劉志薇,吳致君,黎星輝,李 彤,莊 靜

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院茶葉科學(xué)研究所,江蘇南京210095)

茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及其特性分析

劉志薇,吳致君,黎星輝,李 彤,莊 靜①

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院茶葉科學(xué)研究所,江蘇南京210095)

基于茶樹(shù)品種‘迎霜’(Camellia sinensis‘Yingshuang’)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),采用PCR方法從其基因組DNA中克隆獲得編碼DREB轉(zhuǎn)錄因子的CsDREB-A1基因。結(jié)果顯示:該基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為585 bp,編碼194個(gè)氨基酸,該氨基酸序列即為CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子。CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子的N端含有AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子典型的AP2 DNA保守結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中包含保守的YRG元件和WLG基序,且其第14位和第19位分別為纈氨酸和谷氨酸,該結(jié)構(gòu)域的上、下游分別有PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAW特征序列。通過(guò)進(jìn)化分析可知CsDREBA1轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/ERF家族中DREB亞族的A1組,其與茶樹(shù)CBF轉(zhuǎn)錄因子的相似性較高,與擬南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕等植物的DREB類轉(zhuǎn)錄因子也有較高的相似性。CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子為親水性蛋白,理論相對(duì)分子質(zhì)量為21 165.4,理論等電點(diǎn)為pI 9.56,堿性、酸性、芳香族和脂肪族氨基酸比例分別為18%、10%、6%和18%;該轉(zhuǎn)錄因子只有1個(gè)包含53個(gè)氨基酸的無(wú)序化區(qū)域,且大部分無(wú)序化氨基酸位于AP2 DNA保守結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi),無(wú)序化氨基酸的比例為27.32%;在CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子的三級(jí)結(jié)構(gòu)中,N端有1個(gè)α螺旋、C端有3個(gè)β折疊。研究結(jié)果顯示:CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子可能與茶樹(shù)的抗寒性相關(guān)。

茶樹(shù);CsDREB-A1基因;轉(zhuǎn)錄因子;抗寒性

茶樹(shù)〔Camellia sinensis(Linn.)O.Ktze.〕為山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia Linn.)多年生常綠木本植物,起源于中國(guó)西南部,栽培歷史悠久[1]。作為著名的保健飲品,茶與咖啡、可可并稱為當(dāng)今世界三大無(wú)酒精飲料,因而茶樹(shù)具有重要的應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值。然而,目前關(guān)于茶樹(shù)抗逆機(jī)制的研究仍處于初級(jí)階段,尤其是利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆和研究相關(guān)抗逆基因的研究報(bào)道相對(duì)較少,并且主要集中于功能酶和抗病蟲(chóng)害相關(guān)基因的研究[2-4]。目前,低溫脅迫仍是茶葉質(zhì)量和產(chǎn)量的主要限制因素之一,因而,研究者們對(duì)一些與茶樹(shù)抗寒性相關(guān)的ICE1[5]、RAV[6-7]、ERF[8-9]等轉(zhuǎn)錄因子的基因進(jìn)行了克隆及初步的功能分析。通過(guò)研究茶樹(shù)逆境調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與功能,可以明確轉(zhuǎn)錄因子之間及其與DNA之間相互作用的機(jī)制,為調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)以及控制受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的一系列功能基因提供研究基礎(chǔ),并對(duì)深入了解茶樹(shù)的逆境調(diào)控機(jī)制以及實(shí)現(xiàn)茶樹(shù)抗寒性改良有重要意義。

