傅坤發(fā)，陸冰，劉曄，胡健，孔繁榮

（江蘇省老年醫(yī)院老年科，江蘇南京 210024）

·論著·

辛伐他汀對大鼠成骨細胞經(jīng)典Wnt信 號通路相關(guān)因子表達的影響

傅坤發(fā)，陸冰，劉曄，胡健，孔繁榮

（江蘇省老年醫(yī)院老年科，江蘇南京 210024）

目的觀察不同濃度、不同時間辛伐他汀對體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞經(jīng)典Wnt通路Wnt3a、LRP5和β-catenin的mRNA表達的影響，探討辛伐他汀抗骨質(zhì)疏松的可能機制。方法用酶消化法培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細胞，采用倒置相差顯微鏡及堿性磷酸酶染色和茜素紅染色觀察和鑒定成骨細胞。用濃度分別為10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L的辛伐他汀干預(yù)大鼠成骨細胞24 h、48 h和72 h，并設(shè)無辛伐他汀為對照組，采用RT-PCR檢測經(jīng)典Wnt信號通路Wnt3a、LRP5和β-catenin的mRNA表達情況。結(jié)果鏡下觀察及染色結(jié)果均顯示具有成骨細胞典型特征。RT-PCR結(jié)果顯示：10-5mol/L辛伐他汀組干預(yù)24 h后較對照組Wnt3a[(2.09±0.12)vs (1.82±0.09)]、LRP5[(1.42±0.07)vs(1.29±0.07)]和β-catenin[(1.10±0.06)vs(0.95±0.06)]的mRNA表達顯著增加；干預(yù)48 h和72 h后各組Wnt3a(F=37.78和96.52，P=0.000)、LRP5(F=10.32，P=0.001和F=22.02，P=0.000）的mRNA表達隨著辛伐他汀濃度的增大而顯著增加，β-catenin的mRNA表達較對照組顯著增加(F=6.67和21.90，P＜0.05)；10-8～10-5mol/L辛伐他汀各組中分別干預(yù)24 h、48 h和72 h，隨著干預(yù)時間延長Wnt3a和LRP5的mRNA表達均增加；干預(yù)48 h與24 h比較，β-catenin的mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義[(1.08±0.09)vs(1.02±0.06)，P＞0.05]，而干預(yù)72 h較24 h顯著增加[(1.23±0.10)vs(1.02±0.06)，P＜0.05]，且辛伐他汀濃度為10-6mol/L和10-5mol/L干預(yù)72 h較48 h顯著增加[(1.32±0.07)vs(1.11±0.05)和(1.47±0.08)vs(1.19±0.04)，P＜0.05]。結(jié)論辛伐他汀可促進體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞經(jīng)典Wnt信號通路Wnt3a、LRP5和β-catenin的mRNA表達。

辛伐他??；成骨細胞；經(jīng)典Wnt信號通路；骨質(zhì)疏松

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅老年人健康的一種疾病，迄今為止OP的發(fā)病機制尚未完全闡明。近年來發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt信號通路在成骨細胞的發(fā)育及分化過程中扮演重要角色，已成為骨質(zhì)疏松領(lǐng)域的研究熱點。目前治療OP的藥物大部分集中在靶向破骨細胞，以抑制骨吸收為主，促進成骨有限。研究表明他汀類藥物可通過多種途徑刺激體外培養(yǎng)的成骨細胞增殖和分化，促進骨合成代謝作用，但其機制仍在研究中。本研究通過觀察不同濃度辛伐他汀對體外培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細胞經(jīng)典Wnt信號通路的主要因子Wnt3a、LRP5和β-catenin的mRNA表達的影響，探討他汀類藥物影響骨代謝的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 出生24 h內(nèi)的SD大鼠6只，購自東南大學(xué)實驗動物中心，辛伐他汀(Simvastatin，SIM，杭州默沙東公司)，低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物公司)，0.25%胰酶(加EDTA)(Sigma公司)，Ⅱ型膠原酶(Gibco公司)，Trizol RNA提取試劑盒(Gibco公司)，PCR試劑盒(大連寶生物)，堿性磷酸酶染色試劑盒(南京建成生物工程研究所)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 成骨細胞的分離與培養(yǎng) 將新生24 h內(nèi)的SD大鼠放入75%酒精中浸泡消毒10 min，無菌操作取出顱蓋骨，置于4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)的培養(yǎng)皿中，清除骨膜、血管及結(jié)締組織，并用PBS液洗滌。將洗凈的顱蓋骨剪成1 mm×1 mm大小的骨片，用0.25%胰酶37℃消化20 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，再加入0.1%Ⅱ型膠原酶37℃消化1 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入5 ml含10%新生小牛血清的DMEN培養(yǎng)液，吹打均勻，接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察細胞并換液，以后每3 d換液1次，細胞融合后，用0.25%胰蛋白酶消化，以1:1的方式將細胞傳代，接種于另一培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，取第3代細胞進行實驗。

