樊宇紅，凌宏文，樸河春

中國科學(xué)院地球化學(xué)研究所環(huán)境地球化學(xué)國家重點實驗室，貴州 貴陽 550002

桑樹（Morus alba）的分布非常廣，生長速度快，具有極強的耐干旱耐貧瘠的能力，對惡劣自然環(huán)境有超強適應(yīng)性和突出的水土保持功能。因此，桑樹在特殊的地質(zhì)地貌和自然干旱頻繁地區(qū)植被恢復(fù)，以及在石漠化地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)中發(fā)揮重要作用（黃小輝等，2012；劉代軍等，2012）。桑樹葉不僅用于養(yǎng)蠶業(yè)，還為家禽和畜牧業(yè)提供富含蛋白質(zhì)的高質(zhì)量飼料（Liu 和 Willison, 2013）。

菌根真菌能強烈地影響植物對環(huán)境的適應(yīng)性（Johnson 等，2010；Pánková等 2011）。 菌根真菌對植物適應(yīng)性和生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)性的貢獻，是通過促進緊密的營養(yǎng)物循環(huán)（Vander Heijden等，2008），即通過增進營養(yǎng)物和水分的吸收能力來實現(xiàn)（Pánková等 2011；Van der Heijden，2010）。目前，對于植物與菌根真菌共生給植物生長帶來的諸多影響是否有益研究者們?nèi)匀淮嬗袪幾h（Smith和Smith，2013；Johnson和Graham， 2013；Ryan和Kirkegaard，2012）。而對于AM的最重要的功能是把營養(yǎng)物通過根外菌絲體輸入到根細胞的觀點，研究者們是一致認同的。以菌根真菌為媒介的植物對營養(yǎng)物吸收的最大特點是雙向營養(yǎng)物傳遞，即AM植物把葉片的碳水化合物輸送到真菌體中，從而把大量的有機碳輸入到土壤中去，同時把土壤中的礦質(zhì)營養(yǎng)物輸入到植物組織（Piao和Liu，2011；Piao等，2012）。菌種的侵染引起根系的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)的變化（Tanaka和Yano，2005）。比如，宿主植物的根系和根外菌絲體能夠形成和釋放大量的有機物，它能溶解難以被利用的營養(yǎng)物，使它具有較強的移動能力，以便被宿主植物所吸收（Theuerl和Buscot，2010；Piao和Liu，2011）；同時產(chǎn)生一些酶，比如磷酸酯酶，磷酸酯酶不但具有很強的移動營養(yǎng)物的能力，能幫助宿主植物吸收營養(yǎng)物（Ostertag，2010）；而且能影響土壤的生物地球化學(xué)作用，包括礦化和硝化作用（Hamel，2004）。上述因素都能夠促進土壤中的營養(yǎng)物的可利用性，從而提高植物對營養(yǎng)元素的吸收。桑樹叢枝菌根侵染率隨時間逐漸升高，其侵染率達到40%以上時就能觀察到叢枝菌根（AM）真菌對桑苗生長的明顯促進作用。因此，桑樹是典型的叢枝菌根植物，菌根有利于桑樹在極端逆境中生長(舒玉芳等，2011；劉代軍等，2012；葉嬌等，2012)。

重金屬元素Fe、Mn、Zn和Cu是植物和人體所需的營養(yǎng)元素，而重金屬元素Cd是一種在土壤中自然存在的，人體不需要的微量元素。Cd是土壤中相對容易移動的元素之一，毒性很大。土壤鹽度和土壤酸度都可以影響土壤中Cd的生物可利用性（He 和 Singh，1994）。由于Cd和Zn的化學(xué)性質(zhì)相近，互為競爭元素，Cd在缺Zn的土壤中容易被植物所吸收，因此Cd的積累容易出現(xiàn)在缺Zn的植物體中（Oliver等，1994）。然而在土壤Zn含量非常高的稻田中，水稻谷粒中 Cd含量也非常高（Chaney等，2004）。同一種植物在不同的土壤環(huán)境中可表現(xiàn)出不同的行為。

