陳淑萍，符生苗，周紅桃，蔡俊宏，李成學，王福利，許茂軒

(1.海南大學農學院，海南?？?70228；2.海南省人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，海南 ?？?570311；3.南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，廣東 廣州 510280)

·論著·

Survivin基因及CDK1基因聯(lián)合靶向shRNA真核表達載體的構建

陳淑萍1，符生苗2，周紅桃3，蔡俊宏2，李成學2，王福利2，許茂軒1

(1.海南大學農學院，海南?？?70228；2.海南省人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，海南 ?？?570311；3.南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，廣東 廣州 510280)

目的構建靶向Survivin基因及CDK1基因的短發(fā)夾樣RNA(Short hairpin RNA，shRNA)真核表達載體。方法根據Genbank報道的Survivin序列及CDK1序列，遵循shRNA設計原則設計并合成各自靶向的Survivin、CDK1基因的shRNA寡核苷酸序列，構建pU6-shRNA-Survivin重組質粒、pU6-shRNA-CDK1重組質粒及pU6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1雙基因序列串聯(lián)重組質粒，并進行限制性內切酶酶切及基因測序鑒定。結果經酶切及測序結果分析，pU6-shRNA-Survivin重組質粒、pU6-shRNA-CDK1重組質粒及pU6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1雙基因系列串聯(lián)重組質粒均成功構建。結論成功構建Survivin基因及CDK1基因聯(lián)合靶向shRNA重組質粒，為進一步研究Survivin基因和CDK1基因聯(lián)合干擾提供了新的方法。

Survivin基因；CDK1基因；短發(fā)夾樣RNA；pU6-M4

Survivin為耶魯大學的Ambrosini等[1]發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis，IAP)家族的一個新成員，是迄今為止發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子，其功能復雜，能與數(shù)量極其眾多的分子、調節(jié)因子、翻譯網絡、修飾因子相互作用并影響這些分子的表達與調控[2]。Survivin在腫瘤細胞中高表達，而在正常細胞中低表達，并與腫瘤患者的不良結局相關[3]，因而以Survivin為靶向的抗腫瘤研究成為近十余年來的研究熱點。CDK1是細胞周期依賴性蛋白激酶(Cyclin-dependent kinases，CDKs)一個高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也被稱為p34cdc，可以對Survivin的34位點蘇氨酸殘基進行磷酸化，也在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，因此CDK1具備靶向抗腫瘤的潛質[4-5]。短發(fā)夾樣RNA (Short hairpin RNA，shRNA)干擾技術可以使細胞出現(xiàn)靶基因沉默[6]，具有高特異性、高效性、低毒性等特點，現(xiàn)已廣泛應用于生物醫(yī)學研究的各個領域，為快速下調靶基因表達的有效手段之一。shRNA干擾技術有望成為治療腫瘤治療的新手段，但仍需解決諸多問題以提高療效，其中就有通過多個基因的聯(lián)合干擾的方法。本研究采用一個pU6-M4載體攜帶兩個shRNA目的基因，構建Survivin基因及CDK1基因聯(lián)合靶向shRNA真核表達載體，同時針對Survivin與CDK1的shRNA聯(lián)合干擾目前還未見報道，為進一步研究Survivin基因和CDK1基因聯(lián)合干擾提供了新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料pU6-M4質粒由美國國家癌癥研究所的Dolph L.Hatfield惠贈，該質粒含抗氨芐青霉素(Amp)基因、耐潮霉素(Hygro)基因及U6啟動子。感受態(tài)Trans5α購自北京全式金生物技術有限公司。T4連接酶及各種限制性內切酶(BamHⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、MfeⅠ、EcoRⅠ)均購自Fermentas公司。DNA快速凝膠回收試劑盒及質粒小提試劑盒均構自QIAGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 靶向Survivin、CDK1基因shRNA的設計根據Genbank報道的Survivin序列(NM_ 001012271，NM_001012270，NM_001168)、CDK1序列(NM_001170406，NM_001170407，NM_033379，NM_ 001786)，遵循shRNA設計原則及BLAST同源分析，再利用Ambion公司網站提供的在線軟件設計出針對Survivin及CDK1共同基因編碼區(qū)的shRNA寡核甘酸序列，包含發(fā)夾結構環(huán)，在首末端加上BamHⅠ/HindⅢ酶切位點，便于連接到質粒上，形成BamHⅠ+ sense+loop+anti-sense+終止信號+HindⅢ。通過預實驗我們選擇具有效應的shRNA-Survivin、shRNA-CDK1各兩對，其正義鏈和反義鏈序列見表1。表中序列由武漢晶賽生物工程技術公司合成。