1.3 成骨細胞的鑒定 采用倒置相差顯微鏡(Olympus公司)觀察培養(yǎng)細胞的一般形態(tài)及生長情況；采用Gomori鈣鈷法行堿性磷酸酶染色，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作；細胞培養(yǎng)3周，采用茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)。

1.4 不同濃度辛伐他汀干預(yù)成骨細胞 細胞以2×104個/cm2密度加入25 cm2培養(yǎng)瓶中，24 h后換含濃度分別為10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L的辛伐他汀培養(yǎng)基，并設(shè)不含辛伐他汀的培養(yǎng)基為對照組，分別于24 h、48 h和72 h后采用Trizol法分別提取總RNA。

1.5 經(jīng)典Wnt信號通路相關(guān)因子mRNA檢測 培養(yǎng)結(jié)束后采用Trizol一步法提取各組細胞總RNA，按試劑盒說明操作?？俁NA經(jīng)電泳顯示28S、18S和5S三個條帶，RNA的完整性通過28S：18S判斷，于紫外分光光度計下讀取OD260/OD280的比值作為RNA的純度。定量后取2 μg，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，參照說明書進行操作。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μl為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系20 μl。根據(jù)目的基因在Gene Bank中的已知序列，設(shè)計引物(上海捷倍思基因技術(shù)有限公司)。經(jīng)典Wnt信號通路相關(guān)基因Wnt3a：上游引物5'-CATCGCCAGTCACATGCACC-3'，下游引物5'-CGTCTATGCCATGCGAGCTCA-3'；LRP5：上游引物5'-GACATTTACTGGCCCAATGG-3'，下游引物5'-CTGCCCTCCACCACCTTCT-3'；β-catenin：上游引物5'-GATTTGATGGAGTTGGACATGG-3'，下游引物5'-TGTTCTTGAGTGAAGGACTGAG-3'；內(nèi)參照β-actin：上游引物5'-GGCATCGTGATGGACTCCG-3'，下游引物5'-CGTGGAAGGTGGACAGCGA-3'。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，共35個循環(huán)。最后一個循環(huán)72℃延伸8 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用ImageMaster VDS圖像分析儀進行掃描，用Total Lab圖像分析軟件分析所得圖譜。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗結(jié)果均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。采用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠顱骨成骨細胞的鑒定結(jié)果 倒置相差顯微鏡下見培養(yǎng)的大鼠顱骨細胞有典型的成骨細胞特征，細胞貼壁生長，形狀多為三角形、多邊形、長梭形，以單核為主，有較多突起(見圖1A)；經(jīng)Gomori鈣鈷法染色后見胞質(zhì)中呈現(xiàn)灰黑色顆?；驂K狀沉淀(見圖1B)；鈣化結(jié)節(jié)染色后可見橘紅色的礦化結(jié)節(jié)形成(見圖1C)。

圖1 體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞形態(tài)及染色結(jié)果

2.2 辛伐他汀干預(yù)對大鼠成骨細胞經(jīng)典Wnt相關(guān)因子mRNA的影響 本研究所提取得總的RNA其吸光度值OD260/OD280在1.8～2.0之間，提示純度較好；其熒光強度比RNA 28S:18S=2:1，且條帶無彌散現(xiàn)象，提示RNA完整、無降解。

2.2.1 不同濃度辛伐他汀對于大鼠成骨細胞經(jīng)典Wnt信號通路的影響 不同濃度辛伐他汀干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞24 h后，與對照組比較，10-5mol/L組Wnt3a[(2.09±0.12)vs(1.82±0.09)]、LRP5 [(1.42±0.07)vs(1.29±0.07)]和β-catenin[(1.10±0.06) vs(0.95±0.06)]的mRNA表達顯著增加(P值分別為0.007、0.04和0.006)，其余濃度辛伐他汀組Wnt3a、LRP5和β-catenin的mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。不同濃度辛伐他汀干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞48 h和72 h后，與對照組比較，10-8～10-5mol/L各組Wnt3a、LRP5和β-catenin的mRNA表達均顯著增加，且隨著辛伐他汀濃度增大mRNA表達增多，除了β-catenin外(P＜0.05)，見表2、表3。