每一種植物都具有為適應(yīng)土壤環(huán)境而采取應(yīng)對策略的能力，比如：非禾本科種類以增加質(zhì)子分泌物來響應(yīng)缺鐵環(huán)境（Marschner，1995），并以 Fe(Ⅱ)的形式吸收（Eide等，1996)；禾本科種類是釋放非-蛋白氨基酸（phytosiderophores）之類的物質(zhì)（Marschner，1995），是具有高親和力的螯合劑，與Fe (III)形成絡(luò)合物從而容易被植物所吸收，但這種分泌物并不是專對鐵起絡(luò)合作用的單一性螯和劑，它還會與Zn、Cu、Mn、Ni和Cd等元素絡(luò)合（Shenker等，2001）。桑樹雖是具有對惡劣自然環(huán)境有超強適應(yīng)性的菌根植物，但它仍偏好于生長在偏酸性的富含營養(yǎng)物的土壤環(huán)境中，因此，弄清楚桑樹與菌根真菌共生對吸收重金屬含量所產(chǎn)生的影響是非常有必要的。

1 研究地概況與研究方法

1.1 研究區(qū)概況

貴州荔波位于貴州南部，珠江流域上游，處于貴州高原向廣西丘陵過渡地帶，東經(jīng)108°00′50″~108°10′37″，北緯 25°17′26″~25°29′51″，海拔高度在500~720 m之間。年平均氣溫18.3 ℃,年平均降雨量為1320.5 mm。

貴州黃平處于黔中丘原與黔東丘陵的過渡地帶上，屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候。地處東經(jīng)107°51′42″ ~108°08′ 47″ ，北緯 26°46′ 20″ ~26°55′ 56″，海拔高度在700~1030 m之間。年平均氣溫15.4 ℃(13~16 ℃)，年平均降雨量1114.2 mm。

采樣地土壤類型多為碳酸鹽類，與砂巖交叉分布，所采集的土壤均為黃壤。桑樹均引種自廣西，平均株行距約為0.5 m×1.2 m，4年生桑樹的平均根徑為5 cm左右。小于1 mm的桑樹細根在0~20 cm土層內(nèi)分布密度最大，呈水平狀分布，而深部的根系呈垂直狀分布（Liu和Willison，2013；石娟華等，2008），由此說明桑樹細根不但能利用表層土壤空間，更能吸收利用深層土壤水分和養(yǎng)分（Liu和Willison，2013；石娟華等，2008）。桑樹地下部分的生物量明顯高于地上部分，占總生物量的53.1%（張光燦等，1997）。以養(yǎng)蠶為栽培目的的桑樹，從5月上旬開始摘葉，5月底伐去全部枝葉，繼續(xù)萌發(fā)枝葉后，從7月初至10月底一直處于摘葉養(yǎng)蠶中。采樣時間是2013年5月。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集和分析

將采集到的植物樣品盡快運回實驗室，用蒸餾水沖掉附著于樣品上的污染物，置于 60 ℃烘箱中烘48 h。土壤樣品過2 mm篩，風(fēng)干，并剔除植物殘留物。將土壤和植物組織樣品分別研磨至粉狀。土壤和植物樣品中的C和N的含量的測定采用元素分析儀（PE2400-II型）。植物樣品中重金屬（Fe、Mn、Zn、Cu和 Cd）含量的分析采用酸溶-電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP-OES-美國安捷倫公司）和電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS-美國PE公司）測定；土壤中的可利用性重金屬含量用 0.005 mol·L-1DTPA溶液萃取，并用等離子發(fā)射光譜測定（Lindsay和Norvell，1978）。植物樣品中的糖類含量的測定采用蒽酮比色法(Piao等，2001；Piao和Liu，2011)。在樣品分析中平行樣的測定達 20%，所得分析數(shù)據(jù)均符合要求。

1.2.2 侵染率的檢測方法

侵染率的檢測方法依據(jù)根段頻率標準法進行(Liu和 Luo，1994)。孢子量檢測方法：稱取 20 g鮮土，經(jīng)1mm、100目、200目、400目篩過濾分選后，于OLYMPUS顯微鏡鏡下檢查孢子個數(shù)。上述樣品的分析均在中國科學(xué)院地球化學(xué)研究所環(huán)境地球化學(xué)國家重點實驗室完成。