DREB(dehydration-responsiveelementbinding factors)類轉(zhuǎn)錄因子是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的1個(gè)亞族,分成A1、A2、A3、A4、A5和A6共6個(gè)組[10-11],其DNA結(jié)合域包含能夠特異結(jié)合DRE/CRT順式作用元件的核心序列。在植物低溫應(yīng)答反應(yīng)的非依賴ABA途徑中,DRE/CRT和CBF1(CRT/DRE-binding factor 1)是重要的作用元件,具有感受上游信號(hào)并將外界低溫信號(hào)向下游傳遞、激活冷馴化反應(yīng)各組成因子的作用[12]。編碼DREB蛋白的CBF1[13]、DREB1A和DREB2A[14]基因首先分離自擬南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕cDNA文庫(kù),迄今為止,已從諸多植物中克隆得到大量DREB類轉(zhuǎn)錄因子[15-19],并且已經(jīng)證實(shí)其主要受低溫、干旱和高鹽等逆境的誘導(dǎo)表達(dá),少數(shù)受ABA的誘導(dǎo)表達(dá)。目前,DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及應(yīng)用已成為植物抗逆分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。在茶樹(shù)的抗逆性研究中有關(guān)DREB類轉(zhuǎn)錄因子的研究尚不多見(jiàn),僅推測(cè)DREB類轉(zhuǎn)錄因子可能參與茶樹(shù)的抗寒過(guò)程[20-21],但具體作用機(jī)制仍不清楚。

鑒于此,作者采用PCR方法從茶樹(shù)品種‘迎霜’(‘Yingshuang’)基因組DNA中克隆得到編碼茶樹(shù)DREB轉(zhuǎn)錄因子的基因,并對(duì)該基因編碼的氨基酸序列及其保守域、進(jìn)化關(guān)系和分子結(jié)構(gòu)模型等方面進(jìn)行詳細(xì)分析,以期為深入研究DREB類轉(zhuǎn)錄因子在茶樹(shù)逆境調(diào)控機(jī)制中的作用及茶樹(shù)抗寒品種的選育奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試對(duì)象為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院茶葉科學(xué)研究所種植的茶樹(shù)品種‘迎霜’,取2年生無(wú)病蟲(chóng)害扦插苗的幼嫩葉片提取基因組DNA。

大腸桿菌菌株DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存;pMD18-T載體、Ex Taq DNA聚合酶、Prime Script RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、10×Ex Taq buffer(Mg2+free)、dNTPs mixture、MgCl2、DL2000 DNA marker和DNA回收試劑盒等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;Quick RNA Isolation Kit總RNA提取試劑盒購(gòu)自華越洋生物科技有限公司。引物合成和DNA測(cè)序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法 參照文獻(xiàn)[22]采用CTAB法提取基因組DNA。

1.2.2 擴(kuò)增引物的序列設(shè)計(jì)及合成 以擬南芥AtDREB1A基因(GenBank登錄號(hào)AT4G25480.1)為序列探針,對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的茶樹(shù)品種‘迎霜’的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索,得到相關(guān)序列片段;通過(guò)拼接獲得茶樹(shù)DREB轉(zhuǎn)錄因子的基因序列,并據(jù)此設(shè)計(jì)1對(duì)引物ZJR76和ZJR77,用于茶樹(shù)CsDREB-A1基因的克隆。引物ZJR76和ZJR77的序列分別為5′-ATGTGT TCTCACTTTTCTGAC-3′和5′-TCAATGTAAAATATTT TCTCC-3′。

1.2.3 茶樹(shù)CsDREB-A1基因的克隆 以上述基因組DNA為模板、采用引物ZJR76和ZJR77進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系總體積20 μL,包括10×Ex Taq buffer(Mg2+free)2 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs mixture 1.6 μL、基因組DNA 1 μL、25 mmol·L-1MgCl21.2 μL、5 U·μL-1Ex Taq DNA聚合酶0.3 μL、引物各1 μL和重蒸水11.9 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s、52℃退火30 s、72℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);最后于72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分離,用DNA回收試劑盒回收并純化,然后連接到pMD18-T載體上,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中;以DH5α單菌落菌液為模板、按照上述反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。選擇產(chǎn)生單一明亮條帶的菌液進(jìn)行測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站(http:∥www.ncbi.nlm.nih. gov/)上的相關(guān)程序?qū)Λ@得的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行BLAST比較和保守域預(yù)測(cè)。利用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列疏水性和親水性分析,并將獲得的氨基酸序列與擬南芥等植物的DREB-A1類轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)。使用在線工具包SMS (http:∥www.bio-soft.net/sms/)和ExPASy-ProtParam (http:∥web.expasy.org/protparam/)完成氨基酸序列組成和理化性質(zhì)分析;采用MEGA 5.0軟件[23]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù);利用FoldIndex程序[24]完成蛋白質(zhì)無(wú)序化特性分析;利用Swiss-Model[25]軟件建立蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型,并采用Swiss-Pdb Viewer軟件作圖。

圖1 茶樹(shù)CsDREB-A1基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide acid sequence of CsDREB-A1 gene from Camellia sinensis(Linn.)O.Ktze.and its encoded amino acid sequence

圖2 茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子的保守域預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of conserved domain of CsDREB-A1 transcription factor from Camellia sinensis(Linn.)O.Ktze.

