張海娟，楊玉秀

(石家莊市第四醫(yī)院，石家莊050017)

自1971年Friend等發(fā)現(xiàn)二甲基亞砜可誘導(dǎo)小鼠紅白血病細(xì)胞分化為成熟紅細(xì)胞而產(chǎn)生血紅蛋白以來，誘導(dǎo)分化作為一種治療惡性腫瘤的有效方法引起了人們的重視。維甲酸類化合物是常用的誘導(dǎo)分化劑，對(duì)多種惡性腫瘤具有誘導(dǎo)分化、抑制增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［1］。全反式維甲酸(ATRA)是維生素A的天然衍生物及生物活性形式，能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞分化或抑制腫瘤細(xì)胞增殖［2］。為探討ATRA對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑制增殖和誘導(dǎo)分化作用，2009年1～12月，我們進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌SKOV3細(xì)胞株購自北京大學(xué)人民醫(yī)院。RPMI-1640培養(yǎng)基購自GIBCO BRL公司;MTT購自Singma公司。鼠抗人分化相關(guān)基因1(NDRG1)單克隆抗體購自DBS公司;SP試劑盒和DAB顯色劑購自北京中山生物公司。ATRA購自Sigma公司;酶標(biāo)儀購自Absystems Dragon公司;流式細(xì)胞分析儀購自BD Facscalibur公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 以1×10－6mol/L的ATRA處理人卵巢癌 SKOV3細(xì)胞 1、2、3、5 d為實(shí)驗(yàn)組，不加ATRA處理細(xì)胞為對(duì)照組。將SKOV3細(xì)胞置于RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入10%的新生牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)用50 mL培養(yǎng)瓶，在5%CO2、37℃飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)匯合狀態(tài)時(shí)，用0.04%EDTA消化后傳代。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定 采用MTT比色法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化后加培養(yǎng)液吹打均勻，以1×105/mL細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，24 h后加入ATRA儲(chǔ)存液，并用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)終濃度為1×10－6mol/L。實(shí)驗(yàn)組每組設(shè)6復(fù)孔，24 h更換培養(yǎng)液，分別將ATRA作用1、2、3、5 d后的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，向每孔培養(yǎng)液中加入5 mg/mL的MTT 20 μL，小心吸去上清，4 h后每孔加150 μL DMSO液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度(A值)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照孔。

1.2.3 細(xì)胞周期分布檢測(cè) 收集兩組懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)不低于1×106個(gè)，離心后棄上清，用冷PBS漂洗，冷乙醇固定，在4℃冰箱中過夜。次日離心棄乙醇，用PBS漂洗后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。

1.2.4 SKOV3細(xì)胞中的NDRG1蛋白表達(dá)檢測(cè)采用免疫組化SP法。取兩組細(xì)胞爬片標(biāo)本，嚴(yán)格按照試劑盒說明檢測(cè)兩組NDRG1蛋白表達(dá)。用冷丙酮固定，PBS沖洗，1%的Triton修復(fù)暴露抗原，10%山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn);滴加適當(dāng)稀釋的一抗，置37℃溫箱孵育2 h或4℃冰箱過夜，依次滴加二抗、三抗，行DAB顯色、蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在倒置顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞形態(tài)變化，NDRG1蛋白表達(dá)陽性著色呈棕黃色或黃色顆粒，位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核周圍。每組隨機(jī)選取30個(gè)視野，用雙評(píng)分半定量法評(píng)分:①按陽性細(xì)胞百分率計(jì)分:陽性細(xì)胞百分率≤5%計(jì)0分，6% ～25%記1分，26% ～50%計(jì)2分，51% ～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。②按染色強(qiáng)度計(jì)分:無著色計(jì)0分，淡棕黃色或黃色計(jì)1分，棕黃色或黃色計(jì)2分。兩項(xiàng)合并得0分為陰性(－)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，5～6分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示，組間比較用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用百分比表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATRA作用不同時(shí)間點(diǎn)的A值比較 見表1。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)的A值均明顯低于對(duì)照組(P均＜0.05);實(shí)驗(yàn)組 ATRA 作用后1、2、3、5 d，其細(xì)胞增殖抑制率分別為 16.7%、20.9%、23.1%、28.6%，兩兩比較P均＜0.05。

表1 兩組ATRA作用不同時(shí)間點(diǎn)的A值比較(±s)

表1 兩組ATRA作用不同時(shí)間點(diǎn)的A值比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05