1.2.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行處理。文中所有數(shù)據(jù)均為平均值±標準差。所測定的數(shù)據(jù)在5%的檢驗水平下進行線行回歸和t檢驗來確定顯著性差異水平。

2 結(jié)果

2.1 桑樹根系 AM 真菌侵染率水平和土壤菌根真菌數(shù)量

本研究在荔波和黃平各選擇3個樣品進行侵染率檢測，檢結(jié)果顯示：荔波3個桑樹樣品的AM侵染率分別為 16%、13%和 12%，而黃平分別為16%、32%和9%。對0~20 cm土壤層的菌根真菌孢子密度進行分析，結(jié)果顯示：荔波地區(qū)的20 g烘干土壤中菌根真菌的數(shù)量為：（21±9）個，略高于黃平的（15±1）個。

2.2 貴州荔波和黃平兩地土壤中重金屬（Fe、Mn、Zn、Cu、Cd）含量對比

貴州荔波和黃平兩地以石灰?guī)r分布為主，交叉分布著砂巖。因此，石灰?guī)r和砂巖的分布格局決定了桑樹采樣地土壤的 pH。由表 1可知，荔波采樣地土壤的 pH顯著低于黃平土壤 pH（表 1）。表 1列舉了荔波和黃平兩地土壤中 DTPA-萃取的重金屬含量。DTPA-萃取的 Fe含量在荔波地區(qū)（18.0~212.9 μg·g-1）遠高于黃平地區(qū)（11.8~91.1 μg·g-1）。Mn在土壤中的分布與Fe相反，在荔波地區(qū)（2.78~132.09 μg·g-1）遠低于黃平（17.18 ~223.5 μg·g-1）。以上數(shù)據(jù)說明土壤 pH 值較高的黃平地區(qū)土壤可利用性Fe的含量低于pH值較低的荔波地區(qū)土壤，而在土壤pH較高的黃平地區(qū)土壤可利用性Mn的含量卻高于土壤pH較低的荔波土壤。該結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致（凌宏文等，2007）。其他重金屬元素含量在黃平和荔波之間不具有統(tǒng)計學(xué)意義上的差異（表1）。荔波和黃平兩地土壤可利用性的 Fe含量隨土壤 pH上升而下降，而可利用性Zn的含量隨土壤pH上升而增加（圖1）。其余元素與土壤pH值之間沒有顯著相關(guān)性。

2.3 桑樹組織中的碳和糖類化合物含量的變化

桑樹葉片中的C含量在荔波（40.2%±1.5%）和黃平（40.1%±1.1%）兩地之間幾乎沒有差異，而根系中的C含量表現(xiàn)為荔波（44.0%±1.6%）明顯高于黃平（42.1%±3.2%）(p=0.038，圖2a)。桑樹葉片中的糖類含量表現(xiàn)為荔波（67±27）mg·g-1明顯低于黃平（105±57）mg·g-1（p=0.02），而根系中的糖類含量則表現(xiàn)為荔波（125±43）mg·g-1顯著高于黃平（91±43）mg·g-1（p=0.032，圖 2b）。該結(jié)果表明，生長在較高土壤pH的黃平桑樹相比于生長在較低土壤pH的荔波其葉片中的光合作用產(chǎn)物將被更多地輸送到桑樹的根系。

圖1 土壤Zn(a)和Fe(b)隨土壤pH的變化Fig. 1 Changes of Soil Zn(a) and Fe(b) with Soil pH

圖2 貴州黃平和荔波桑樹組織葉根中的碳含量（a），和糖類含量（b）的比較. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001Fig. 2 Comparisons of Mulberry Tissue Carbon(a) and Sugar Concentrations(b) between Huangping and Libo. *p<0.05; **p<0.01;***p<0.001

表1 貴州黃平（n=16）和荔波（n=17）桑地土壤重金屬含量及t檢驗結(jié)果Table 1 Soil heavy metal concentrations in Huangping (n=16) and Libo (n=17) in Guizhou, and the t-test result

