任立偉，徐 田，蔣振華，賈紅華，周 華，韋 萍

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，南京 211800)

手性仲醇是合成藥物和其他精細(xì)化學(xué)品重要的手性輔劑。例如，S-和R-2-辛醇均為合成農(nóng)藥，醫(yī)藥化學(xué)品和高質(zhì)量液晶等高附加值產(chǎn)品的重要中間體［1－3］。與不對(duì)稱(chēng)合成和化學(xué)拆分法制備光學(xué)純仲醇相比，酶動(dòng)力學(xué)拆分法具有立體選擇性高、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少和生產(chǎn)成本較低等優(yōu)勢(shì)［4］。特別是脂肪酶能夠在非水相中催化非天然底物之間反應(yīng)的特性，使其成為動(dòng)力學(xué)拆分手性仲醇的首選酶制劑，并且相關(guān)研究也已得到了很好的發(fā)展［5－7］。

脂肪酶拆分手性仲醇通常在疏水性有機(jī)溶劑中進(jìn)行，近年來(lái)離子液體和超臨界流體等新興的非水相酶催化溶劑的使用為解決工業(yè)酶催化的問(wèn)題提供了新的可能［8－9］。然而，這兩種新型溶劑的制備和使用成本依然較高，并且仍未從根本上解決有溶劑催化體系存在的弊端。無(wú)溶劑酶催化體系無(wú)論從催化效率、產(chǎn)物提取以及過(guò)程綠色化等角度都具有有溶劑體系所無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)［5，10］。但是，目前基于無(wú)溶劑體系的酶動(dòng)力學(xué)拆分手性仲醇的研究相對(duì)較少。非水相酶催化反應(yīng)并非在完全無(wú)水的條件下進(jìn)行，酶表面須結(jié)合微量的“必需水”以使酶分子具有一定的柔性，從而滿(mǎn)足酶催化過(guò)程中酶構(gòu)象變化的要求［11］。然而，過(guò)量的水分不僅會(huì)影響酶在非水相中的活性和穩(wěn)定性，還可能會(huì)導(dǎo)致副反應(yīng)發(fā)生。因此，非水相中的水含量對(duì)催化效果具有十分重要的影響。

目前，從無(wú)溶劑反應(yīng)體系中提取光學(xué)純仲醇主要通過(guò)硅膠層析或高效液相色譜分離法［12－13］。但是，層析分離過(guò)程中需要將待分離組分溶于流動(dòng)相，并且分離得到的產(chǎn)物一般存在于洗脫液。而上述流動(dòng)相或者洗脫液一般為幾種有機(jī)溶劑的混合物，這些溶劑的使用在一定程度上將使前期的無(wú)溶劑反應(yīng)失去意義。

在本文中，筆者將以2-辛醇為模式底物，努力建立一個(gè)簡(jiǎn)單、高效的無(wú)溶劑脂肪酶催化拆分手性仲醇反應(yīng)體系，并將對(duì)無(wú)溶劑體系中微量水對(duì)拆分效果的影響進(jìn)行分析以及嘗試?yán)弥咀逯俅寂c水形成低沸點(diǎn)共沸物的特性，在常壓條件下通過(guò)非均相共沸蒸餾的方法對(duì)拆分得到的光學(xué)純手性仲醇進(jìn)行提取分離。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

脂肪酶Novozyme 435(Candida antarctica Lipase B吸附固定化于大孔樹(shù)脂)，諾維信公司;4A分子篩和正己烷(HPLC級(jí))，上海國(guó)藥試劑;辛酸乙烯酯(AR)，上海紫一試劑;2-辛醇(AR)，日本 TCI試劑公司;其他試劑均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。所有試劑在使用前用4A分子篩除水1周以上。實(shí)驗(yàn)所用水均為去離子水。酰基供體的logP值經(jīng)Chemdraw Ultra 7.0軟件計(jì)算得到。

1.2 脂肪酶催化2-辛醇動(dòng)力學(xué)拆分反應(yīng)