2 結(jié)果和分析

2.1 茶樹(shù)CsDREB-A1基因的序列分析

以茶樹(shù)品種‘迎霜’葉片的基因組DNA為模板、采用引物ZJR76和ZJR77擴(kuò)增獲得1條長(zhǎng)約600 bp的CsDREB-A1基因片段。序列分析結(jié)果(圖1)表明:該基因片段含有1個(gè)長(zhǎng)度為585 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF,open reading frame),共編碼194個(gè)氨基酸,此氨基酸序列即為茶樹(shù)CsDREB-A1類轉(zhuǎn)錄因子。

2.2 茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子與其他植物相關(guān)氨基酸序列的進(jìn)化和序列比對(duì)分析

對(duì)茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子的保守域預(yù)測(cè)結(jié)果(圖2)顯示:第80位至第110位的氨基酸序列含有1個(gè)AP2 DNA保守結(jié)合結(jié)構(gòu)域,表明該轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/ERF家族。

為了進(jìn)一步分析該轉(zhuǎn)錄因子與AP2/ERF家族相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子之間的進(jìn)化關(guān)系,選取擬南芥AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子與茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建同源進(jìn)化樹(shù)(圖3),結(jié)果表明:茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子中DREB亞族的A1組。

對(duì)茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列進(jìn)行BLAST同源檢索與比對(duì),得到與其相似度較高的多種植物DREB類轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列。多重比對(duì)結(jié)果(圖4)顯示:茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥、毛果楊(Populus trichocarpa Torr.et Gray)、粗檸檬(Citrus jambhiri Lush.)、Malus domestica Borkh.、沙梨〔Pyrus pyrifolia(Burm.f.)Nakai〕、煙草(Nicotiana tabacum Linn.)、馬鈴薯(Solanum tuberosum Linn.)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Garetn.)、大豆〔Glycine max(Linn.)Merr.〕、蓖麻(Ricinus communis Linn.)、棉花(Gossypium hirsutum Linn.)和辣椒(Capsicum annuum Linn.)等種類的DREB類轉(zhuǎn)錄因子間具有較高的相似性。茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子的N端具有AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子典型的AP2 DNA保守結(jié)合結(jié)構(gòu)域,并含有保守的YRG元件和WLG基序;該保守結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第14位和第19位氨基酸分別為纈氨酸(V)和谷氨酸(E)。此外,在該保守結(jié)合結(jié)構(gòu)域的上游有PKK/RPAGRxKFxETRHP特征序列,其下游有DSAW特征序列。

圖3 茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis on transcription factors of CsDREB-A1 from Camellia sinensis(Linn.)O.Ktze.and AP2/ERF family from Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.

2.3 茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子與其他植物相關(guān)氨基酸序列的組成及理化性質(zhì)分析

借助在線工具包SMS和ExPASy-ProtParam分析出的茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子與其他植物DREB類轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列組成及理化性質(zhì),結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明:這些植物的DREB類轉(zhuǎn)錄因子氨基酸數(shù)量為190～270,理論相對(duì)分子質(zhì)量為20 000～29 000;理論等電點(diǎn)差異較大,茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子的理論等電點(diǎn)最大,達(dá)到pI 9.56,其他種類的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的理論等電點(diǎn)為pI 5～pI 8。各轉(zhuǎn)錄因子的堿性和酸性氨基酸比例分別為12%～18%和10%～17%,芳香族和脂肪族氨基酸比例分別為6%～10%和13%～18%,脂肪族氨基酸比例明顯高于芳香族氨基酸?？傮w來(lái)說(shuō),在親緣關(guān)系相近的種類間,DREB類轉(zhuǎn)錄因子的堿性氨基酸、酸性氨基酸、芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸的比例差異均較小。