表1 shRNA-Survivin、shRNA-CDK1的模板序列

1.2.2 構建pU6-shRNA-Survivin、pU6-shRNA-CDK1重組質粒及鑒定各取1 μl正義鏈寡核苷酸(1.0 mg/ml)、反義鏈寡核苷酸(1.0 mg/ml)+18 μl× TE buffer，上PCR儀，程序為95℃，5 min，每10 s降0.1℃至室溫，使兩條互補單鏈退火為雙鏈。用BamHⅠ、HindⅢ限制性內切酶雙酶切pU6-M4質粒載體，1%瓊脂糖凝膠分析酶切產物，并用Qiagen QIA快速凝膠提取試劑回收大片段。shRNA退火的寡核苷酸片段1 μl分別與線性化的pU6-M4質粒表達載體連接，室溫放置20 min，然后冰上冷卻2 min。取連接反應物3 μl轉化感受態(tài)細胞Trans5α，分別涂布于含Amp抗性(終濃度為50 μg/ml)的LB固體平板上37℃孵育過夜。次日從每個平板挑取2～3個克隆分別接種于5 ml的含50μg/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基上，37℃以200 rpm速度培養(yǎng)箱中過夜。由于插入的片段比較小，瓊脂糖凝膠電泳較難區(qū)分，直接將菌液送去測序，使用Rev2.0(5'-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3')引物鑒定shRNA載體序列正確。

1.2.3 pU6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1雙基因序列串聯(lián)重組質粒的構建及鑒定用限制性內切酶XhoⅠ和MfeⅠ消化pU-shRNA-Survivin，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶消化pU-shRNA-CDK1，37℃水浴孵育1 h。1%瓊脂糖凝膠分析酶切產物，并用Qiagen QIA快速凝膠提取試劑回收4.9 kb大小pU-shRNA-Survivin及400 bp大小U6-shRNA-CDK1的片段，用T4連接酶連接。取連接反應物3 μl轉化感受態(tài)細胞Trans5α，分別涂布于含Amp抗性(終濃度為50 μg/ml)的LB固體平板上37℃孵育過夜。次日從每個平板挑取2～3個克隆分別接種于5 ml的含50 μg/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基上，37℃以200 rpm速度培養(yǎng)箱中過夜，提取質粒。用EcoRI和HindⅢ酶切鑒定U6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1片段約800 bp，用HindⅢ和XhoⅠ酶切鑒定U6-shRNA-Survivin、U6-shRNA-CDK1片段各約400 bp。菌液送測序鑒定。

2 結果

2.1 pU6-shRNA-Survivin、pU6-shRNA-CDK1重組質粒的測序結果對4個重組質粒進行測序，結果顯示與設計的shRNA寡核苷酸序列一致，說明pU6-shRNA-Survivin、pU6-shRNA-CDK1重組質粒構建成功(圖1～4)。

2.2 pU6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1雙基因序列串聯(lián)重組質粒酶切鑒定結果及測序結果根據質粒的結構及多克隆位點分析，串聯(lián)重組的質粒經EcoRⅠ和HindⅢ酶切鑒定，可以切出U6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1片段約800 bp及4.5 kb的大片段(圖5)。用HindⅢ和XhoⅠ酶切鑒定，可以切出U6-shRNA-Survivin、U6-shRNA-CDK1片段各約400 bp，這兩個片段重疊在400 bp處及4.5 kb的大片段(圖5)。經酶切鑒定分析，pU6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1符合酶切設計要求。測序結果顯示插入的雙基因序列正確。

圖1 shRNA-Survivin-1寡核苷酸測序結果

圖2 shRNA-Survivin-2寡核苷酸測序結果

圖3 shRNA-CDK1-1寡核苷酸測序結果

圖4 shRNA-CDK1-2寡核苷酸測序結果

圖5 質粒酶切后的2%凝膠電泳圖

3 討論

shRNA干擾技術是將與靶mRNA配對的含有發(fā)夾狀結構的RNA序列通過載體轉入細胞，利用U6啟動子確保shRNA表達并能傳給子代細胞，shRNA在胞漿內被Dicer酶裂解成21～25個堿基對的兩端有少數(shù)未配對突出堿基的干擾RNA(siRNAs)，這些siRNAs解鏈成單鏈并整合到活化的RNA誘導沉默復合物(RICS)上，整合后的siRNA堿基與靶mRNA配對，干擾靶mRNA，從而阻止其作為模板進行翻譯，使細胞出現(xiàn)靶基因沉默現(xiàn)象，即出現(xiàn)RNA干擾效應(RNAi)[6]。RNAi雖較基因敲除效果稍差，但操作簡便，有研究表明其干擾抑制效應比反義核酸技術效果好[7]，是簡便快速下調靶基因表達的有效手段之一。RNA干擾技術有望成為腫瘤治療新的手段之一，但仍需解決諸多問題以提高療效。一方面可以通過多個基因的聯(lián)合干擾以提高療效，這得益于載體的改進，目前已有一些載體能同時攜帶針對多個基因或一個基因多個靶點的多個shRNA，用于RNA干擾[8-9]。同時沉默兩個基因的亦有報道，如Survivin基因聯(lián)合FasL基因同時干擾具有協(xié)同增強作用[10]，Survivin基因聯(lián)合Livin基因同時干擾具有協(xié)同減弱作用[11]，本研究是同時針對Survivin與CDK1的shRNA聯(lián)合干擾目前還未見報道，這為腫瘤治療提供新思路。