將外消旋2-辛醇(36 mmol)，?；w(18～90 mmol)和4A分子篩(6.0 g)加入到25 mL具塞三角瓶中，并置于45℃搖床中充分混勻。向反應(yīng)瓶加入0.18 g脂肪酶Novozyme 435后反應(yīng)開(kāi)始計(jì)時(shí)，間隔一定時(shí)間取樣15 μL，用0.5 mL正己烷稀釋?zhuān)俳?jīng)0.22 μm有機(jī)系膜過(guò)濾后，進(jìn)氣相檢測(cè)。當(dāng)反應(yīng)以辛酸乙酯為酰基供體時(shí)，無(wú)需添加分子篩，但需在5 mm Hg的真空環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)以辛酸乙烯酯等活性酯類(lèi)為?；w時(shí)，無(wú)需去除副產(chǎn)物。

1.3 脂肪酶的操作穩(wěn)定性檢測(cè)

當(dāng)2-辛醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)到50% 時(shí)，終止拆分反應(yīng)。用砂芯漏斗過(guò)濾回收固定化酶和4A分子篩，并收集濾液用于提取拆分得到的手性仲醇。用適量的正己烷沖洗固定化酶，在常溫常壓下風(fēng)干30 min后，加入到組成與前一批相同的新鮮反應(yīng)液中，在相同的條件下再次催化拆分反應(yīng)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。以相同的方法重復(fù)數(shù)次上述操作。

1.4 非均相共沸蒸餾提取拆分得到的光學(xué)純2-辛醇

在實(shí)驗(yàn)室小試階段，采用普通的玻璃蒸餾裝置進(jìn)行非均相共沸蒸餾操作。反應(yīng)液(過(guò)濾除固定化酶和分子篩后)與一定量的水加入到50 mL圓底燒瓶中，充分?jǐn)嚢瑁瑢⒄羝隹谔幍臏囟燃訜岬?8.0℃。當(dāng)蒸汽經(jīng)過(guò)冷凝管后，凝結(jié)成的液體自動(dòng)分為光學(xué)純2-辛醇和水上下兩層。無(wú)需其他任何處理，上層有機(jī)物即為所要產(chǎn)物。

1.5 氣相色譜檢測(cè)方法

采用Agilent 6890型氣相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)對(duì)試樣的光學(xué)純度和提取得到的光學(xué)純2-辛醇的組成進(jìn)行檢測(cè)分析。測(cè)定底物2-辛醇的對(duì)映體過(guò)量率(e.e.s)時(shí)，試樣需要首先與過(guò)量的衍生化試劑R-苯乙基異氰酸酯在45.0℃反應(yīng)45 min后方可進(jìn)氣相色譜儀檢測(cè)［14］。色譜柱為 Agilent DB-1(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)，柱室溫度為110.0 ℃維持1 min，以15℃/min升溫至210℃并維持1 min，再以1℃/min升溫至225℃并維持1 min。其中，tr(S)=12.4 min，tr(R)=13.1 min。測(cè)定反應(yīng)生成的2-辛醇相應(yīng)的酯類(lèi)物質(zhì)的對(duì)映體過(guò)量率(e.e.p)時(shí)，可直接利用手性氣相色譜柱檢測(cè)。色譜柱為Varian CP-chirasil-Dex CB(25 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱室溫度為60℃ 維持1 min，以3℃/min升溫至200℃并維持1 min。

對(duì)映體過(guò)量率 e.e.=(A1－A2)/(A1+A2)×100%，其中:A1和A2分別為氣相檢測(cè)時(shí)2種對(duì)映異構(gòu)體中較大的峰面積和較小的峰面積。對(duì)映體比率 E=ln［(1 － e.e.s)/(1+e.e.s/.e.e.p)］/ln［(1+e.e.s)/(1+e.e.s/e.e.p)］;底物轉(zhuǎn)化率 C=e.e.s/(e.e.s+e.e.p)×100% 。