表2 黃平（n=16）和荔波（n=17）桑地所生長的桑樹組織中重金屬含量，及t檢驗結(jié)果Table 2 Mulberry tissue heavy metal concentrations in Huangping (n=16) and Libo (n=17)，and the t-test result

2.4 桑樹中Fe、Mn、Zn、Cu和Cd的分配模式

除 Fe元素外，桑樹葉片中的重金屬含量在荔波和黃平之間有明顯差異，均表現(xiàn)為荔波高于黃平（表2）。相反，在桑樹根系中Fe含量在荔波和黃平之間有明顯差異，且荔波低于黃平，而其他重金屬在兩地間沒有明顯差異（表2）。顯然，這種分配模式不同于土壤中的分配模式。

2.5 桑葉中重金屬元素間相互關(guān)系

桑樹葉片Cd與Zn含量之間（圖3a），Cd與Mn含量之間（圖3b），Cd與Cu含量之間（r2=0.142，p<0.05）有顯著相關(guān)性，而葉片Cd與Fe含量之間沒有顯著相關(guān)性。

3 討論

3.1 桑樹叢枝真菌侵染率

生長在荔波和黃平的桑樹都具有叢枝菌根，但兩者的侵染率水平幾乎沒有差異。菌根植物對營養(yǎng)元素的吸收有兩個途徑：一是從根系的表皮層吸收，另一個是通過菌絲體吸收（Smith等，2010）。如果菌絲體的根外結(jié)構(gòu)和根內(nèi)結(jié)構(gòu)沒有連接，那么共生體之間的營養(yǎng)物傳播就不可能進行，也就是缺少菌根的吸收功能（Piao和 Liu，2011）。Piao和Liu（2011）的實驗結(jié)果表明，即使以菌根為媒介的過程沒有形成，在耕地中生長的杉木幼苗根系中仍然能檢測出叢枝菌根的侵染。另外，檢測真菌侵染率所使用的最為普通的方法是“Trypan blue staining of roots”，盡管該法能很好地指示真菌在根系中的定居和真菌的侵染，但并不能指示共生效率（Azcón等，2008）。共生效率可定義為：以 AM 為媒介的營養(yǎng)物吸收過程中，AM 植物吸收營養(yǎng)物的能力（Piao和 Liu，2011）。因此，生長在荔波和黃平的桑樹AM侵染率近似，并不代表兩地桑樹吸收重金屬的能力相同。本研究中荔波的孢子密度雖高于黃平，但兩者的數(shù)量均不高。鄭克舉等人（2013）的數(shù)據(jù)表明在馬尾松林土壤中的菌根真菌孢子數(shù)可達2925個。Aliasgharzadeh等人（2001）的研究表明，孢子密度與土壤可利用性Ca、Mg之間存在負相關(guān)關(guān)系。

圖3 桑葉Cd含量與桑葉Zn含量（a），與桑葉Mn含量（b）之間的相關(guān)性Fig. 3 Relationships between foliar Cd and Zn Concentrations (a)and between foliar Cd and Mn Concentrations (b) in Mulberry

