孫王偉，周燕菊，謝怡萍，沙霞，王建軍

（昆山市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇昆山 215300）

·論著·

PCR 直接測序法在膿腫分枝桿菌鑒定中的應用

孫王偉，周燕菊，謝怡萍，沙霞，王建軍

（昆山市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇昆山 215300）

目的探討聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)與DNA測序技術鑒定膿腫分枝桿菌的效果。方法利用細菌16S rRNA基因通用引物PCR擴增疑似分枝桿菌的16S rRNA基因的DNA片段并進行DNA測序分析。DNA測序獲得序列經生物信息學比對分析獲得相關分枝桿菌的信息；針對相關分枝桿菌分別設計非同源區(qū)域特異性引物對1 500 bp的克隆DNA片段擴增驗證。結果細菌16S rRNA基因通用引物擴增獲得約1 500 bp的DNA片段，但DNA測序僅獲得其中部分DNA序列約296 bp；部分DNA序列經生物信息學比對分析后獲得四種同源性高達98%的分枝桿菌信息，并且四種分枝桿菌的特異性引物對1 500 bp的克隆產物進行擴增后僅在膿腫分枝桿菌中獲得特異性PCR產物。結論疑似結核患者體內的抗酸染色陽性菌為非結核分枝桿菌中的膿腫結核分枝桿菌，并且PCR直接測序法可快速鑒定細菌的種屬。

聚合酶鏈式反應；DNA測序；16S rRNA；生物信息學；膿腫分枝桿菌

非結核分枝桿菌(Non-Tuberculous mycobacteria，NTM)是結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的分枝桿菌，而膿腫結核分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)屬于其中IV群的快生長菌[1]。近年來NTM在我國引發(fā)了多起院內感染，大多由于手術器械被污染、創(chuàng)口污染等導致暴發(fā)，而目前尚無特異高效的抗NTM藥物且NTM病治療較為棘手并且預后不佳[2]。膿腫分枝桿菌主要可導致患者肺部與皮膚感染，以咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、肉芽腫等癥狀為主。膿腫分枝桿菌對臨床上常用的大多數抗結核藥物均有耐藥性，且治療過程長而差，因此臨床快速、準確的鑒定菌種及藥敏情況分析，對疾病的治療具有關鍵作用[3]。PCR是一種以核酸生物化學為基礎的分子生物學診斷技術，在生物醫(yī)學領域最有應用價值，對結核分枝桿菌的診斷、菌種類型的鑒定有較高的靈敏度和特異性。本研究采用PCR-直接測序鑒定法，利用細菌16S rRNA基因的通用引物對分枝標本進行擴增，獲得產物后直接DNA測序，生物信息學分析確定分枝桿菌的種類。

1 材料與方法

1.1 研究對象久治不愈疑似結核患者的痰標本。

1.2 主要試劑正常熔點瓊脂糖、低熔點瓊脂糖和碘化丙啶購于Sigma公司(美國)，抗酸染色試劑、羅氏培養(yǎng)基和基因組DNA提取試劑購自碧云天公司，DNA聚合酶購自Takara公司。

1.3 抗酸染色取少量痰標本高壓蒸汽滅菌后涂片，石炭酸復紅初染1 min，3%鹽酸酒精脫色1 min，堿性美蘭復染1 min，細水沖洗后自然晾干，高倍鏡觀察并拍照保存。

1.4 基因組DNA提取1 ml痰標本中加入3倍體積的4%NaOH，震蕩混勻20 s，放置15 min，7 800×g離心10 min，去上清，加入生理鹽水1 ml，混勻，7 800×g離心10 min，去上清液；加入100 μl DNA提取液，100℃加熱10 min，迅速冷卻(置于-20℃冰箱)10 min，7 800×g離心2 min，0.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，其余-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物序列根據NCBI數據庫檢索以下基因的cDNA序列Premier 5軟件設計引物并合成，見表1。

表1 設計合成的引物序列

1.6 16S rDNA PCR50 μ l PCR體系中含cDNA 5 μl，rTaqDNA聚合酶2.0 μl，10 mmol/L上游引物1 μl，10 mmol/L下游引物1 μl，2.5 mmol/L dNTPs 4 μl，無核糖核酸酶水32 μl，10×PCR緩沖液5 μl；95℃預變性7 min，94℃變性1 min，62℃退火1 min，72℃延伸1 min，72℃終延伸10 min，共30個循環(huán)，1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。

