吳琴,陳珣

(1.貴州理工學院制藥工程學院,貴陽 550003;2.畢節(jié)學院化學工程學院,畢節(jié) 551700)

單因素實驗結(jié)合響應面法優(yōu)化朱砂根總皂苷的提取工藝

吳琴1,陳珣2

(1.貴州理工學院制藥工程學院,貴陽 550003;2.畢節(jié)學院化學工程學院,畢節(jié) 551700)

目的 優(yōu)化朱砂根的最佳提取工藝,為朱砂根的研究提供基礎。方法以朱砂根總皂苷的含量為指標,在單因素實驗的基礎上,根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設計原理,設計3因素3水平的響應面法實驗,優(yōu)化朱砂根的最佳提取工藝。結(jié)果單因素實驗結(jié)合響應面法優(yōu)化得到的朱砂根最佳提取工藝為:以70%乙醇為溶劑,提取溫度70℃,料液比為1∶16,提取時間為3 h,在此條件下,總皂苷百分含量的理論預測值為2.29%。結(jié)論通過響應面法優(yōu)化得到的朱砂根總皂苷提取工藝穩(wěn)定、可靠,具有一定的實用價值。

朱砂根;總皂苷;響應面法;提取工藝

朱砂根為紫金牛科紫金牛屬植物,是《中華人民共和國藥典》1977年版收載的紫金牛屬兩種藥用植物之一[1],主要分布于我國浙江、湖南、湖北、重慶、四川、貴州、云南、廣東和廣西等省區(qū)。藥效學研究表明,朱砂根總皂苷具有明顯抑制癌細胞增殖、調(diào)節(jié)免疫力、抗炎抑菌、抗病毒等作用,朱砂根所含三萜皂苷有興奮子宮、抗早孕的作用[2-5]。響應面法已廣泛用于中藥有效成分的提取工藝研究[6-8]。為了系統(tǒng)詳盡地研究黔產(chǎn)朱砂根總皂苷的提取工藝,筆者在單因素實驗的基礎上,通過響應面法對其提取條件進行優(yōu)化,為其進一步開發(fā)和利用提供有價值的工藝參數(shù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海秼馬恒溫設備廠);DF-4電磁式礦石粉碎機(杭州卓馳有限公司);AUY220電子分析天平(日本島津公司); SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠); HH-4恒溫水浴鍋(金壇市宏華儀器廠);SHT型攪拌數(shù)顯恒溫電熱套(菏澤市牡丹區(qū)大華儀器有限公司);Cary 50紫外-可見分光光度計(美國瓦里安中國有限公司)。

1.2 試藥 實驗所用朱砂根購于貴陽;標準品人參皂苷RG1購于上海金穗生物科技有限公司;無水乙醇、石油醚、甲醇、冰醋酸、高氯酸、香蘭素均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 朱砂根總皂苷含量的測定方法

2.1.1 人參皂苷標準曲線的繪制 準確稱取人參皂苷RG1標準品1.7 mg,甲醇溶解定容至10 mL,配制成0.17 mg·mL-1標準溶液。分別取上述人參皂苷RG1標準液0.0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL于10 mL量瓶中,然后加入5%香蘭素-冰醋酸溶液0.1 mL,高氯酸0.25 mL,搖勻后置于60℃恒溫水浴鍋加熱反應40 min,冷卻5 min后加入冰乙酸1 mL,搖勻,80%甲醇定容,搖勻,靜置15 min[9]。以80%甲醇溶劑作空白參比進行全波長掃描,供試品溶液在540 nm處有最大吸收。故選擇540 nm為測定波長,測定各標準溶液的吸光度(A),然后以人參皂苷濃度(C)為橫坐標,A為縱坐標繪制標準曲線,得線性回歸方程A= 11.740C-0.147(r=0.999 7)。

2.1.2 樣品含量測定 準確稱取處理過的朱砂根樣品于50 mL圓底燒瓶中,加入70%乙醇后加熱提取,抽濾定容至50 mL搖勻,得供試品溶液。將供試品溶液減壓濃縮至原來體積的1/3后用石油醚萃取,脫去脂溶性成分,收集含朱砂根粗皂苷的浸提濃縮液。準確移取0.2 mL濃縮液于10 mL量瓶中,其余步驟與標準曲線的制作方法相同,測其吸光度。根據(jù)回歸方程計算出皂苷的濃度,進而可以得到朱砂根中總皂苷的百分含量。

式中,W為樣品質(zhì)量,C為皂苷溶液濃度,Y為朱砂根總皂苷的百分含量,50為所取測定溶液的倍數(shù)。

2.2 單因素考察

2.2.1 料液比的考察 按照“2.1.2”項的實驗步驟,其他條件不變,料液比分別考察了1∶8,1∶12,1∶16,1∶20及1∶24。實驗結(jié)果顯示,總皂苷百分含量隨著料液比的增大而增加,當料液比為1∶16時,總皂苷得率較大,而再增加溶劑體積總皂苷的含量有所降低,因此選擇1∶16為提取總皂苷的最佳料液比。

