王菲菲，劉 婷，劉立明

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室食品微生物制造工程研究室，無錫 214122)

琥珀酸作為一種重要的化工原料，廣泛應(yīng)用于食品、制藥、農(nóng)業(yè)和化工等領(lǐng)域。同時，還可轉(zhuǎn)化為其他大宗化學(xué)品，具有巨大的潛在市場空間［1］?，F(xiàn)在，傳統(tǒng)的琥珀酸生產(chǎn)存在工藝原料短缺、耗資大和環(huán)境污染嚴(yán)重等問題，限制了其進(jìn)一步發(fā)展。近年來，發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸則逐漸成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，主要集中在產(chǎn)琥珀酸放線桿菌［2］、產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌［3－4］、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌［5］和重組大腸桿菌［6－7］等。然而，由于這些微生物存在發(fā)酵、純化工藝復(fù)雜等原因，限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用［8－10］。樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)是能利用木糖的優(yōu)勢菌株，而木糖廣泛存在于林業(yè)及農(nóng)業(yè)廢棄物中，因此，研究代謝改造樹干畢赤酵母生產(chǎn)琥珀酸對生物質(zhì)資源的利用具有重要意義。此外，P.stipitis具有耐受低 pH、高糖等優(yōu)點(diǎn)［11］，能極大地簡化下游工序、降低生產(chǎn)成本，是發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的潛在優(yōu)勢菌株。

本研究中筆者借助樹干畢赤酵母全基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型iTL885［12］，設(shè)計琥珀酸最佳合成途徑，進(jìn)而利用代謝工程策略對樹干畢赤酵母進(jìn)行代謝改造，以期提高琥珀酸產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種和質(zhì)粒

P.stipitis FPL-UC7［13］，由美國威斯康辛大學(xué)Jeffries教授惠贈;E.coli JM109，質(zhì)粒 pY26TEFGPD［14］、pUG72由筆者所在食品微生物制造工程實(shí)驗室保存。

1.2 主要試劑和儀器

PCR儀(Bio-Rad公司)，高效液相色譜儀(DIONEX UItimate 3000)，5 L發(fā)酵罐(上海寶興生物設(shè)備工程有限公司)。

所用內(nèi)切酶、PCR酶及膠回收試劑盒，大連寶生物公司(TaKaRa);酵母基因組提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司;琥珀酸脫氫酶試劑盒，南京建成科技有限公司;胰蛋白胨和酵母粉，英國OXOID公司;其他生化試劑，上海生工生物工程有限公司;測序工作由上海華大基因有限公司完成。

1.3 代謝網(wǎng)絡(luò)模型模擬與分析

模型iTL885［14］是筆者所在實(shí)驗室成員根據(jù)P.stipitis CBS6054基因組序列構(gòu)建的，包含885個基因、870個代謝物和1 240個代謝反應(yīng)。

采取iTL885模擬分析高產(chǎn)琥珀酸代謝工程策略，利用COBRA Toolbox將模型iTL885 Excel文件讀入Matlab中轉(zhuǎn)化為系數(shù)矩陣，并以流量平衡分析方法(FBA)［15］進(jìn)行模擬分析，約束條件下求解目標(biāo)方程，獲得代謝反應(yīng)流量分布。模擬的約束條件來源于實(shí)驗數(shù)據(jù)，模擬基因過量表達(dá)時，將基因?qū)?yīng)的生化反應(yīng)代謝流量設(shè)置為原流量的5倍，模擬基因敲除時，將基因控制的生化反應(yīng)的代謝流量設(shè)為0。

1.4 重組菌株的構(gòu)建方法

1.4.1 重組菌株FPLicl的構(gòu)建

參照P.stipitis CBS6054 icl1基因序列，設(shè)計帶有BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)的引物ICL-F/ICL-R(表1)，以 P.stipitis FPL-UC7基因組為模板，利用PCR獲得目的基因片段。將純化后的icl1基因片段和載體質(zhì)粒pY26TEF-GPD進(jìn)行BamH I和EcoR I雙酶切，柱式純化回收，16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中后，涂布帶有氨芐青霉素的LB平板，挑取轉(zhuǎn)化子接種到LB液體培養(yǎng)基(含氨芐)搖瓶中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒酶切驗證，測序驗證，從而獲得表達(dá)質(zhì)粒pY26-icl1。

