鄧惜汝，鮮啟鳴，孫成

污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210023

農(nóng)藥正越來越廣泛的運(yùn)用于生產(chǎn)中，并且品種不斷增加，用量不斷增大。目前我國農(nóng)藥使用以有機(jī)氯及有機(jī)磷殺蟲劑為主，它們對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的安全造成了很大的威脅，有機(jī)氯（磷）農(nóng)藥進(jìn)入水環(huán)境后往往通過浮游植物的吸收而積累，隨后經(jīng)過食物鏈的傳遞、擴(kuò)大，對(duì)水資源的開發(fā)利用造成損害（蔡道基，1999）。

林丹是一種高效廣譜的殺蟲劑，曾經(jīng)被許多國家包括中國大量使用。林丹不易降解，在土壤和沉積物中能長期殘留，2005年11月于日內(nèi)瓦召開的持久性有機(jī)污染物審查委員會(huì)第一次會(huì)議審議了將林丹列入《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》的提案，認(rèn)定林丹符合所有《公約》規(guī)定的篩選標(biāo)準(zhǔn)（岳瑞生，2001）。許多國家在20世紀(jì)70年代已停止林丹的使用，我國從 1983年起停止生產(chǎn)，但作為其他家藥的原料還保留著少量的生產(chǎn)。而毒死蜱作為傳統(tǒng)的廣譜、高效、低殘留、毒性相對(duì)較低的殺蟲劑品種，其市場(chǎng)潛力被普遍看好，目前，全球毒死蜱的市場(chǎng)年銷售量約為14萬t，國內(nèi)市場(chǎng)毒死蜱的市場(chǎng)年需求量約為2萬t左右。毒死蜱雖然在中國迎來了發(fā)展機(jī)遇，但是毒死蜱在生產(chǎn)和使用過程中極易造成水、大氣、土壤、動(dòng)植物污染及通過生物富集對(duì)人類健康造成威脅等一系列問題（Rack，1993）。

隨著對(duì)農(nóng)藥污染認(rèn)識(shí)的深入，農(nóng)藥對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的毒性及其機(jī)制的研究不斷增多，但過去大多報(bào)道集中于農(nóng)藥對(duì)鳥類、無脊椎類動(dòng)物、魚類、哺乳動(dòng)物的影響及其毒理學(xué)研究，對(duì)于豐富而重要的微生物的研究卻很少（Gonazlez等，2012）。然而，在日常施用農(nóng)藥的過程中，只有約 1%的農(nóng)藥作用于靶生物，其余的或殘留于土壤，或通過徑流進(jìn)入水域，影響土壤和水體中的生物（沈國興等，1999）。由于藻類構(gòu)成了水生食物鏈的基礎(chǔ)，為無脊椎動(dòng)物、魚類、水鳥等生物提供氧氣和食物，因此，開展農(nóng)藥對(duì)藻類毒性效應(yīng)的研究是很有必要的。作為水生生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，藻類具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、代謝速度快、對(duì)環(huán)境變化反應(yīng)敏捷等特點(diǎn)，且具有同高等生物相似的物理化學(xué)特性和酶作用過程，常作為河流環(huán)境理化指標(biāo)的指示生物（Kobrael和White，1996）。藻類生長抑制試驗(yàn)是毒理學(xué)生物測(cè)定的方法之一，該方法成本低，可在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)評(píng)價(jià)化學(xué)品的毒性，提供有意義的毒性指標(biāo)，預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入環(huán)境可能引起的危害（Rack，1993）。