表1 不同濃度辛伐他汀干預(yù)24 h對大鼠成骨細胞經(jīng)典Wnt信號通路的影響（，n=3）

表1 不同濃度辛伐他汀干預(yù)24 h對大鼠成骨細胞經(jīng)典Wnt信號通路的影響（，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05

2.2.2 辛伐他汀干預(yù)時間不同對于大鼠成骨細胞經(jīng)典Wnt信號通路的影響 辛伐他汀濃度為10-8～10-5mol/L各組中分別干預(yù)24 h、48 h和72 h，隨著干預(yù)時間延長Wnt3a和LRP5的mRNA表達增加(各濃度組Wnt3a和LRP5統(tǒng)計結(jié)果分別為F=24.73，P=0.01和F=10.45，P=0.01；F=38.95，P=0.000和P=18.75，P= 0.003；F=83.06，P=0.000和F=28.41，P=0.001；F= 85.42，P=0.000和P=29.15，P=0.001)；干預(yù)48 h與24 h比較，β-catenin的mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義[(1.08±0.09)vs(1.02±0.06)，P＞0.05]，而干預(yù)72 h較24 h均顯著增加[(1.23±0.10)vs(1.02±0.06)，P＜0.05]，且辛伐他汀濃度為10-6mol/L和10-5mol/L干預(yù)72 h較48 h顯著增加[(1.32±0.07)vs(1.11±0.05)和(1.47±0.08)vs(1.19±0.04)，P＜0.05]，見圖2。

表2 不同濃度辛伐他汀干預(yù)48 h對大鼠成骨細胞經(jīng)典Wnt信號通路的影響(，n=3)

表2 不同濃度辛伐他汀干預(yù)48 h對大鼠成骨細胞經(jīng)典Wnt信號通路的影響(，n=3)

表3 不同濃度辛伐他汀干預(yù)72 h對大鼠成骨細胞經(jīng)典Wnt信號通路的影響（，n=3）

表3 不同濃度辛伐他汀干預(yù)72 h對大鼠成骨細胞經(jīng)典Wnt信號通路的影響（，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與相鄰低濃度組比較，bP＜0.05

組別對照組10-8mol/L SIM 10-7mol/L SIM 10-6mol/L SIM 10-5mol/L SIM F值P值Wnt3a/β-actin 1.98±0.07 2.36±0.09a2.53±0.06ab2.68±0.06ab3.05±0.06ab96.52 0.000 LRP5/β-actin 1.38±0.06 1.55±0.08a1.69±0.07ab1.76±0.08a1.93±0.08ab22.02 0.000 β-catenin/β-actin 1.00±0.05 1.14±0.06a1.22±0.07a1.32±0.07a1.47±0.08ab21.90 0.000

圖2 不同濃度辛伐他汀不同的干預(yù)時間對大鼠成骨細胞經(jīng)典Wnt信號通路的影響

3 討論

骨質(zhì)疏松(OP)的發(fā)生是成骨細胞和破骨細胞平衡失調(diào)引起的，即骨吸收超過了骨形成，涉及激素、細胞因子、機械應(yīng)力等多方面因素，迄今為止OP的發(fā)病機制尚未完全闡明，近年來，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt信號通路在骨代謝過程中具有重要意義。經(jīng)典Wnt信號通路是Wnt蛋白與其受體卷曲蛋白(Frz)和輔助受體LRP5/6結(jié)合形成復(fù)合物，然后Frz作用于胞質(zhì)內(nèi)的蓬松蛋白(Dvl-1)，Dvl-1使糖原合成GSK-3β，抑制β-catenin的降解，使胞質(zhì)內(nèi)β-catenin累積并轉(zhuǎn)入細胞核，與T細胞因子(TCF/LEF)相互作用激活靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)成骨細胞活性[1-2]。Shahnazari等[3]研究表明，在骨形成和骨代謝過程中Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮著極其重要的調(diào)控作用。Day等[4]發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt信號通路激活可以促進成骨細胞的形成，并且在軟骨形成過程中促進成骨細胞的分化。Hill等[5]發(fā)現(xiàn)阻斷間質(zhì)中Wnt/β-catenin信號通路后，會減少成骨細胞的分化和影響骨骼的發(fā)育。