采用電轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到P.stipitis FPL-UC7感受態(tài)中，電轉(zhuǎn)條件:電壓1.5 kV，電容25 μF，電阻200 Ω，電擊4 ms。經(jīng)過SC培養(yǎng)基篩選及質(zhì)粒提取酶切驗證，得到重組菌株FPLicl1。

1.4.2 重組菌株FPLΔsdh的構(gòu)建

采用同源重組的方法敲除出發(fā)菌株FPL-UC7的琥珀酸脫氫酶基因(sdh1)，由于P.stipitis的同源重組率比較低，因此要擴(kuò)增相對較大的同源臂與尿嘧啶標(biāo)記基因融合，構(gòu)成敲除組件。具體步驟如下:參照P.stipitis CBS6054基因組序列，分別設(shè)計擴(kuò)增琥珀酸脫氫酶基因(sdh1)的上下游800 bp DNA片段的引物，引物分別為upper-F/upper-R、lower-F/lower-R，參照質(zhì)粒pUG72序列設(shè)計擴(kuò)增尿嘧啶基因片段的引物，引物為ura-F/ura-R，分別PCR得到3個目的片段，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳回收，以融合PCR方法將3個片段融合連接起來，構(gòu)成敲除組件，瓊脂糖凝膠回收并測序。

將敲除片段電轉(zhuǎn)化P.stipitis FPL-UC7感受態(tài)，經(jīng)過篩選獲得轉(zhuǎn)化子，再分別用兩對驗證引物YF1/Y-R1和Y-F2/Y-R2進(jìn)行驗證，從而獲得正確的重組菌株FPLΔsdh。

1.4.3 重組菌株FPLΔsdh-icl的構(gòu)建

同樣采取同源重組的方法使重組菌株FPLΔsdh重新獲得尿嘧啶標(biāo)記。設(shè)計具有同源臂的引物upper-F/upper-A和lower-S/lower-R，分別擴(kuò)增sdh1的上下游序列800 bp，得到的目的片段凝膠回收，融合PCR法進(jìn)行拼接，構(gòu)成尿嘧啶標(biāo)記敲除組件，瓊脂糖凝膠回收并測序。將構(gòu)建好的敲除片段電轉(zhuǎn)化到P.stipitis FPLΔsdh感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化液經(jīng)后培養(yǎng)后，涂布5-氟乳清酸(5-FOA)篩選平板，30℃培養(yǎng)，挑取其中較大的轉(zhuǎn)化子傳代培養(yǎng)，篩選得到的轉(zhuǎn)化子搖瓶培養(yǎng)提取基因組，進(jìn)行PCR驗證，最后得到恢復(fù)尿嘧啶缺失標(biāo)記的重組菌株FPLΔsdhΔura。

接下來將重組質(zhì)粒pY26-icl1電轉(zhuǎn)化到FPLΔsdhΔura感受態(tài)中，用 SC篩選培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，提取質(zhì)粒驗證，最終得到sdh1基因缺失同時過量表達(dá)icl1基因的重組菌株P(guān)PLΔsdh-icl。

1.4.4 對照菌FPLpy26的構(gòu)建

將空質(zhì)粒pY26TEF-GPD轉(zhuǎn)化到P.stipitis FPLUC7感受態(tài)中，平板篩選轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到表達(dá)ura3基因能在基本培養(yǎng)基上生長的對照菌FPLpy26。

本實(shí)驗所使用的引物見表1。

表1 本實(shí)驗所用到的引物Table 1 Primers used in the experiment

1.5 培養(yǎng)條件

1.5.1 培養(yǎng)基

E.coli培養(yǎng)與保存培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(g/L):酵母膏5、蛋白胨10、NaCl 10。加入50 mg/L氨芐青霉素的LB用于篩選轉(zhuǎn)化子。