蒸餾得到的光學(xué)純2-辛醇用正己烷稀釋后，同樣用氣相色譜法對(duì)其組成進(jìn)行分析，并計(jì)算其純度。色譜柱為Agilent DB-225(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，柱室溫度為 60℃ 維持 1 min，以 10℃/min升溫至210℃并維持1 min。

1.6 無(wú)溶劑體系含水量檢測(cè)方法

采用SFY-3000型全自動(dòng)微量水分測(cè)定儀(淄博博山海分儀器廠(chǎng))檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程無(wú)溶劑反應(yīng)液中含水量的變化。反應(yīng)過(guò)程中，間隔一定時(shí)間用50 μL微量進(jìn)樣器吸取反應(yīng)液，直接進(jìn)微量水分測(cè)定儀檢測(cè)。采用SC69-02C型烘干法水分測(cè)定儀(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)檢測(cè)反應(yīng)前后脂肪酶固體中含水量的變化。未經(jīng)使用的Novozyme 435和反應(yīng)后過(guò)濾回收得到的Novozyme 435，均用無(wú)水正己烷沖洗過(guò)濾數(shù)次，常溫常壓下風(fēng)干30 min后再進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 ?；w種類(lèi)對(duì)拆分效果的影響

無(wú)溶劑反應(yīng)體系中，底物同時(shí)起到反應(yīng)溶劑的作用，在醇類(lèi)物質(zhì)確定的前提下，?；w的種類(lèi)相比于有溶劑反應(yīng)體系時(shí)對(duì)脂肪酶催化拆分效果的影響將更為顯著，所以首先對(duì)其進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，即使使用疏水性相對(duì)較強(qiáng)的辛酸乙烯酯(log P=3.28)為?；w，拆分效果也很不理想，說(shuō)明無(wú)溶劑體系不適合采用活性酯為?；w。辛酸乙酯(log P=3.03)曾被認(rèn)為是較為理想的無(wú)溶劑體系拆分手性仲醇的?；w，但其副產(chǎn)物乙醇只能通過(guò)抽真空的方法去除，這將極大的增加對(duì)生產(chǎn)設(shè)備的要求和能量的消耗。

因此，可以推斷以中長(zhǎng)鏈脂肪酸為?；w的拆分效果最好，因此選擇幾種常用的脂肪酸進(jìn)一步比較研究，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知:己酸需要更長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間以達(dá)到近似50%的轉(zhuǎn)化率，但S-2-辛醇的e.e.值仍不到90%，可能對(duì)于脂肪酶而言，己酸(log P=1.91)的疏水性依然不足且酸性仍較強(qiáng)。癸酸(log P=3.27)和月桂酸(log P=4.10)在室溫下均為固體，45℃熔融后反應(yīng)體系黏度較大，不易于物質(zhì)和能量的傳遞。辛酸(log P=2.43)的疏水性雖然比它們稍弱，但以其為?；w時(shí)反應(yīng)體系較低的黏度可彌補(bǔ)疏水性的不足。綜合以上結(jié)果，在以下的研究中選擇辛酸為?；w。

表1 不同種類(lèi)的?；w對(duì)2-辛醇的拆分效果Table 1 Kinetics resolution of 2-octanol with different kinds of acyl donors

表2 以不同中長(zhǎng)鏈脂肪酸為?；w對(duì)2-辛醇的拆分效果Table 2 Kinetics resolution of 2-octanol with different middle-chain fatty acids

