母浸粉 1.0、CaCO30.3，pH 6.0;發(fā)酵培養(yǎng)基組成(%):甘油10.0、酵母浸粉1.5、CaCO30.3，pH 6.0;121℃濕熱滅菌20 min。

以上培養(yǎng)基配制均使用粗甘油配制，根據(jù)所使用粗甘油純度，培養(yǎng)基中甘油濃度已經(jīng)換算成純甘油含量(下同)。

1.4 培養(yǎng)方法

搖瓶發(fā)酵:取冷凍管保藏菌株接于裝液量為30 mL一級(jí)種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，30℃、220 r/min搖床培養(yǎng)24 h，5%接種量接二級(jí)種子，同上條件培養(yǎng)9 h，接裝液量為30 mL發(fā)酵培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵罐分批發(fā)酵:分批發(fā)酵是在7 L發(fā)酵罐(BioFlo 4000，NBS)中，裝液量 4 L，30 ℃條件下進(jìn)行，通氣量為1.2 vvm(vvm表示每分鐘通氣量與罐體實(shí)際料液體積的比值)，10 mol/L NaOH控制pH 5.5，發(fā)酵培養(yǎng)基組分同搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。

UAV+RFID實(shí)現(xiàn)在制品的信息采集，其主要工作任務(wù)為RFID讀寫器識(shí)別并收集在制品的信息。首先對(duì)于在制品存放區(qū)域來說，在制品存放區(qū)域既是需要被識(shí)別的區(qū)域也是障礙區(qū)域，故UAV在飛行過程中遇到在制品存放區(qū)域時(shí)也需要滿足式(2)。其次，在UAV的飛行路徑中要確保存在節(jié)點(diǎn)Li(xi,yi,zi)與在制品存放區(qū)域的距離小于RFID讀寫器的讀取距離。同時(shí)對(duì)在制品存放區(qū)域按照UAV半徑進(jìn)行膨脹，UAV按質(zhì)點(diǎn)處理，則RFID讀寫器識(shí)別的適應(yīng)度函數(shù)

發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵:初始總甘油質(zhì)量濃度為50 g/L，當(dāng)甘油質(zhì)量濃度低于20 g/L時(shí)，500 g/L滅菌甘油加到罐中，以保持甘油濃度。

1.5 分析方法

DHA檢測通過HPLC法測定，條件:Bio-Rad公司Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm，9 μm);UV檢測器(檢測波長270 nm);流動(dòng)相:8 mmol/L H2SO4;柱溫50℃;流速0.5 mL/min;進(jìn)樣量 20 μL。

甘油檢測方法:示差折光檢測器，HPLC條件與DHA檢測條件相同。

菌體量測定方法:取1 mL發(fā)酵液用2%HCl稀釋10倍，振蕩混勻，以蒸餾水為對(duì)照在波長560 nm下測其吸光度。

電導(dǎo)率測定方法:使用杭州奧立龍TDS.電導(dǎo)筆測定。

DHA轉(zhuǎn)化率 =ρ(DHA)/ρ(消耗的甘油)(1)

Zn2+測定采用火焰原子吸收光譜法測定，AA-6300F型原子吸收光譜儀(日本島津公司)，P-800S型空心陰極燈(澳大利亞Photron公司)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同離子對(duì)弗托氏葡糖桿菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)DHA的影響

表1 不同離子對(duì)細(xì)胞生長和生產(chǎn)DHA的影響Table 1 Effects of different ions on cell growth and production of DHA

由表1可知:在含有Zn2+的發(fā)酵液中，OD560為2.36，DHA產(chǎn)量34.3 g/L，大大低于其他實(shí)驗(yàn)項(xiàng)，由此可知Zn2+可嚴(yán)重抑制G.frateurii CGMCC5397菌體生長和轉(zhuǎn)化活性，F(xiàn)e2+、Fe3+、Ca2+和SO2－4對(duì)此也有一定的影響，而Cl－、K+和Na+對(duì)發(fā)酵幾乎沒有影響。