P.stipitis轉(zhuǎn)化子的篩選(SC)培養(yǎng)基(g/L):木糖20、YNB(不含 (NH4)2SO4)1.7、(NH4)2SO45。

5-FOA篩選培養(yǎng)基:SC培養(yǎng)基加入50 mg/L尿嘧啶和1 g/L 5-氟乳清酸;5-FOA用二甲基亞砜溶解，過濾除菌。

P.stipitis種子培養(yǎng)基(YPX)(g/L):酵母粉10、胰蛋白胨20、木糖20。

P.stipitis發(fā)酵培養(yǎng)基(YNBX)(g/L):YNB 1.7、尿素 2.27、木糖50。

1.5.2 培養(yǎng)方法

E.coli培養(yǎng)方法:挑取平板活化的單菌落接種到裝有25 mL LB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，37℃、200 r/min培養(yǎng)，培養(yǎng)攜帶質(zhì)粒的菌種時，培養(yǎng)基中要加氨芐青霉素。

P.stipitis發(fā)酵培養(yǎng)方法:挑取平板活化的單菌落到種子培養(yǎng)基，于30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h，以體積分?jǐn)?shù)5%接種量接種到5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，溫度為30℃，pH為6.5，轉(zhuǎn)速為400 r/min，通氣量為1.0 vvm(vvm表示每分鐘通氣量與罐體實(shí)際料液體積的比值)。

1.6 分析方法

1.6.1 酶活的測定方法

粗酶液制備:取對數(shù)生長中期3 mL發(fā)酵液于離心管中，8 000 r/min、5 min離心，去除上清液，菌體用PBS緩沖液(pH 7.4)重懸洗滌并離心2次，去除上清，菌體加入2 mL緩沖液，超聲破碎20 min，4 000 r/min離心8 min，上清即粗酶液。總蛋白濃度測定參照考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清蛋白(BSA)做蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

異檸檬酸裂解酶酶活測定參照文獻(xiàn)［16］。酶活定義:1 min內(nèi)氧化1 μmol NADH所需的酶量定義為1 U。比酶活定義為每毫克蛋白含有的酶活(U/mg)。

琥珀酸脫氫酶酶活測定參照琥珀酸脫氫酶試劑盒測定，測定粗酶液于600 nm吸光度的變化值。酶活定義:每毫克蛋白每分鐘使反應(yīng)體系的吸光度降低0.1為1個比酶活單位。

1.6.2 發(fā)酵及代謝物分析

細(xì)胞生長用分光光度計于600 nm處測定吸光值，細(xì)胞干質(zhì)量(DCW)換算公式為:ρ(DCW)=OD600×0.21。發(fā)酵液中相關(guān)代謝物質(zhì)的濃度用液相檢測。檢測條件:色譜柱為 Aminex HPX-87H(Bio-Rad公司)，流動相 0.005 mol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，柱溫35℃，檢測器紫外檢測器、示差折光檢測器，紫外檢測波長210 nm。琥珀酸檢測用紫外檢測器，乙酸、木糖檢測用示差折光檢測器。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于GSMM模型 iTL885的琥珀酸最佳合成途徑的設(shè)計

將對照菌FPLpy26于恒化培養(yǎng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，測定培養(yǎng)過程中細(xì)胞濃度及木糖濃度隨發(fā)酵時間變化規(guī)律。最大比生長速率(0.10 h－1)時，木糖比消耗速率為2.23 mmol/(g·h)。將木糖消耗速率和琥珀酸合成速率作為模型約束條件，以生物量方程為目標(biāo)方程，通過FBA計算獲得模型iTL885中不同琥珀酸合成途徑中代謝流量的分布，如圖1(a)所示，琥珀酸比合成速率為 8.9×10－3mmol/(g·h)。進(jìn)一步借助FBA模擬關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)處代謝改造對碳代謝流分布及琥珀酸合成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn):①過量表達(dá)異檸檬酸裂解酶基因icl1增加乙醛酸(TCA)循環(huán)代謝流量，琥珀酸合成速率從 8.9×10－3mmol/(g·h)增大到 0.02 mmol/(g·h)(圖 1(b));②敲除sdh1基因能阻斷三羧酸循環(huán)中琥珀酸的進(jìn)一步代謝，增大三羧酸循環(huán)-乙醛酸循環(huán)流量，琥珀酸合成速增加到0.15 mmol/(g·h)(圖1(c));③在過量表達(dá)icl1基因的同時敲除sdh1基因，可使琥珀酸合成速率提高到0.19 mmol/(g·h)(圖1(d))。