1.7 生物信息學分析PCR產物送北京鼎國昌盛生物技術公司測序，將獲得的DNA序列在NCBI數據庫中進行BlastN分析比對，獲得四種同源度高達98%的分枝桿菌。利用Primer 5軟件在四種分枝桿菌的非同源區(qū)域設計并合成特異性引物，對16S rDNA的PCR產物進行PCR擴增驗證。

1.8 四種特異性引物PCR50 μl PCR體系中含模板DNA 5 μl，TaqDNA聚合酶1.0 μl，10 mmol/L上游引物1μl，10 mmol/L下游引物1μl，2.5 mmol/L dNTPs 4 μl，無核糖核酸酶水33 μl，10×PCR緩沖液5 μl；94℃預變性2 min，94℃變性30 s，54℃退火35 s，72℃延伸35 s，72℃終延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。

2 結果

2.1 抗酸染色取適量高壓蒸汽滅菌后的痰液抗酸染色，高倍鏡下尋找觀察抗酸染色菌，見圖1。

圖1 痰液抗酸染色結果(×1 000)

2.2 基因組DNA提取高壓蒸汽滅菌后的痰液，根據MTB DNA檢測試劑盒方法-煮沸裂解法提取抗酸分枝桿菌基因組DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，見圖2。

圖2 抗酸分枝桿菌基因組DNA電泳結果

2.3 16S rDNA PCR擴增以抗酸分枝桿菌基因組DNA為模板，16S rDNA細菌通用基因引物PCR擴增特異性片段并1.5%瓊脂凝膠電泳分析，見圖3。

2.4 PCR產物測序結果細菌16S rDNA通用引物PCR擴增獲得的產物，純化濃縮后送北京鼎國昌盛生物技術公司多次測序，僅獲得296 bp的DNA序列：

TGCAGTCGACGGAAGGCCTTCGGGGTACTCGA GTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATC TGCCCTGCACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTG GGTCTAATACCGGATAGGACCACACACTTCATG GTGAGTGGTGGTGCAAAGCTTTTGGTGTGGGA GGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCAC ACTGGGACTGAAATACGGTCCATACTCCCTAC GGGAGGCAGCAGTGAGG

圖316 S rDNA引物PCR產物電泳結果

2.5 生物信息學分析測序獲得的296 bp DNA序列在NCBI數據庫（http://ncbi.nlm.nih.gov/ nucleotide）BlastN軟件中與微生物核酸數據庫進行比對分析獲得如下結果，見圖4。

圖4 296 bp DNA測序序列在NCBI數據庫blastn結果

2.6 四種特異引物驗證針對與測序獲得的四種高達98%的同源序列的非同源區(qū)域分別設計特異性引物，利用該四種引物對細菌16S rDNA通用引物的PCR產物再次進行PCR擴增，見圖5。

圖5 四種特異性引物PCR產物電泳結果

3 討論

傳統(tǒng)的分枝桿菌生化鑒定耗時且準確性差。近年來，PCR和DNA堿基序列測定技術得到迅速發(fā)展，這兩種技術的結合為細菌的分類與鑒定提供了一種快速、準確的方法[4]。16S rRNA基因被稱為細菌的活化石，為高度保守基因，其進化速度十分緩慢，據測算1%堿基的取代需要大約50×106年，因而使其具有生物鐘的特點，16S rRNA基因序列具有細菌屬、種的特征，因而16S rRNA基因測序已作為細菌分類和鑒定的金標準[5]。目前已知分枝桿菌的16S rRNA基因已經全部測序。通過基因比較分析，發(fā)現(xiàn)分枝桿菌16S rRNA基因既含有屬特異的保守序列，又含有種特異性的高變區(qū)。以16S rRNA基因為靶基因，采用PCR-測序方法，通過序列的分析可以鑒定病原菌[6]。目前16SrRNA商品試劑盒可以成功擴增出人結核分枝桿菌的序列，但應用在非結核分枝桿菌中較少，本研究中用16S rRNA基因的通用引物PCR擴增疑似結核病人痰標本，獲得一段1 500 bp的產物，經DNA測序僅獲得部分DNA序列，然而多次重復實驗測序僅獲得296 bp的DNA序列，存在以下幾種可能：(1) 16S rRNA雖然是微生物基因組的通用序列，但不一定適合每一種微生物基因組片段的擴增如膿腫分枝桿菌；(2)在測序過程出現(xiàn)某些問題導致未能測出全長序列。一般情況下，16S rRNA基因的通用引物PCR擴增獲得的產物經測序可獲得全部的DNA序列，經生物信息學分析可以獲得該菌種的信息，從而確定細菌的屬、種。本研究中296 bp的DNA序列經生物信息學比對分析獲得了四種同源性高達98%的分枝桿菌，但無法具體確定患者的分枝桿菌到底是哪一種。因此，針對該四種序列與296 bp DNA序列的非同源序列設計了四種特異性引物，利用四種引物對16S rRNA擴增獲得的產物重新進行PCR擴增，若獲得產物即說明296 bp DNA序列為四種分枝桿菌序列中的一種，也就可以確定該分枝桿菌為哪種分枝桿菌。最終，膿腫分枝桿菌特異性引物在長度為1 500 bp的PCR產物中擴增出了250 bp左右的特異性條帶。從而確定了該結核患者體內的病原菌為膿腫分枝桿菌。