本實(shí)驗(yàn)以長江中下游常見的3種淡水藻類銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)和梅尼小環(huán)藻(Cyclotella meneghiniana)為受試生物，測(cè)定了林丹和毒死蜱對(duì)藻類的7 d生長抑制曲線，得到相應(yīng)的半抑制質(zhì)量濃度(EC50)，最低有顯著影響有效質(zhì)量濃度(LOEC)、最高無顯著影響有效質(zhì)量濃度(NOEC)及最大可接受毒性質(zhì)量濃度(MATC)。研究結(jié)果可為評(píng)價(jià)林丹及毒死蜱的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、梅尼小環(huán)藻(Cyclotella meneghiniana)，均購于中科院武漢水生所淡水藻種庫；林丹（純度w=99.3%）、毒死蜱（純度w=100%）均購自AccuStandard, Inc.，USA，實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。主要儀器有熒光顯微鏡、智能光照培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、冷凍離心機(jī)、高壓滅菌器、紫外-可見分光光度計(jì)、血球計(jì)數(shù)板等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻種培養(yǎng)

銅綠微囊藻和普通小球藻采用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)（陳國永等，2007），梅尼小環(huán)藻采用D1培養(yǎng)基培養(yǎng)（楊海明等，1997）。實(shí)驗(yàn)前先對(duì)藻種進(jìn)行馴化，將其置于光照強(qiáng)度2000 lx，光暗比12 h∶12 h，溫度為25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每月轉(zhuǎn)接1次。通過鏡檢能夠明顯區(qū)分3株藻種的形態(tài)。

1.2.2 生物量測(cè)定

為了準(zhǔn)確快速地獲得藻細(xì)胞的生物量，實(shí)驗(yàn)中選用吸光度值來表示3種藻的生長量。將銅綠微囊藻、普通小球藻和梅尼小環(huán)藻的藻液稀釋至不同質(zhì)量濃度，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)算藻細(xì)胞數(shù)，同時(shí)用分光光度計(jì)在680 nm處測(cè)量對(duì)應(yīng)藻液的吸光度，可得到藻細(xì)胞數(shù)與吸光度之間的線性關(guān)系。見表1，其中y表示藻液的A680，x表示藻細(xì)胞數(shù)(104cells·mL-1)。

表1 3種藻吸光度與藻細(xì)胞數(shù)間的關(guān)系Table 1 The relationship between cell number and absorbance

1.2.3 藻類毒性試驗(yàn)

取生長處于對(duì)數(shù)期的藻液，接種到新鮮滅過菌的培養(yǎng)液中，混勻，記錄下起始藻吸光度，然后分裝到三角瓶中，分別加入不同質(zhì)量濃度梯度的林丹(0，50，89，158，281，500 μg·L-1)和毒死蜱(0，500，890，1580，2810，5000 μg·L-1)，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置 3個(gè)平行，用封口膜封口后放入光照強(qiáng)度 2000 lx，光暗比12 h∶12 h，溫度為25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每隔24 h測(cè)定藻液在最大吸收波長處的吸光度。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)選用抑制藻類 50%生長的化合物的有效質(zhì)量濃度96 h-EC50，最低有顯著影響有效質(zhì)量濃度LOEC、最高無顯著影響有效質(zhì)量濃度NOEC以及最大可接受毒性質(zhì)量濃度 MATC值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。通過 A計(jì)算相對(duì)抑制率，相對(duì)抑制率=(1-N/N0)×100%，其中，N為試驗(yàn)組的藻密度，N0對(duì)對(duì)照組的藻密度（劉梅和劉贊，1998）。利用概率單位-質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)法，根據(jù)毒物質(zhì)量濃度的自然對(duì)數(shù)和生物效應(yīng)的百分率單位成直線關(guān)系這一原理，利用化合物質(zhì)量濃度的自然對(duì)數(shù)與抑制百分率之間的相關(guān)性方程計(jì)算EC50值（Hoekstra，1991）。利用化合物質(zhì)量濃度的自然對(duì)數(shù)與抑制百分率之間的相關(guān)性方程計(jì)算EC20和EC10值，計(jì)算得出的EC20可作為LOEC值，EC10可作為NOEC值。最大可接受毒性質(zhì)量濃度 MATC等于最低有顯著影響質(zhì)量濃度 LOEC和最高無顯著影晌質(zhì)量濃度NOEC的幾何平均值，即MATC=(LOEC*NOEC)1/2而計(jì)算得出。統(tǒng)計(jì)分析用Excel 2007與Origin 8.5軟件完成。