為了研究不同濃度的Zn2+對(duì)發(fā)酵的影響，考察不同濃度Zn2+對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知:當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度小于0.05 g/L時(shí)，隨著離子濃度的增加，菌體量和DHA產(chǎn)量都隨著Zn2+濃度的增加而增加，當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度大于0.1 g/L時(shí)，抑制作用明顯增加，DHA產(chǎn)量迅速下降。隨著Zn2+質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，超過1 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化幾乎受到完全抑制。

圖1 Zn2+質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of different Zn2+concentrations on DHA fermentation

2.2 粗甘油預(yù)處理對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響

為了除去粗甘油中影響發(fā)酵生產(chǎn)DHA的雜質(zhì)，特別是Zn2+，筆者選取了一些化學(xué)和物理除雜方法來進(jìn)行。初始甘油的質(zhì)量濃度為530 g/L，由于黏度過大不利于處理，加入一倍體積蒸餾水稀釋，通過調(diào)節(jié)pH使Fe2+、Fe3+及一些酸性蛋白、雜質(zhì)充分沉淀，抽濾除去沉淀物，通過離子交換樹脂除去其他一些離子及可溶性蛋白。每步處理后，取此步處理后甘油作為C源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵后測DHA，結(jié)果如表2所示。結(jié)果中每個(gè)值均用3次試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

由表2可知:未處理的粗甘油不能生產(chǎn)DHA，隨著不同的處理，電導(dǎo)率不斷降低，DHA產(chǎn)量隨著雜質(zhì)的減少而增加，經(jīng)過732陽離子交換樹脂處理后，電導(dǎo)率降低到3 278 μS/cm，降低了97%，Zn2+質(zhì)量濃度也由2 848 mg/L降到21 mg/L，經(jīng)過處理后，甘油收率為88.1%，處理后DHA產(chǎn)量從0提高到74.6 g/L。

2.3 初始粗甘油濃度的影響

圖2考察了不同初始濃度粗甘油對(duì)菌體轉(zhuǎn)化生產(chǎn)DHA及菌體生長的影響。由圖2可知:當(dāng)甘油質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，OD560最大為8.4，但由于甘油濃度過低，轉(zhuǎn)化生成DHA濃度很低，隨著甘油濃度不斷增加，DHA產(chǎn)量不斷變大，而菌體量趨于平衡;當(dāng)甘油質(zhì)量濃度為100 g/L時(shí)，DHA達(dá)到最大質(zhì)量濃度(71.36 g/L)。隨著甘油濃度不斷增加，由于高濃度底物甘油及金屬離子的濃度的增大，菌體生長受到抑制，菌體量不斷降低，DHA產(chǎn)量也不斷降低。

圖2 甘油質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響Fig.2 Effects of different glycerol concentrations on DHA fermentation

表2 粗甘油預(yù)處理對(duì)DHA發(fā)酵的影響Table 2 DHA production from pretreatment biodiesel byproduct glycerol

2.4 預(yù)處理的粗甘油分批發(fā)酵

在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，進(jìn)行處理后生物柴油副產(chǎn)品甘油在7 L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。初始甘油質(zhì)量濃度為100 g/L，30℃下，通氣量為2 vvm，發(fā)酵48 h，結(jié)果如圖3所示。圖3結(jié)果顯示，用生物柴油副產(chǎn)品甘油進(jìn)行分批發(fā)酵時(shí)，菌體在前8 h迅速增長，在32 h時(shí)達(dá)到最大，DHA濃度的增長延遲于細(xì)胞的生長，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)DHA質(zhì)量濃度為74.6 g/L。