PCR和測序可以在1～2 d完成，而常規(guī)臨床分枝桿菌分離株的鑒定需要1個月時間，因此基因擴增與測序技術鑒定分枝桿菌可以大大節(jié)約時間，使患者得到及時正確的治療。

[1]趙建宏,李雅靜,溫海楠,等.非結核分枝桿菌感染的分子診斷研究進展[J].檢驗醫(yī)學,2012,3(11):155-158.

[2]Wu TS,Lu CC,Lai HC.Current situations off identification of nontuberculous mycobacteria[J].J Biomed Lab Sci,2009,21(1):1-5.

[3]馬小波,梁朝霞,徐慶雷,等.11例非結核分枝桿菌耐藥性分析[J].檢驗醫(yī)學與臨床,2010,24(7):2748-2749.

[4]Ngan GJ,Ng LM,Jureen R,et a1.Development of multiplex PCR assays based on the 16S-23S rDNA internal transcribed spacer for the detection of clinically relevant nontuberculous mycobacteria[J]. LettAppl Microbiol,2011,52(5):546-554.

[5]Khan IU,Selvaraju SB,Yadav JS.Method for rapid identification and differentiation of the species of the Mycobacterium chelonae rRNA geneinternalrestrictionanalysiscomplexbasedon 16S-23S transcribed spacer PCR[J].J Clin Microbiol,2005,43(9): 4466-4472.

[6]彭濤,溫博海,蹇銳.分支桿菌臨床分離株的16S rDNA基因序列分析[J].中國人獸共患病雜志,2004,20(9):772-776.

Application of PCR and direct sequencing technologies in the identification of Mycobacterium abscessus.

SUN Wang-wei,ZHOU Yan-ju,XIE Yi-ping,SHA Xia,WANG Jian-jun.
Department of Laboratory,the First People's Hospital of Kunshan,Kunshan 215300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo explore the identification of Mycobacterium abscessus with PCR,direct sequencing approaches and bioinformatics.MethodsDNA fragments of 16S rRNA gene were acquired using PCR and DNA sequence obtained by DNA sequencing.DNA about Mycobacterium was analyzed by bioinformatics.Specific primers of non-homologous region for relevant branches Bacillus were designed respectively to clone DNA fragment of 1 500 bp product.ResultsDNA fragment of 1 500 bp was acquired with PCR,but only a part of the DNA sequence of approximately 296 bp was obtained.After DNA sequence bioinformatics analysis,four kind of Mycobacterium with homology of up to 98%were obtained.Finally,we only obtained PCR special product in M.abscessus when four kinds of spe-cific primers for Mycobacterium were used to clone the DNA fragment of 1 500 bp.ConclusionThe Mycobacterium in the suspected TB patients is M.abscessus,and species of bacteria can be identified rapidly by PCR and direct sequencing approaches.

Polymerase chain reaction;DNA sequencing;16S rDNA;Bioinformatics;Mycobacterium abscessus

R378.91

A

1003—6350（2014）22—3342—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.22.1308

2014-04-23)

昆山市科技計劃項目（編號：KS1347）

王建軍。E-mail：wangjianjun0520@163.com