組別ATRA作用后A值1 d 2 d 3 d 5 d對(duì)照組0.30 ±0.08 0.48 ±0.05 0.52 ±0.02 0.63 ±0.09實(shí)驗(yàn)組 0.25 ±0.03*0.38 ±0.06*0.40 ±0.09*0.45 ±0.04*

2.2 兩組細(xì)胞周期比較 對(duì)照組細(xì)胞周期為G1/G0期(50.1 ±0.9)%、S期(28.4 ±0.25)%;實(shí)驗(yàn)組1、2、3、5 d 的 G1/G0期細(xì)胞分別為 (58.2 ±0.38)%、(62.9 ±0.32)%、(65.4 ±0.12)%、(68.9±0.41)%，S 期細(xì)胞分別為(25.1 ±0.49)%、(22.9±0.33)%、(21.0 ±0.51)%、(19.2 ±0.18)%。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組G1/G0期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少(P 均＜0.05)。

2.3 兩組NDRG1蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2 兩組NDRG1蛋白表達(dá)比較

2.4 細(xì)胞形態(tài)變化 倒置顯微鏡下，對(duì)照組細(xì)胞大小均勻，貼壁生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，數(shù)量減少，細(xì)胞大小不一，形態(tài)不規(guī)則，貼壁能力減弱，細(xì)胞膜絨毛減少，細(xì)胞核光滑無切跡，分裂像少見，凋亡細(xì)胞較多。

3 討論

誘導(dǎo)分化是指惡性腫瘤細(xì)胞在體外分化誘導(dǎo)劑作用下，向正?；蚪咏＜?xì)胞方向分化逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。維甲類化合物具有較好的誘導(dǎo)分化和增殖抑制作用，其主要通過誘導(dǎo)核維甲酸受體表達(dá)起作用，同時(shí)抑制異常角化，調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因表達(dá)［3，4］，其代表藥物是ATRA。研究表明，ATRA能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞分化或抑制腫瘤細(xì)胞增殖。上世紀(jì)80年代王振義等［5］首先用ATRA治療急性早幼粒細(xì)胞白血病，取得較高的緩解率。本研究發(fā)現(xiàn)，ATRA可抑制SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)其抑制作用明顯，提示ATRA有較強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其分化作用。

有研究表明，細(xì)胞周期長(zhǎng)短主要決定于G1期，G1期阻滯可使細(xì)胞周期延長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖減慢，Inui等［6］研究表明ATRA可影響細(xì)胞DNA的合成，改變細(xì)胞周期和信號(hào)傳導(dǎo)途徑，使細(xì)胞在G1期前停滯。本研究顯示，ATRA作用于SKOV3細(xì)胞后，G1/G0期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，說明ATRA能阻止細(xì)胞由G1/G0期向S期轉(zhuǎn)化，延長(zhǎng)細(xì)胞分裂周期，抑制細(xì)胞增殖，與駱霞崗等［7］在研究ATRA對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PC-3誘導(dǎo)分化作用中的結(jié)論相同。本研究還發(fā)現(xiàn)，ATRA處理后的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)了良性分化表現(xiàn)，即細(xì)胞增殖受抑制，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞貼壁能力減弱，細(xì)胞膜絨毛減少，細(xì)胞核分裂像少見，凋亡細(xì)胞較多，與張強(qiáng)等［8，9］觀察 ATRA 對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞影響的結(jié)果相似。

NDRG1基因是新發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞分化有關(guān)的基因，廣泛存在于人體各組織中，在其生長(zhǎng)過程中起重要作用。Kurdistani等［10］發(fā)現(xiàn)，NDRG1基因在乳腺癌、前列腺癌細(xì)胞株及腫瘤組織中呈低表達(dá)，其過表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。研究表明，NDRG1可被多種分化調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)表達(dá)，如缺氧及鎳化合物、維甲酸、維生素 D3等可使其 mRNA或蛋白表達(dá)上調(diào)［11，12］。1999 年 Piquemal等［13］曾報(bào)道用多種分化誘導(dǎo)劑處理白血病細(xì)胞株U937，發(fā)現(xiàn)NDRG1蛋白表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，ATRA作用于SKOV3細(xì)胞后，NDRG1蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，提示ATRA有誘導(dǎo)NDRG1表達(dá)的作用，表明NDRG1參與了卵巢癌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，維甲酸可能通過調(diào)節(jié)其表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，ATRA有抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其分化的作用，將誘導(dǎo)分化治療作為卵巢癌的綜合治療方法具有現(xiàn)實(shí)意義。

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