2.2 構(gòu)建高效合成琥珀酸的樹干畢赤酵母重組菌株

根據(jù)2.1模擬結(jié)果，提高樹干畢赤酵母生產(chǎn)琥珀酸產(chǎn)量的代謝工程策略包括:①過量表達(dá)異檸檬酸裂解酶基因;②敲除琥珀酸脫氫酶基因;③同時過量表達(dá)異檸檬酸裂解酶基因和敲除琥珀酸脫氫酶基因。本研究借助代謝工程策略構(gòu)建了樹干畢赤酵母重組菌株 FPLicl、FPLΔsdh 和 FPLΔsdh-icl。

2.2.1 構(gòu)建過量表達(dá)icl1的重組菌株FPLicl

以P.stipitis FPL-UC7基因組為模板，按照方法1.4.1進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，PCR和酶切電泳結(jié)果如圖2所示。由圖2可知:擴(kuò)增產(chǎn)物大小約1 700 bp，經(jīng)測序鑒定為P.stipitis icl1基因，無點(diǎn)突變。將擴(kuò)增片段和載體 pY26TEF-GPD進(jìn)行BamH I和EcoR I雙酶切，經(jīng)純化后連接、轉(zhuǎn)化。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，得到約7 430和1 700 bp大小的片段，分別為載體和基因片段，結(jié)果表明表達(dá)載體pY26-icl1構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒pY26-icl1轉(zhuǎn)化到P.stipitisFPL-UC7中構(gòu)建，獲得過量表達(dá)異檸檬酸裂解酶基因的重組菌株FPLicl。

2.2.2 構(gòu)建缺失sdh1基因的重組菌株FPLΔsdh

按照方法1.4.2敲除菌株FPL-UC7的sdh1基因，敲除步驟如圖3(a)所示。以FPL-UC7基因組為模板，分別擴(kuò)增得到琥珀酸脫氫酶(sdh1)的上下游800 bp的片段(加引物同源臂為825 bp)，以pUG72為模板擴(kuò)增出尿嘧啶基因片段1 050 bp(圖3(b))，測序結(jié)果與NCBI上對應(yīng)序列100%匹配。凝膠回收3段片段，通過融合PCR將3個片段連接起來，構(gòu)成敲除框，大小為2 600 bp(圖3(c))。將敲除框DNA片段轉(zhuǎn)化到P.stipitisFPL-UC7中，通過引物驗證轉(zhuǎn)化子基因敲除的正確性，構(gòu)建獲得重組菌株 FPLΔsdh。

2.2.3 構(gòu)建重組菌株FPLΔsdh-icl

首先對重組菌株FPLΔsdh進(jìn)行分子操作，按照1.4.3的方法敲除尿嘧啶基因，構(gòu)建琥珀酸脫氫酶和尿嘧啶雙重缺陷型重組菌株FPLΔsdhΔura。提取FPLΔsdh和轉(zhuǎn)化子基因組，用引物upper-F/lower-R進(jìn)行PCR驗證，出發(fā)菌擴(kuò)增出2 600 bp的DNA片段，重組菌株擴(kuò)增出1 600 bp的DNA片段，通過測序證明重組菌株FPLΔsdhΔura構(gòu)建完成，圖4為尿嘧啶敲除示意圖和PCR驗證電泳圖。然后將重組質(zhì)粒pY26-icl1轉(zhuǎn)化到 FPLΔsdhΔura感受態(tài)中，用SC篩選培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，提取質(zhì)粒驗證，獲得重組菌株 FPLΔsdh-icl。

2.3 重組菌株酶活測定

于30℃、200 r/min條件下將菌株培養(yǎng)到對數(shù)生長中期，取樣測定出發(fā)菌株和重組菌株中異檸檬酸裂解酶和琥珀酸脫氫酶的活性，結(jié)果列于表2。由表2可知:①重組菌株FPLicl中異檸檬酸裂解酶活性為(1.6±0.20)U/mg，是出發(fā)菌株的4.8倍，而琥珀酸脫氫酶活性則比出發(fā)菌株降低了22%，表明過量表達(dá)icl1基因?qū)p弱琥珀酸到富馬酸代謝途徑;②重組菌株FPLΔsdh琥珀酸脫氫酶活性較低，幾乎無法檢測;而異檸檬酸裂解酶酶活為(5.6±0.13)U/mg，是出發(fā)菌株的17倍;③重組菌株FPLΔsdh-icl的異檸檬酸裂解酶酶活為(6.6±0.17)U/mg，是出發(fā)菌株的20倍。