2 結(jié)果與分析

用不同質(zhì)量濃度的林丹處理3種淡水藻，林丹對(duì)銅綠微囊藻及小球藻的抑制率變化如圖1-A—圖1-B，由于梅尼小環(huán)藻對(duì)50~500 μg·L-1的林丹不敏感（圖1-C），為了計(jì)算林丹、毒死蜱對(duì)梅尼小環(huán)藻的毒性值，將受試質(zhì)量濃度范圍調(diào)整為 500~5000 μg·L-1，林丹對(duì)梅尼小環(huán)藻的抑制率變化如圖1-D。

從圖1可知，在林丹的毒性作用下，藻細(xì)胞的生長受到不同程度的抑制作用，且抑制程度在一定的線性范圍內(nèi)與林丹的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，顯示出明顯的質(zhì)量濃度-劑量相關(guān)性。同時(shí)，用肉眼可以看出培養(yǎng)在含有不同質(zhì)量濃度林丹的培養(yǎng)基中的藻類生長情況不同。對(duì)照組中，3種藻均生長旺盛，藻液顏色正常，隨著時(shí)間的增長，藻液的顏色逐漸加深且少有沉淀。而在林丹處理后的培養(yǎng)基中生長的3種藻均隨著林丹質(zhì)量濃度的增加，藻液的顏色明顯比對(duì)照組淺，沉淀現(xiàn)象嚴(yán)重。

圖1 林丹對(duì)3種淡水藻類的抑制率變化圖Fig.1 The growth inhibition of algae by Lindane

根據(jù)圖 1的數(shù)據(jù)，利用前面介紹的概率單位-質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)法得到回歸方程y=ax+b，其中，y為概率單位，x為質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，林丹對(duì)3種藻的EC50、LOEC、NOEC及MATC值如表2所示。

從表2可以看出，銅綠微囊藻和普通小球藻對(duì)林丹的敏感性明顯高于梅尼小環(huán)藻，先前也有報(bào)道指出，不同藻類對(duì)農(nóng)藥的敏感性有較大差異。陳碧鵑等（1997）報(bào)道了氰戊菊酯和胺菊酯對(duì)等鞭金藻的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(96 h EC50)為 1.38和 0.73 mg·L-1；而對(duì)小球藻的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(96 h EC50)為0.52和1.12 mg·L-1。從而可以看出，小球藻對(duì)氰戊菊酯的敏感性要高于等鞭金藻，對(duì)胺菊酯的敏感性低于等鞭金藻。Sabater和Carrasco（2001）研究了噠嗪硫磷對(duì) 2種小球藻和 1種藍(lán)綠藻(Pseudanabaena galeata)和2種柵藻的影響，發(fā)現(xiàn)2種柵藻比小球藻和藍(lán)藻對(duì)噠嗪硫磷敏感。且本實(shí)驗(yàn)中計(jì)算值與 U.S.EPA 的毒性數(shù)據(jù)庫（http://cfpub.epa.gov/ecotox/）中報(bào)道的林丹對(duì)銅綠微囊藻的 ρ(LOEC)=300 μg·L-1相近。