圖4 茶樹(shù)CsDERB-A1轉(zhuǎn)錄因子與其CBF轉(zhuǎn)錄因子和其他植物DERB類轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果Fig.4 Multiple alignment result of amino acid sequences of CsDERB-A1 transcription factor from Camellia sinensis(Linn.)O.Ktze.with its CBF transcription factor and DERB transcription factors from other species

表1 茶樹(shù)CsDERB-A1轉(zhuǎn)錄因子與其他植物DREB類轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列組成及理化性質(zhì)Table1 Composition and physicochemical property of amino acid sequence of CsDERB-A1 transcription factor from Camellia sinensis(Linn.) O.Ktze.and DREB transcription factors from other species

圖5 茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的疏水性及親水性Fig.5 Hydrophobicity and hydrophilicity of amino acid sequence of CsDREB-A1 transcription factor from Camellia sinensis(Linn.)O.Ktze.

由茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的疏水性和親水性分析結(jié)果(圖5)可見(jiàn):該轉(zhuǎn)錄因子疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)是第123位的丙氨酸(Ala),其次是第58位的亮氨酸(Leu);親水性最強(qiáng)的位點(diǎn)是第71位的賴氨酸(Lys),其次是第66位的精氨酸(Arg)、第67位的甘氨酸(Gly)和第68位的甘氨酸(Gly)?？傮w來(lái)看,茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子的大部分氨基酸屬于親水性氨基酸,據(jù)此認(rèn)為茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子屬于親水性蛋白。

2.4 茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子的無(wú)序化分析

對(duì)茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子折疊狀態(tài)的無(wú)序化分析結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可以看出:茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子的整個(gè)氨基酸序列中只有1個(gè)無(wú)序化區(qū)域,該無(wú)序化區(qū)域包含53個(gè)氨基酸,無(wú)序化氨基酸比例為27.32%;總體而言,茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子的無(wú)序化程度并不明顯。無(wú)序化分析結(jié)果還顯示:茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子的無(wú)序化氨基酸位于第45位至第97位,且大部分無(wú)序化氨基酸位于AP2 DNA保守結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)。

2.5 茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

以擬南芥AtERF1(PDB ID:1gcc)為模型[26]、采用Swiss-Model軟件對(duì)茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)建模分析,具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖7。茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子的AP2 DNA保守結(jié)合結(jié)構(gòu)域與AtERF1相似,均在N端有1個(gè)α螺旋,在C端有3個(gè)反向平行的β折疊,分別為β折疊1、β折疊2和β折疊3(圖7-A);此外,在圖7中還可以清楚地看到茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子AP2 DNA保守結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的WLG基序(圖7-B)。

圖6 茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子折疊狀態(tài)的無(wú)序化分析Fig.6 Disorder analysis of folding state of CsDREB-A1 transcription factor from Camellia sinensis(Linn.)O.Ktze.

圖7 茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.7 Tertiary structure of CsDREB-A1 transcription factor from Camellia sinensis(Linn.)O.Ktze.

3 討論和結(jié)論

上述研究結(jié)果表明:茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族中DREB亞族的A1組,與茶樹(shù)的另外2個(gè)CBF轉(zhuǎn)錄因子(GenBank登錄號(hào)分別為AGN53198.1和ACB20695.1)具有較高的同源性,并且與多種親緣關(guān)系相近的植物的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的相似性較高,相似度均在70%以上。

茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子折疊狀態(tài)的無(wú)序化分析結(jié)果顯示:其無(wú)序化氨基酸比例僅27.32%,可能與其親水性氨基酸比例不高有關(guān)[24]。此外,CsDREBA1轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的無(wú)序化區(qū)域與AP2 DNA保守結(jié)合結(jié)構(gòu)域有交叉。由于氨基酸序列的無(wú)序化與氨基酸種類有較大關(guān)聯(lián)[27],且AP2 DNA保守結(jié)合結(jié)構(gòu)域是經(jīng)過(guò)與多種植物的AP2轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)之后確定的保守區(qū)間,因此,推測(cè)二者之間可能存在某種關(guān)聯(lián)性,具體關(guān)聯(lián)有待進(jìn)一步研究。

茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子的AP2 DNA保守結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有典型的保守的YRG元件和WLG基序,該保守結(jié)合結(jié)構(gòu)域第14位和第19位分別為纈氨酸和谷氨酸,這2個(gè)氨基酸是與DRE作用元件相結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)[10];同時(shí),AP2 DNA保守結(jié)合結(jié)構(gòu)域的上游有PKK/RPAGRxKFxETRHP特征序列,其下游有DSAW特征序列,這2段多肽序列只存在于與低溫脅迫相關(guān)的CBF1/DREB1B、CBF2/DREB1C和CBF3/ DREB1A轉(zhuǎn)錄因子中,被稱為CBF蛋白特征序列[28]。由此推測(cè),茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子屬于上述3類CBF轉(zhuǎn)錄因子的成員之一。目前,通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)在多種植物[29-35]中證實(shí)CBF轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)表達(dá)可明顯提高植株的抗寒能力,并已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物抗寒植株的培育。

對(duì)茶樹(shù)CsDREB-A1基因的分離結(jié)果表明茶樹(shù)中確實(shí)存在有DREB調(diào)控途徑,序列鑒定和分析結(jié)果也在一定程度上證明茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子參與茶樹(shù)應(yīng)答低溫的過(guò)程,這一結(jié)果對(duì)茶樹(shù)抗寒性的分子調(diào)控機(jī)制研究和茶樹(shù)基因工程都具有一定的意義。然而,由于茶樹(shù)DREB類轉(zhuǎn)錄因子存在多樣性,且低溫脅迫應(yīng)答過(guò)程中DREB類轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)多個(gè)基因表達(dá)形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),因此,以上基于生物信息學(xué)進(jìn)行的茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子功能的預(yù)測(cè)結(jié)果有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證;關(guān)于茶樹(shù)CsDREB-A1轉(zhuǎn)錄因子逆境調(diào)控的具體作用機(jī)制也需要經(jīng)過(guò)大量的研究加以證實(shí)。

[1] 童啟慶.茶樹(shù)栽培學(xué)[M].3版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2007: 4-33.

[2] 陸建良,林 晨,駱?lè)f穎,等.茶樹(shù)重要功能基因克隆研究進(jìn)展[J].茶葉科學(xué),2007,27(2):95-103.

[3] 韋朝領(lǐng),李葉云,江昌俊.茶樹(shù)逆境生理及其分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,36(3):335-339.

[4] 程國(guó)山,游新才,武 艷,等.低溫脅迫后抗寒茶樹(shù)品種‘紫陽(yáng)圓葉’的基因差異表達(dá)分析[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2013, 22(4):38-43.

[5] 時(shí) 慧,王 玉,楊路成,等.茶樹(shù)抗寒調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子ICE1密碼子偏性分析[J].園藝學(xué)報(bào),2012,39(7):1341-1352.

[6] 陳林波,李葉云,王 琴,等.茶樹(shù)冷誘導(dǎo)基因RAV的克隆與表達(dá)特性分析[J].植物生理學(xué)通訊,2010,46(4):354-358.

[7] 吳致君,黎星輝,房婉萍,等.茶樹(shù)CsRAV2轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與表達(dá)特性分析[J].茶葉科學(xué),2014,34(3):297-306.

[8] 陳林波,房 超,王 郁,等.茶樹(shù)抗逆相關(guān)基因ERF的克隆與表達(dá)特性分析[J].茶葉科學(xué),2011,31(1):53-58.

[9] 吳致君,盧 莉,黎星輝,等.茶樹(shù)AP2/ERF-B3類轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與表達(dá)特性分析[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,37 (4):67-75.

[10] SAKUMA Y,LIU Q,DUBOUZET J G,et al.DNA-binding specificity oftheERF/AP2domainofArabidopsisDREBs, transcription factorsCinvolved in dehydration-and cold-inducible gene expression[J].BiochemicalandBiophysicalResearch Communications,2002,290(3):998-1009.