他汀類調(diào)脂藥(Statins)是3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)抑制劑，除了具有降低膽固醇、保護內(nèi)皮功能、抗炎、抗氧化等多效性外，近年來發(fā)現(xiàn)他汀還具有激活成骨細胞、促進成骨細胞增殖、增加骨形成的作用，他汀在骨質(zhì)疏松方面的研究成為了當(dāng)前的熱點。最早發(fā)現(xiàn)他汀具有促進成骨作用是在1999年，Mundy等[6]通過體外實驗首先發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可以增加骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)mRNA的表達，說明其具有激活成骨細胞，促進骨合成代謝的作用。后來的臨床研究也證實他汀類藥物可降低骨折風(fēng)險[7]，增加骨密度[8]。但是其作用機制目前尚未完全闡明。有兩項研究顯示辛伐他汀在增加大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)[9]和胚胎干細胞(ESCs)[10]向成骨細胞分化過程中，會出現(xiàn)Wnt信號通路相關(guān)因子水平增高。本研究表明辛伐他汀干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞可促進其經(jīng)典Wnt信號通路中Wnt3a、LRP5和 β-catenin的mRNA表達，并且總體趨勢是呈濃度和時間依賴的，即辛伐他汀濃度越大，干預(yù)時間越長，促進上述基因表達越明顯，尤其是Wnt3a和LRP5。由于激活經(jīng)典Wnt信號通路可以促進成骨細胞活性和骨形成，本研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可以促進成骨細胞經(jīng)典Wnt信號通路主要因子的基因表達，其機制可能與他汀類藥物激活成骨細胞經(jīng)典Wnt信號通路有關(guān)，但由于本研究僅為mRNA水平檢測，尚待進一步研究。

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Effect of simvastatin on the related factors in expression of canonical Wnt signaling pathway in osteoblasts of rats.

FU Kun-fa,LU Bing,LIU Ye,HU Jian,KONG Fan-rong.
Department of Geriatrics,Jiangsu Province Geriatric Hospital,Nanjing 210024,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of different concentrations,multi-treatment course of simvastatin on the mRNA expression of Wnt3a,LRP5 and β-catenin in osteoblasts of rats and the potential mechanism. MethodsOsteoblasts were obtained from calvaria.Morphology of osteoblasts was observed under phase contrast microscope after ALP staining and Alizarin red staining.Rat osteoblasts were treated by different concentrations of simvastatin(10-8mol/L,10-7mol/L,10-6mol/L and 10-5mol/L),and Wnt3a,LRP5 and β-catenin mRNAexpression were detected using RT-PCR after 24 h,48 h and 72 h.ResultsThe cultured cells had the typical features of osteoblasts.Comparedwith that in control group,the result of RT-PCR showed that the expression of Wnt3a[(2.09±0.12)vs(1.82±0.09)],LRP5 [(1.42±0.07)vs(1.29±0.07)]and β-catenin[(1.10±0.06)vs(0.95±0.06)]mRNA in 10-5mol/L simvastatin group treated after 24 h,and those of Wnt3a(F=37.78 and 96.52,P=0.000)and LRP5(F=10.32,P=0.001 and F=22.02,P=0.000) increased significantly with the increase of concentration of simvastatin in each group treated after 48 h and 72 h(P＜0.05).After 24 h,48 h and 72 h intervention,the expression of Wnt3a and LRP5 mRNA increased significantly in each group as the intervention time got longer.In group 10-6mol/L and 10-5mol/L,compared with that after simvastatin intervention 48 h,β-catenin mRNA expression increased significantly after 72 h[(1.32±0.07)vs(1.11±0.05)and (1.47±0.08)vs(1.19±0.04),P＜0.05].ConclusionSimvastatin could promote Wnt3a,LRP5 and β-catenin mRNA gene's expression of canonical Wnt signaling pathway in osteoblast of rats.

Simvastatin;Osteoblasts;Canonical Wnt signaling pathway;Osteoporosis

R-332

A

1003—6350（2014）22—3286—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.22.1290

2014-06-12)

傅坤發(fā)。E-mail：fukunfa@hotmail.com