不同質(zhì)量濃度的毒死蜱處理3種淡水藻，3種藻的生長抑制率變化如圖2-A—圖2-C。

從圖 2可知，在當(dāng)加入低質(zhì)量濃度的毒死蜱(500 μg·L-1)時(shí)，毒死蜱對(duì)銅綠微囊藻和普通小球藻的生長具有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)加入的毒死蜱的質(zhì)量濃度增加時(shí)，逐漸開始對(duì)藻的生長表現(xiàn)出抑制作用。隨著加入的毒死蜱的質(zhì)量濃度的升高及3種藻在毒死蜱中暴露時(shí)間的增加，毒死蜱的抑制作用越明顯。由此可以看出低質(zhì)量濃度的毒死蜱對(duì)藻細(xì)胞的生長具有促進(jìn)作用，而高質(zhì)量濃度的毒死蜱則對(duì)3種藻的生長具有抑制作用，表現(xiàn)出質(zhì)量濃度-劑量相關(guān)性。有許多研究表明，低質(zhì)量濃度的殺蟲劑可促進(jìn)藻類生長。劉梅和劉贊（1998）以普通小球藻為試驗(yàn)對(duì)象，研究了低質(zhì)量濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥樂果對(duì)其生長的影響，結(jié)果顯示，低質(zhì)量濃度樂果能使普通小球藻的生長量、蛋白質(zhì)含量、葉綠素含量、堿性磷酸酶活力等有明顯的增長。鄒立等（1998）也發(fā)現(xiàn)有些殺蟲劑在低質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)海洋亞心形扁藻有一定限度的促生長作用。

表2 林丹對(duì)3種藻的毒性數(shù)據(jù)值Table 2 The toxicological datas of Lindane on algae

圖2 毒死蜱對(duì)3種淡水藻類的抑制率變化圖Fig.2 The growth inhibition of algae by Chlorpyrifo

根據(jù)圖2中的數(shù)據(jù)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，毒死蜱對(duì)3種藻的EC50、LOEC、NOEC及MATC值如表3所示。從表3可以看出，3種淡水藻對(duì)毒死蜱的敏感性強(qiáng)弱依次為銅綠微囊藻、普通小球藻和、梅尼小環(huán)藻。

比較表2和表3的毒性數(shù)據(jù)可知，林丹對(duì)藻類的毒性高于毒死蜱對(duì)藻類的毒性，如林丹及毒死蜱對(duì)銅綠微囊藻的EC50值分別為0.44和2.7 mg·L-1，說明不同的農(nóng)藥對(duì)藻類的毒性作用是不同的。鄒立等用我國常見的 11種有機(jī)磷殺蟲劑對(duì)海洋亞心形扁藻的毒性效應(yīng)的研究表明，有機(jī)磷農(nóng)藥的質(zhì)量濃度越高，對(duì)扁藻生長的抑制作用越強(qiáng)；他還發(fā)現(xiàn)，有機(jī)磷農(nóng)藥的毒性大小還與其結(jié)構(gòu)有關(guān)（鄒立等，1998）。鄒立和李永祺用 QSAR模型分析也表明，一般農(nóng)藥的親脂性越強(qiáng)，電子密度越大，立體結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，對(duì)藻類的致毒效應(yīng)越大（鄒立和李永祺，1999）。高玉榮（1995）研究了殺蟲劑單甲脒對(duì)綠藻斜生柵藻和蛋白核小球藻的毒性作用，結(jié)果表明，同一殺蟲劑對(duì)不同藻類的毒性也不同。Sabater和 Carrasco（2001）、蔡阿根等（1999）、熊麗等（2002）、Wonk 和 Chang（1988）以及龔瑞忠等（2001）的報(bào)道也證實(shí)了這一點(diǎn)。

3 結(jié)論

總的來說，林丹和毒死蜱這兩種典型的有機(jī)氯/磷農(nóng)藥對(duì)3種淡水藻類均具有一定的毒性效應(yīng)，且表現(xiàn)出質(zhì)量濃度-劑量相關(guān)性。就兩種不同農(nóng)藥而言，林丹對(duì)藻類的毒性高于毒死蜱對(duì)藻類的毒性，且低質(zhì)量濃度的毒死蜱對(duì)藻類的生長具有一定的促進(jìn)作用，質(zhì)量濃度增加后顯示出抑制作用，這可能與這兩種農(nóng)藥的親脂性及化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。而就 3種受試的淡水藻類而言，對(duì)于林丹及毒死蜱的敏感性：銅綠微囊藻＞普通小球藻＞梅尼小環(huán)藻，說明不同藻類對(duì)農(nóng)藥的敏感性有較大差異。林丹和毒死蜱對(duì)于淡水藻類毒性差異的原因和機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

表3 毒死蜱對(duì)3種藻的毒性數(shù)據(jù)值Table 3 The toxicological datas of Chlorpyrifo on algae

GONAZLEZ R, GARCIA-BALBOA C, ROUCO M, et al. 2012. Adaptation of microalgae to lindane: A new approach for bioremediation[J].Aquatic Toxicology, 109: 25-32.