研究發(fā)現(xiàn)Survivin具備以下功能：(1)影響細胞分裂：Survivin為染色體信使蛋白復合物(CPC)中的一員，與其他的染色體信使蛋白相互作用，在染色體對齊、生物定位、組蛋白H3磷酸化、紡錘體形成及運動等多種機制中起作用，Survivin蛋白缺失或功能異常都會干擾有絲分裂進程，與著絲粒/紡錘體分離異常及多倍體細胞形成相關[2，12]；(2)Survivin抑制細胞凋亡：Survivin通過提高細胞死亡門檻，與其他眾多分子相互作用及影響線粒體動力學等機制產生抗細胞凋亡效應[2，12]。Survivin在多種腫瘤細胞高表達，并隨著腫瘤細胞惡性程度增高而表達增加，與抗腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤組織血管增生及腫瘤細胞抵抗放療、化療療效相關，與腫瘤患者的不良結局相關[3，13]。干擾Survivin基因表達的實驗顯示毒性作用輕微，對移植瘤模型小鼠正常的組織器官功能影響小，安全性高，為臨床癌癥患者進行Survivin基因表達及其功能干預治療提供了安全保證及醫(yī)學倫理學上的可行性[14-15]。CDK1可以對Survivin的34位點蘇氨酸殘基進行磷酸化。Rachel等[16]通過siRNA干擾技術耗竭細胞內源性Survivin，然后引入非磷酸化的Survivin(T34A)及磷酸化狀態(tài)的Survivin(T34E)，證實此位點的磷酸化狀態(tài)直接影響下游的凋亡程序，顯示表達T34A Survivin的細胞比未引入突變Survivin的細胞增殖更快，而表達T34E Survivin的細胞增殖比未引入突變Survivin的細胞增殖慢，另對表達Survivin、Survivin (T34A)和Survivin(T34E)的Hela細胞系用不同劑量放射線照射，結果顯示表達Survivin(T34E)的細胞死亡率最低，說明Survivin(T34E)具有顯著的保護細胞的功能。Nathan等[17]用Flavopiridol抑制MCF-7乳腺癌細胞系Survivin 34位點的磷酸化,導致Survivin水平降低，細胞凋亡增加，此現(xiàn)象可能是由于T34位點磷酸化受阻影響一些潛在蛋白(如泛素)與Survivin結合，從而影響Survivin的穩(wěn)定性所致。本研究采用一個pU6-M4質粒載體攜帶兩個shRNA的干擾技術，成功構建Survivin和CDK1基因聯(lián)合靶向的shRNA重組表達載體，為進一步探討同時下調腫瘤細胞中的Survivin和CDK1基因的表達是否具有協(xié)同增強干擾效應提供了條件，也為腫瘤靶向基因治療的可行性提供新的思路。

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Constructing recombinant survivin and CDK1 tandem shRNAs pU6-M4 plasmid.

CHEN Shu-ping1,FU Sheng-miao2,ZHOU Hong-tao3,CAI Jun-hong2,LI Cheng-xue2,WANG Fu-li2,XU Mao-xuan1.1.College of Agriculture,Hainan University,Haikou 570228,Hainan,CHINA;2.Center of Medical Laboratory,People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA;3.Center of Medical Laboratory,Zhujiang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510280,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo construct recombinant survivin and CDK1 tandem shRNAs pU6-M4 plasmids.MethodsSequences of survivin and CDK1 and the restriction enzyme cutting sites of them were designed and synthesized based on the date from GeneBank.Recombinant plasmids of pU6-M4-Survivin-shRNAand pU6-M4-CDK1-shRNA were constructed and identified.Two determined plasmids were digested by restriction endonucleases then taped by T4 DNA ligase.The ligated products were transformed into competent TH5a cells,and then the recombinant clones were identified by sequencing.ResultsRestriction enzyme cleave identification and sequencing proved that recombinant survivin and CDK1 tandem shRNAs pU6-M4 plasmids were successfully constructed.ConclusionRecombinant survivin and CDK1 tandem shRNAs pU6-M4 plasmids were correctly constructed.

Survivin;Cyclin-dependent kinase 1;Short hairpin RNA;pU6-M4

R394

A

1003—6350（2014）13—1873—05

2014-02-11)

國家自然科學基金資助項目（編號：81060223）

符生苗。E-mail：smfu2000@126.com