圖2 P.stipitis icl1基因PCR擴(kuò)增和質(zhì)粒pY26-icl1雙酶切驗證Fig.2 PCR amplification of icl1 gene and identification of pY26-icl1 by restriction endonuclease digestion

圖3 P.stipitis sdh1基因的敲除Fig.3 Deletion of sdh1 gene in P.stipitis

圖4 尿嘧啶敲除示意和敲除驗證電泳Fig.4 Disruption of ura gene with homologous recombination and PCR verification

表2 重組菌株和出發(fā)菌株中關(guān)鍵酶活性的測定Table 2 Specific activities of key enzymes in P.stipitis strains

2.4 重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸

將重組菌株 FPLicl、FPLΔsdh、FPLΔsdh-icl和出發(fā)菌株FPLpy26于5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗，其生產(chǎn)琥珀酸的發(fā)酵過程曲線如圖5所示，相關(guān)發(fā)酵參數(shù)列于表3。由表3可知:①與出發(fā)菌株相比，菌株FPLicl耗糖速率和菌株生長沒有發(fā)生變化，而發(fā)酵時琥珀酸質(zhì)量濃度為0.30 g/L，提高了6倍。副產(chǎn)物乙酸質(zhì)量濃度則從5.30 g/L(對照菌株)降為2.50 g/L，降低了53%。其原因在于icl1基因的過量表達(dá)，導(dǎo)致乙醛酸代謝流量增大，丙酮酸代謝支路流量減少;②菌株FPLΔsdh細(xì)胞生長并不受sdh1基因刪除所影響，但與出發(fā)菌株相比，琥珀酸質(zhì)量濃度達(dá)到1.2 g/L，糖耗速率降低26%，而副產(chǎn)物乙酸質(zhì)量濃度則增加了105%(10.9 g/L)。其原因在于sdh1基因缺失后TCA循環(huán)受阻，菌株糖代謝能力降低，與此同時，異檸檬酸裂解酶比酶活增大(表2)，導(dǎo)致乙醛酸循環(huán)代謝流量增大，乙酸合成途徑也成為重要的產(chǎn)能途徑［17］;③在缺失sdh1基因的同時過量表達(dá)icl1基因使琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到1.6 g/L，比菌株 FPLicl、FPLΔsdh分別提高了433%和25%;而副產(chǎn)物乙酸則比菌株FPLΔsdh減少30%。胞內(nèi)乙醛酸流量繼續(xù)增大，而乙酸代謝途徑流量相對減少，從而使琥珀酸產(chǎn)量進(jìn)一步提高，乙酸濃度降低。

圖5 對照菌和重組菌發(fā)酵結(jié)果比較Fig.5 Comparison of total xylose decrease，biomass，production of succinic acid and acetate between contract strain and recombinant strains

3 結(jié)論

借助樹干畢赤酵母全基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型iTL885對琥珀酸最佳合成途徑進(jìn)行設(shè)計，發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)icl1基因和敲除sdh1基因能有效地提高琥珀酸的產(chǎn)量。在此基礎(chǔ)上，借助代謝工程策略，構(gòu)建了重組菌株FPLicl(過量表達(dá)icl1基因)、FPLΔsdh(敲除sdh1基因)、FPLΔsdh-icl(過量表達(dá) icl1基因和敲除sdh1基因)。重組菌株異檸檬酸裂解酶和琥珀酸脫氫酶比酶活分別為1.6、5.6、6.6 U/mg和10.7、0.3、0.3 U/mg，而琥珀酸產(chǎn)量為0.30、1.20 和1.60 g/L，實(shí)現(xiàn)了琥珀酸的初步積累。目前國內(nèi)外還沒有代謝改造樹干畢赤酵母生產(chǎn)琥珀酸的相關(guān)報道，本文中筆者結(jié)合GSMM對樹干畢赤酵母進(jìn)行代謝改造，為以木糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)。

表3 重組菌株和對照菌株發(fā)酵參數(shù)的比較Table 3 Parameters of P.stipitis shake flask cultures with different strains

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