HOEKSTRA J A. 1991. Estimation of the LC50, a review[J].Environmetrics, 2(2): 139-152.

KOBRAE M E, White D S. 1996. Effects of 2,4-Dichlorohenoxyacetic acid on Kentucky aglae: armukaneous laboratory and field toxicity testings[J]. Archives of Environment Contamination and Toxicology,31: 571-580.

RACK K D. 1993. Environmental fate of chlorpyrifos[M]. New York:Springer-Verlag: 131: 1-150.

SABATER C, CARRASCO J M. 2001. Effects of pyridaphenthion on growth of freshwater specoes of pyridaphenthion:A laboratory study[J].Chemosphere, 44: 1775-1780.

WONK P K, CHANG L. 1988. The effects of 2,4-D hebicide and organophosphorus insecticides on growth, photosynthesis and organophosphprus insecticides on growth, photosynthesis and chlorophyll a synthesis of Chlamydomonas reinhardtii(mt+)[J].

Environmental Pollution, 55: 179-189.

蔡阿根, 李文權(quán), 鄭愛榕. 1999. 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)海洋微藻的若干生物學(xué)效應(yīng)[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 38(4): 589-593.

蔡道基. 1999. 農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)研究[M]. 北京: 中國環(huán)境科學(xué)出版社:3-18.

陳碧娟, 陳民山, 吳彰寬, 等. 1997. 氰戊菊酯、胺菊酯對(duì)海洋藻類、貝類的毒性研究[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 4(2): 51-55.

陳國永, 楊振波, 馬昱, 等. 2007. 氮和磷對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞生長的影響[J]. 環(huán)境與健康雜志, 24(9): 675-679.

高玉榮. 1995. 殺蟲劑單甲脒對(duì)綠藻的毒性研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),15(1): 92-97.

龔瑞忠, 陳悅, 陳良燕, 等. 2001. 溴氟菊酯對(duì)環(huán)境生物的安全評(píng)價(jià)研究[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 3(3): 67-72.

劉梅, 劉贊. 1998. 低濃度有機(jī)磷農(nóng)藥樂果促進(jìn)普通小球藻生長的研究[J]. 焦作工學(xué)院學(xué)報(bào), 17(5): 396-399.

沈國興, 嚴(yán)國安, 彭金良, 等. 1999. 農(nóng)藥對(duì)藻類的生態(tài)毒理學(xué)研究Ⅱ[J].環(huán)境科學(xué)進(jìn)展, 7(6): 131-140.

熊麗, 吳振斌, 況琪軍, 等. 2002. 氯氰菊酯對(duì)斜生柵藻的毒性研究[J].水生生物學(xué)報(bào), 26(1): 66-73.

楊海明, 尹邵武, 吳朝暉, 等. 1997. 梅尼小環(huán)藻(Cyclotella meneghiniana Kiits)的培養(yǎng)與利用[J]. 湖南師范大學(xué):自然科學(xué)學(xué)報(bào),20(3): 56-61.

岳瑞生. 2001.《關(guān)于就某些持久性有機(jī)污染物采取國際行動(dòng)的斯德哥爾摩公約》及其談判背景[J]. 世界環(huán)境, 1: 24-28.

鄒立, 程剛, 李永祺, 等. 1998. 11種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)海洋微囊藻致毒效應(yīng)的研究[J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 17(3): 29-34.

鄒立, 李永祺. 1999. 用 QSAR法研究有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)海洋扁藻的構(gòu)效關(guān)系[J]. 海洋與湖沼, 30(2): 6.