3.2 土壤pH的影響

植物通過一系列的機制來改進土壤的物理、化學(xué)和生物的性質(zhì)，其中包括能酸化土壤的質(zhì)子的釋放（Richardson等，2009）。土壤pH的改變將直接影響營養(yǎng)物的可利用性，或通過與土壤微生物的相互作用間接地影響營養(yǎng)物的可利用性（Richardson等，2009）。土壤化學(xué)性質(zhì)決定土壤中的 AM 真菌的分布狀態(tài)，脫鈣地區(qū)土壤中AM真菌的密度較高（M?rtensson等，2012）。因此，土壤酸性直接影響土壤中AM真菌的分布，從而間接地影響營養(yǎng)物的可利用性（Guo等，2012）。特定的AM種類在根系中的再育需要最佳土壤 pH環(huán)境（Orozco-Pati?o和 Medina-Sierra，2013）。土壤pH或P含量的改變能夠強烈的影響孢子的形成以及根系的侵染（Orozco-Pati?o 和 Medina-Sierra，2013）。M?rtensson等人（2012）發(fā)現(xiàn)在土壤中AM真菌菌絲體隨土壤pH增加而減少，但土壤pH與根系中AM真菌的數(shù)量之間沒有顯著的相關(guān)性。Rousk等人證明，低pH條件有利于真菌的生長，而高pH有利于細菌的生長（Rousk等，2011）。Labidi等人（2012）通過實驗證明土壤CaCO3處理明顯地減少根系的生長，并改變了AM真菌的與其共生相關(guān)的發(fā)育階段，而真菌依然能夠完成他的生命周期。高含量的 CaCO3降低根系的生長，值得注意的是其影響力在菌根根系的影響遠大于非菌根根系。這與菌根根系把相當數(shù)量的C分配給真菌，以維持真菌的新陳代謝作用有關(guān)（Labidi等，2012）。本研究結(jié)果與上述研究相一致。在本研究中，具有較高pH的黃平的桑樹根系的生物量遠不如荔波，而且分配給根系的光合作用產(chǎn)物也遠不如荔波。這些結(jié)果說明，偏酸性的土壤環(huán)境更有利于桑樹與叢枝菌根形成互利共生的關(guān)系。

土壤 pH、土壤結(jié)構(gòu)和土壤有機物能對重金屬的溶解性和遷移性產(chǎn)生較大影響（Romkens 和Salomons，1998）。其中土壤pH是影響微量營養(yǎng)元素可利用性和吸收的最重要的因素。因為Fe和Zn在土壤中的溶解性強烈地依賴于pH值（Lindsay and Norvell，1978；Obrador等，2007）。pH 在 5 以下時，釋放到土壤溶液的Mn將抑制許多植物的生長。在堿性土壤，F(xiàn)e的可利用性減少，限制了許多植物種類的分布（Olsson等，2010）。土壤可利用性Fe的含量在黃平明顯少于荔波（統(tǒng)計學(xué)上沒有差異）。石灰質(zhì)土壤可利用性的Cd和Mn的含量要高于砂土（Alvarez等，2006；Piao和Liu，2011），Cd和Mn具有相似的吸收模式。Tyler 和 Olsson（2001）報道說Cd在土壤溶液中的濃度遵循“U”型規(guī)律：pH在5~7之間隨pH的升高而降低，而在7~8之間隨pH的升高再增加。

決定土壤pH的因素較多：除土壤母巖影響外，真菌的存在總是以不同的程度降低土壤pH值，這取決于真菌種類（Orozco-Pati?o和Medina-Sierra，2013）。此外，植物生長本身能夠分泌酸化或堿化土壤環(huán)境的物質(zhì)（Moody和Aitken, 1997）。比如，番茄根系在土壤中生長引起根際的pH上升0.1~0.2單位。許多研究者在酸性土壤中觀察到同樣的現(xiàn)象，特別是施硝酸鹽時，在總體平衡中出現(xiàn)陰離子的吸收超過陽離子的吸收（Hinsinger等，2003）。但在石灰質(zhì)土壤中，番茄根系引起土壤溶液的輕微的酸化，表明質(zhì)子的釋放，引起根際0.1單位的pH降低（Chaignon等，2002）。這些實驗表明，植物對土壤pH的兩種相反的功能行為，使植物具有適應(yīng)不利的土壤條件的能力（Chaignon等，2002）。Singh 等人（1995）發(fā)現(xiàn)土壤pH從5.5上升到6.5時，小麥谷粒和胡籮卜中的Cd含量顯著降低，但隨后pH的上升反而促進Cd含量的上升。在土壤中施石灰，可減少植物對重金屬元素的吸收（Jackson and Aloway，1991）。