2.5 處理后粗甘油補(bǔ)料分批發(fā)酵

在分批發(fā)酵的過程中，底物的抑制作用是影響弗托氏葡糖桿菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)DHA的主要因素(圖4)，因此在發(fā)酵過程采取補(bǔ)料分批發(fā)酵，即初始底物濃度較低，一段時(shí)間后加入一定量底物，使底物一直保持在一個(gè)相對(duì)較低的濃度，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知:菌體能快速生長，并且穩(wěn)定期得到延長，底物抑制作用降低，轉(zhuǎn)化效率提高，經(jīng)過32 h，OD560達(dá)到穩(wěn)定8.37，發(fā)酵結(jié)束后DHA產(chǎn)量為89.5 g/L，比分批發(fā)酵提高20.0%。生產(chǎn)強(qiáng)度為1.86 g/(L·h)，甘油轉(zhuǎn)化率為90.1%。

圖3 生物柴油甘油7 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵生產(chǎn)DHAig.3 Time courses of cell growth and production of DHA in 7-L stirred bioreactors with pretreated glycerol

圖4 生物柴油副產(chǎn)品甘油補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)DHAFig.4 Production of DHA in fed batch fermentation with crude glycerol

3 結(jié)論

通過對(duì)生物柴油副產(chǎn)物粗甘油性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，粗甘油中的Fe2+、Fe3+、SO2－4及Zn2+對(duì)菌體的生及轉(zhuǎn)化長有一定的抑制作用，尤其是Zn2+對(duì)菌體的生長及轉(zhuǎn)化抑制非常明顯，不適合進(jìn)行生產(chǎn)DHA。通過調(diào)節(jié)pH、沉淀、過濾、過柱等處理后，生物柴油副產(chǎn)物粗甘油可以用于微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)DHA。在7 L發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵48 h，DHA產(chǎn)量達(dá)到89.5 g/L。

隨著能源危機(jī)的加劇，新能源的開發(fā)利用越來越得到重視，而對(duì)新能源副產(chǎn)品的利用也亟須得到解決，本文通過實(shí)驗(yàn)初步證明了利用生物柴油副產(chǎn)物粗甘油生產(chǎn)DHA的可行性，為今后的工業(yè)化大生產(chǎn)提供必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

［1］ Metsoviti M，Paraskevaidik，Koutinas A，et al.Production of 1，3-propanediol，2，3-butanediol and ethanol by a newly isolated Klebsiella oxytoca strain growing on biodiesel-derived glycerol based media［J］.ProcessBiochemistry，2012，47(12):1872-1882.

［2］ Brown D A.Skin pigmentation enhancers［J］.Journal of Photochemistry and Photobiology B:Biology，2001，63(1):148-161.

［3］ Levy S B.Dihydroxyacetone-containing sunless or self-tanning lotions［J］.Journal of the American Academy of Dermatology，1992，27(6):989-993.

［4］ Nguyen B C，Kochevar I.Factors influencing sunless tanning with dihydroxyacetone［J］.British Journal of Dermatology，2003，149(2):332-340.

［5］ 李堯.微生物發(fā)酵生產(chǎn)二羥基丙酮的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.四川食品與發(fā)酵，2007，139(5):20-23.

［6］ 陳英明，陸繼東，肖波，等.生物柴油原料資源利用與開發(fā)［J］.能源工程，2007，1:33-37.

［7］ Johnson D T，Taconi K A.The glycerin glut:options for the value added conversion of crude glycerol resulting from biodiesel production［J］.Environmental Progress，2007，26(4):338-348.

［8］ Oh B R，Seo J W，Heo S Y，et al.Efficient production of ethanol from crude glycerol by a Klebsiella pneumoniae mutant strain［J］.Bioresource Technology，2011，102(4):3918-3922.

［9］ 張育川.二羥丙酮 (DHA)［J］.精細(xì)與專用化學(xué)品，2003，22:21.

［10］ 羅敏健，葉活動(dòng)，羅丹明，等.生物柴油生產(chǎn)過程中粗甘油的預(yù)處理［J］.廣東化工，2012，9(5):67-68.

［11］ 劉宇鵬，陳萬河，王磊，等.一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)二羥基丙酮的菌種 HD924 和方法:中國，20110388519［P］.2012-09-28.