2.2 反應(yīng)溫度和底物摩爾比對(duì)拆分效果的影響

在辛酸與2-辛醇的摩爾比為0.5∶1～2∶1和反應(yīng)溫度為30～60℃的范圍內(nèi)，考察上述兩因素對(duì)無(wú)溶劑體系脂肪酶拆分2-辛醇效果的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知:以拆分反應(yīng)達(dá)到50%左右的轉(zhuǎn)化率為目標(biāo)時(shí)，升高反應(yīng)溫度可縮短反應(yīng)時(shí)間。在此無(wú)溶劑體系中，在60℃的高溫條件下Novozyme 435依然保持了較高的活性，但是脂肪酶對(duì)底物的選擇性卻明顯降低。而在30℃時(shí)反應(yīng)體系較高的黏度會(huì)增加固定化脂肪酶催化拆分反應(yīng)時(shí)的物質(zhì)和能量的傳遞阻力。結(jié)果表明，45℃的反應(yīng)溫度最為理想。以0.5∶1的條件進(jìn)行拆分時(shí)，若反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率能達(dá)到50%，體系將只剩為拆分得到的S-2-辛醇和生成的相應(yīng)的R型酯，這將極大的便于產(chǎn)物的分離提取。遺憾的是，即使反應(yīng)生成的副產(chǎn)物水及時(shí)被分子篩去除，此條件下轉(zhuǎn)化率也未能達(dá)到50%。由此說(shuō)明，過(guò)量的酰基供體因其既作為反應(yīng)溶劑又推動(dòng)反應(yīng)向酯化方向進(jìn)行為無(wú)溶劑體系所必需。同時(shí)，辛酸過(guò)多則不利于后期對(duì)S-2-辛醇進(jìn)行提取，在保證目標(biāo)物較高的光學(xué)純度的前提下，將最適宜的底物摩爾比確定為1.5∶1。

表3 其他反應(yīng)條件對(duì)酶催化動(dòng)力學(xué)拆分2-辛醇效果的影響Table 3 Effects of reaction conditions on enzymatic kinetics resolution of 2-octanol

2.3 無(wú)溶劑體系中水分對(duì)拆分效果的影響

在優(yōu)化后反應(yīng)條件下，對(duì)拆分過(guò)程中反應(yīng)液和催化拆分前后固定化酶的含水量變化進(jìn)行了考察，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知:反應(yīng)開(kāi)始的4 h內(nèi)，反應(yīng)速率較快，副產(chǎn)物水在反應(yīng)液中的含量也隨之增加。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于4 h，由于可被催化的底物的濃度降低，反應(yīng)速率開(kāi)始減慢，進(jìn)而單位時(shí)間內(nèi)水生成量也開(kāi)始降低。而分子篩吸水速率基本恒定，所以反應(yīng)液中的含水量開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，并且在此階段正是分子篩穩(wěn)定的去除副產(chǎn)物水的能力推動(dòng)速率已經(jīng)開(kāi)始減慢的拆分反應(yīng)向正方向不斷進(jìn)行。整個(gè)拆分反應(yīng)過(guò)程中，無(wú)溶劑反應(yīng)液的含水量雖然發(fā)生了波動(dòng)，但被很好地控制在0.6%以下。反應(yīng)結(jié)束后，固定化酶Novozyme 435的含水量也維持在反應(yīng)前的2%左右。由此證明，分子篩只去除與之接觸的反應(yīng)液中生成的副產(chǎn)物水，而不會(huì)剝奪脂肪酶催化所必需的結(jié)合水，這對(duì)非水相脂肪酶催化的不對(duì)稱(chēng)酯化反應(yīng)是十分有利的。

圖1 酶催化拆分2-辛醇反應(yīng)過(guò)程Fig.1 Process of the enzymatic resolution of 2-octanol

2.4 脂肪酶在無(wú)溶劑體系中的操作穩(wěn)定性

當(dāng)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到50%后，過(guò)濾回收固定化脂肪酶Novozyme 435，并收集反應(yīng)液用于提取拆分的得到的S-2-辛醇。Novozyme 435只需經(jīng)正己烷洗滌，并在常溫常壓下風(fēng)干30 min后就可以加入到新的反應(yīng)液中重復(fù)利用以考察脂肪酶的操作穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知:Novozyme 435經(jīng)6次連續(xù)使用后，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率依然維持在48%以上，S-2-辛醇的e.e.值也只是略有降低，并且將反應(yīng)時(shí)間由12 h延長(zhǎng)到14 h后，又可恢復(fù)到 e.e.s＞98%，與第一次拆分反應(yīng)相近的水平。在無(wú)溶劑體系中，雖然底物酸和醇的濃度均較高，但是經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，反應(yīng)條件較為溫和，體系的疏水性適宜，特別是對(duì)反應(yīng)體系中副產(chǎn)物水的控制且未剝奪脂肪酶結(jié)合的“必需水”，因此固定化脂肪酶在此反應(yīng)體系中具有良好的操作穩(wěn)定性。