3.3 有機分泌物的影響

植物通過一系列的機制，來改進土壤的物理、化學(xué)和生物的性質(zhì)，其中包括根系分泌物的釋放（Richardson等，2009）。大多數(shù)植物種類選擇性地吸收重金屬的能力是有限的（Marschner，1995）。因此，植物體除吸收必須的微量元素之外，還能夠吸收植物所不需要的重金屬（比如 Cd），甚至對有毒重金屬的吸收能力非常強。有些重金屬元素在大多數(shù)土壤環(huán)境中的溶解度較低，植物可利用性較低。然而，Cd在土壤中具有易溶性，其生物可利用性相對較高（Clemens，2006）。植物根系喜歡吸收金屬元素的形態(tài)是溶解的游離的陽離子狀態(tài)（Cd2+、Zn2+、Cu2+,），同樣喜好與有機配位基相結(jié)合形成金屬絡(luò)合物，尤其是 Zn（Ondrasek 和 Rengel，2012）。根系分泌物包括：低分子量的氨基酸、有機酸、糖類、酚類以及次生的新陳代謝產(chǎn)物（Vos等，2012）。這些分泌物與重金屬形成絡(luò)合物后容易被植物所吸收（Shenker等，2001）。

根際沉積和根系的轉(zhuǎn)換代謝的有機物要占輸入土壤總碳的40%，是土壤微生物過程的主要驅(qū)動者（Richardson等，2009）。但真菌是專性共生物，如果沒有植物所供給的光合產(chǎn)物，真菌就不能生存（Smith等，2010；Piao和Liu，2011）。因此，菌根植物根系的分泌作用是一個非常重要的過程，能把5%~20%的光合作用所產(chǎn)生碳釋放到根際（Vos等，2012），在植物的根系系統(tǒng)周圍形成一個小型地帶，使它具有特異的物理、生物化學(xué)以及生態(tài)性質(zhì)（Vos等，2012）。菌根的共生作用可改變根系分泌物的釋放（Hodge，2000；Jones等，2004）。植物調(diào)配給根外AM菌絲體的C也隨土壤pH的上升而減少，土壤pH從5.5變化至 8.5的過程中，13C含量的減少幅度為 1.2 μg·g-1（Vos等，2012）。本研究結(jié)果也表明，具有高pH的黃平輸入到根系的光合作用產(chǎn)物遠低于具有低pH的荔波。菌根植物種類能夠釋放具有高親和力的能與重金屬形成易被植物所吸收的絡(luò)合物的螯合劑非-蛋白氨基酸之類的物質(zhì)（Marschnetr，1995；Shenker 等，2001）。。另外，根系分泌物的另一個重要作用是溶解重金屬，使它具有較強的移動能力，以便被宿主植物所吸收（Theuerl和 Buscot，2010；Piao 和 Liu，2011）。這就能夠解釋為什么在較低pH環(huán)境條件下生長的桑樹的葉片含有較高含量的重金屬。

3.4 元素之間相互作用的影響

土壤中的鈣（Ca）可抑制植物對 Cd的吸收（Tyler and McBride，1982），這與本研究結(jié)果相一致。當然，植物對Cd的吸收能力與植物種類相關(guān)。比如，Ramos 等人（2002）的實驗表明，萵苣植物具有相對高的吸收和遷移Cd的能力。他們的實驗證明Mn在莖葉中的含量隨Cd含量的增加而增加，而Fe、Cu和Zn的含量隨Cd含量的增加而降低。Cd抑制Mn的吸收，以及從根系到莖葉的遷移。在紫花光葉苕中Cd與Mn，Zn與Fe之間的吸收模式一致（Piao和Liu，2010）。然而，在自然土壤環(huán)境條件下，桑樹中重金屬之間表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系。因此，重金屬元素間相互作用的關(guān)系是復(fù)雜無同一規(guī)律可尋的。

4 結(jié)論

從本實驗結(jié)果可得出如下結(jié)論：叢枝菌根真菌的侵染率不能作為菌根植物對重金屬元素的吸收能力的良好指示。菌根植物最重要的特性是營養(yǎng)物和光合作用產(chǎn)物的雙向傳遞，即是把大量的糖類輸送到根系和土壤中的真菌，并把土壤中的元素吸收到植物葉片。因此，輸送到根系的糖類含量的大小決定了以AM-為媒介的重金屬元素的吸收能力。本研究結(jié)果表明荔波桑樹輸入到根系的糖類含量遠高于黃平，荔波桑樹葉片中的重金屬含量也遠高于黃平。這是由于荔波和黃平之間土壤pH的差異性所導(dǎo)致。

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