[11] ZHUANG J,CAI B,PENG R H,et al.Genome-wide analysis of the AP2/ERF gene family in Populus trichocarpa[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2008,371(3):468-474.

[12] 王 洋,胡 喆,王崇英.擬南芥CBF/DREB途徑的研究進(jìn)展及其在植物基因工程中的應(yīng)用[J].生物物理學(xué)報(bào),2007,23 (2):101-108.

[13] STOCKINGER E J,GILMOUR S J,THOMASHOW M F. Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE,a cisacting temperature:differences and crosstalk between two stress signaling pathways[J].Current Opinion Plant Biology,1997,3 (3):217-223.

[14] LIU Q,KASUGA M,SAKUMA Y,et al.Two transcription factors,DREB1 and DREB2,with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression,respectively,in Arabidopsis[J].Plant Cell,1998,10(8):1391-1406.

[15] QIN Q L,LIU J G,ZHANG Z,et al.Isolation,optimization,and functional analysis of the cDNA encoding transcription factor RdreB1 in Oryza sativa L.[J].Molecular Breeding,2007,19(4): 329-340.

[16] SHEN Y G,ZHANG W K,HE S J,et al.An EREBP/AP2-type protein in Triticum aestivum was a DRE-binding transcription factor induced by cold,dehydration and ABA stress[J].Theoretical and Applied Genetics,2003,106(5):923-930.

[17] QIN F,LI J,ZHANG G Y,et al.Isolation and structural analysisof DRE-binding transcription factor from maize(Zea mays L.)[J]. Acta Botanica Sinica,2003,45(3):331-339.

[18] ZHOU J M,TANG X Y,MARTIN G B.The Pto kinase conferring resistance to tomato bacterial speck disease interacts with proteins that bind a cis-element of pathogenesis-related genes[J].The EMBO Journal,1997,16(11):3207-3218.

[19] LEUBNER-METZGER G,PETRUZZELLI L,WALDVOGEL R,et al.Ethylene-responsive element binding protein EREBP expression and the transcriptional regulation of class β-1,3-glucanase during tobacco seed germination[J].Plant Molecular Biology,1998,38 (5):785-795.

[20] 陳 暄,房婉萍,鄒中偉,等.茶樹(shù)冷脅迫誘導(dǎo)抗寒基因CBF的克隆與表達(dá)分析[J].茶葉科學(xué),2009,29(1):53-59.

[21] 郭秀麗,王 玉,楊路成,等.茶樹(shù)CBF1基因密碼子使用特性分析[J].遺傳,2012,34(12):1614-1623.

[22] RICHARDS E,REICHARDT M,ROGERS S.Preparation of plant DNA using CTAB[M]∥AUSUBEL J A,BRENT R,KINGSTON R E,et al.Current Protocols in Molecular Biology.Boston:Wiley, 1998:233-237.

[23] TAMURA K,PETERSON D,PETERSON N,et al.MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance,and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution,2011,28(10):2731-2739.

[24] PRILUSKY J,FELDER C E,ZEEV-BEN-MORDEHAI T,et al. Foldlndex:a simple tool to predict whether a given protein sequence is intrinsically unfolded[J].Bioinformatics,2005,21(16): 3435-3438.

[25] SCHWEDE T,KOPP J,GUEX N,et al.SWISS-MODEL:an automated protein homology-modeling server[J].Nucleic Acids Research,2003,31(13):3381-3385.

[26] ALLEN M D,YAMASAKI K,OHME-TAKAGI M,et al.A novel mode of DNA recognition by a beta-sheet revealed by the solution structure of the GCC-box binding domain in complex with DNA[J]. The EMBO Journal,1998,17(18):5484-5496.

[27] 田 攀,連繼勤.無(wú)序蛋白[J].生命的化學(xué),2009,29(2): 279-281.

[28] RIECHMANN J L,MEYEROWITZ E M.The AP2/EREBP family of plant transcription factors[J].Biological Chemistry,1998,379 (6):633-646.

[29] JAGLO-OTTOSEN K R,GILMOUR S J,ZARKA D G,et al. Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance[J].Science,1998,280:104-106.