圖2 脂肪酶在無(wú)溶劑體系中的操作穩(wěn)定性Fig.2 Reusability of lipase in solvent-free system

2.5 非均相共沸蒸餾提取拆分得到的S-2-辛醇

回收固定化酶后反應(yīng)液由拆分得到的S-2-辛醇、剩余的辛酸和生成的R型酯組成，其中只有2-辛醇可以與水形成低沸點(diǎn)共沸物(2-辛醇(27.0%)、水(73.0%)，98.0 ℃)［15］，更重要的是，2-辛醇與水不互溶，蒸出液經(jīng)冷卻后可自動(dòng)分層，無(wú)需進(jìn)一步分離。研究中以水為夾帶劑在常壓下對(duì)拆分得到的S-2-辛醇進(jìn)行非均相共沸蒸餾提取，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知:當(dāng)根據(jù)共沸物的組成，將適量的水加入到反應(yīng)液中進(jìn)行共沸蒸餾提取時(shí)，雖然蒸出液中S-2-辛醇的 e.e.值保持不變，但只有 S-2-辛醇總量的75.6%被蒸出，所加入的水與疏水性的S-2-辛醇充分接觸可能是成功提取的關(guān)鍵。因此，曾嘗試在超聲乳化下進(jìn)行共沸蒸餾提取，但S-2-辛醇的蒸出率反而降低，這可能是因?yàn)樗c整個(gè)反應(yīng)液均發(fā)生了乳化，而與非S-2-辛醇組分之間的乳化相當(dāng)于對(duì)水的消耗。轉(zhuǎn)而采用了加速攪拌和提高水添加量的方法進(jìn)行提取。當(dāng)水添加量為理論需水量2倍時(shí)，所有拆分得到的S-2-辛醇均被成功的提取出，并且產(chǎn)品的純度進(jìn)一步增加到98%以上。并且因?yàn)?-辛醇不溶于水，不會(huì)有S-2-辛醇?xì)埩粼谡舫鲆褐械乃畬?，總產(chǎn)率也已達(dá)到90%以上。研究中發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)液為淡黃色，而蒸出的S-2-辛醇為無(wú)色液體，所以共沸蒸餾的過(guò)程還同時(shí)完成了對(duì)產(chǎn)品的脫色處理。

表4 加水量對(duì)S-2-辛醇蒸餾效果的影響Table 4 Effects of the amount of added water on distillation of S-2-octanol

3 結(jié)論

首先對(duì)?；w的種類(lèi)進(jìn)行選擇并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)活性酯類(lèi)因其產(chǎn)生大量乙醛并不適用于無(wú)溶劑酶催化體系。與辛酸乙酯等脂肪酸簡(jiǎn)單酯類(lèi)相比，脂肪酶的天然底物中長(zhǎng)鏈脂肪酸更適合作為無(wú)溶劑脂肪酶動(dòng)力學(xué)拆分手性仲醇的酰基供體。針對(duì)脂肪酸的特性，選擇添加分子篩的方法去除副產(chǎn)物水。研究中發(fā)現(xiàn)，無(wú)溶劑反應(yīng)中含水量隨反應(yīng)的進(jìn)行發(fā)生了波動(dòng)，但總體被控制在0.6%以下。通過(guò)測(cè)定反應(yīng)前后Novozyme 435含水量的變化證明，分子篩并不會(huì)破壞脂肪酶的結(jié)合水。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入適量的水，通過(guò)非均相共沸蒸餾的方法提取拆分得到的S-2-辛醇。S-2-辛醇的光學(xué)純度并未降低，且產(chǎn)率和純度分別大于90%和98%。此拆分及提取過(guò)程具有操作簡(jiǎn)單，酶催化效率高，過(guò)程綠色，成本及能耗低，產(chǎn)率及產(chǎn)品純度高等特征。

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