[30] XIONG Y W,FEI S Z.Functional and phylogenetic analysis of a DREB/CBF-like gene in perennial ryegrass(Lolium perenne L.) [J].Planta,2006,224(4):878-888.

[31] LI D F,ZHANG Y Q,HU X N,et al.Transcriptional profiling of Medicago truncatula under salt stress identified a novel CBF transcription factor MtCBF4 that plays an important role in abiotic stress responses[J].BMC Plant Biology,2011,11:109.

[32] TONG Z,HONG B,YANG Y,et al.Overexpression of two chrysanthemum DgDREB1 group genes causing delayed flowering or dwarfism in Arabidopsis[J].Plant Molecular Biology,2009,71 (1/2):115-129.

[33] GILMOUR S J,ZARKA D G,STOCKINGER E J,et al.Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR gene expression[J].The Plant Journal:for Cell and Molecular Biology, 1998,16(4):433-442.

[34] GUTHA L R,REDDY A R.Rice DREB1B promoter shows distinct stress-specific responses,and the overexpression of cDNA in tobacco confers improved abiotic and biotic stress tolerance[J]. Plant Molecular Biology,2008,68(6):533-555.

[35] QIN F,SAKUMA Y,LI J,et al.Cloning and functional analysis of a novel DREB1/CBF transcription factor involved in cold-responsive gene expression in Zea mays L.[J].Plant Cell Physiology,2004, 45(8):1042-1052.

(責(zé)任編輯:佟金鳳)

Gene cloning of CsDREB-A1 transcription factor from Camellia sinensis and its characteristic

analysis LIU Zhiwei,WU Zhijun,LI Xinghui,LI Tong,ZHUANG Jing①(Tea Research Institute, College of Horticulture,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China),J.Plant Resour.& Environ.2014,23(4):8-16

On the basis of transcriptome data of Camellia sinensis‘Yingshuang’,CsDREB-A1 gene encoding DREB transcription factor was cloned from its genomic DNA by PCR method.The results show that length of open reading frame(ORF)of this gene is 585 bp,which encodes 194 amino acids,this amino acid sequence is CsDREB-A1 transcription factor.The N-terminal of CsDREB-A1 transcription factor contains the typical conserved AP2 DNA-binding domain of AP2/ERF family transcription factors, in which contains conserved YRG element and WLG motif,and there are valine and glutamic acid at its 14th and 19th sites,respectively.And there are PKK/RPAGRxKFxETRHP and DSAW characteristic sequences in upstream and downstream of the binding domain,respectively.According to phylogenetic analysis,it is known that CsDREB-A1 transcription factor belongs to A1 group of DREB subfamily in AP2/ERF family.And CsDREB-A1 transcription factor has high similarity to CBF transcription factor from C.sinensis,and also has high similarity to DREB transcription factor from Arabidopsis thaliana (Linn.)Heynh.,etc.CsDREB-A1 transcription factor is hydrophilic protein,its theoretical relative molecular weight is 21 165.4,theoretical isoelectric point is pI 9.56,percentage of basic,acidic, aromatic and aliphatic amino acids is 18%,10%,6%and 18%,respectively.This transcription factor only has one disordered region containing 53 amino acids,and most of disordered amino acids are locatedin conserved AP2 DNA-binding domain and percentage of disordered amino acids is 27.32%.In tertiary structure of CsDREB-A1 transcription factor,its N-terminal contains one α-helix and its C-terminal contains three β-strands.It is suggested that CsDREB-A1 transcription factor is probably related to cold resistance of C.sinensis.

Camellia sinensis(Linn.)O.Ktze.;CsDREB-A1 gene;transcription factor;cold resistance

Q751;S571.1

A

1674-7895(2014)04-0008-09

10.3969/j.issn.1674-7895.2014.04.02

2014-04-21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31200520);江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK2012774);教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(20120097120031);中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2013M541686);國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410307030)

劉志薇(1990—),女,河北邯鄲人,碩士研究生,主要研究方向?yàn)椴铇?shù)分子生物學(xué)。

①通信作者E-mail:zhuangjing@njau.edu.cn