2.2.2 提取時間的考察 按照“2.1.2”項的實驗步驟,其他條件不變,提取時間分別考察了2.0,2.5, 3.0,3.5,4.0 h。結(jié)果顯示,總皂苷得率一開始隨著提取時間的增大而增加,而當提取時間為3.5 h后有所下降,因此提取時間選3 h。

2.2.3 提取溫度的考察 按照“2.1.2”項的實驗步驟,其他條件不變,提取溫度分別考察了60,65,70, 75,80℃。結(jié)果顯示,總皂苷得率隨著溫度的上升而增大。當溫度為70℃時,總皂苷得率最大,繼續(xù)升高溫度,總皂苷得率沒有明顯提高,因此提取溫度控制在70℃。

2.3 響應面法確定朱砂根總皂苷提取最佳工藝條件

2.3.1 響應面實驗方案及結(jié)果 在單因素實驗的基礎上,根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設計原理對提取條件進行優(yōu)化,設計3因素3水平的響應分析實驗,選擇料液比、提取時間、提取溫度3個因素,分別以X1、X2、X3表示,每一個自變量的低、中、高實驗水平分別以-1,0,1進行編碼,以皂苷得率(Y)為響應值,各因素編碼值見表1,實驗方案及實驗結(jié)果見表2。

2.3.2 擬合回歸方程的建立 對實驗數(shù)據(jù)進行多項式擬合回歸,以得率(Y)為因變量,料液比(X1)、浸提時間(X2)、提取溫度(X3)為自變量,建立回歸方程如下:

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。從表3可知回歸顯著,一次項、二次項和交互項都是顯著的,且方程的失擬項很小,表明該方程對實驗擬合情況好,實驗誤差小。因此,可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進行分析,各具體實驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系。

表1 響應面分析因子和水平表Tab.1 Factorsandlevelsofresponsesurface experiments

表2 響應面實驗方案及結(jié)果Tab.2 Projectsandresultsofresponsesurface experiment

2.3.3 響應面圖解析 根據(jù)回歸方程繪制出響應面曲圖,通過響應曲面圖可分析當料液比、浸提時間、提取溫度其中一個因素固定時,另外兩個因素對朱砂根總皂苷含量影響,結(jié)果見圖1。從圖1A可以得知,在料液比的量較低時,隨時間的增加總皂苷的百分含量逐漸增多,當料液比的量發(fā)生變化時,總皂苷百分含量逐漸增加,但不顯著。從圖1B得知,料液比和提取溫度對總皂苷的影響也是如此。圖1C可以看出,浸提時間對總皂苷得率的影響沒有提取溫度的顯著,但其等高線為橢圓,說明浸提時間和提取溫度交互作用顯著。

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果Tab.3 Variance analysis on regression equation

3 討論

本實驗以朱砂根總皂苷含量為指標,通過Design-Expert 8.05軟件分析,得到總皂苷的最佳提取條件為:采用70%的乙醇為溶劑,提取溫度70℃,料液比為1∶16,提取時間為3 h。在此條件下,總皂苷百分含量的理論預測值為2.29%。為了驗證模型方程的適用性和可靠性,采用上述工藝條件進行總皂苷提取實驗,在此條件下進行了3次平行實驗,總皂苷平均含量為2.28%(理論預測值為2.29%)。方差分析結(jié)果表明二者差異無統(tǒng)計學差異(P＞0.05),與預測值基本相符,說明此方程與實際情況擬合很好,充分驗證了模型的合理性。

本研究通過單因素實驗分別考察了提取溫度、料液比、提取時間對朱砂根總皂苷含量的影響,并應用響應面法對朱砂根總皂苷的提取條件進行了優(yōu)化,結(jié)果表明提取時間、料液比、提取溫度對朱砂根中總皂苷得率的影響不是單一的線性關系?；貧w分析和驗證實驗表明了該響應面法的合理性和可行性,有一定的使用價值。響應面法優(yōu)化提取朱砂根總皂苷,不僅節(jié)省了大量的時間和溶劑,而且操作簡單,提取的藥液雜質(zhì)少,有效成分易于分離、純化,提取溫度低,還能有效地保護活性物質(zhì)的成分,提高了經(jīng)濟效益,為今后有效利用朱砂根資源提供了一種實用、經(jīng)濟的方法。

圖1 料液比與浸提時間(A)、料液比與提取溫度(B)和提取時間與浸提溫度(C)交互影響總皂苷得率曲面圖Fig.1 Kyrtograph on interaction affect of solid-liquid ratio and extraction time(A)、solid-liquid ratio and extraction temperature(B)and extraction time and extraction temperature(C)on total saponins yeild

[1] 梁克明,王四旺,王曉娟.九節(jié)龍皂苷對8株人癌細胞的抑制作用[J].第四軍醫(yī)大學學報,2001,22(7):671-672.

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.028

Optimization of Extraction Technology for Total Saponins of Ardisia Crenata by Singlefactor Experiment Combined with Response Surface Methodology

WU Qin1,CHEN Xun2
(1.School of Pharmaceutical Engineering,Guizhou Institute of Technology,Guiyang 550003,China;2.School of Chemical Engineering,Bijie University,Bijie 551700,China)

Objective To optimize the extraction process ofArdisia crenatabased on the content of total saponins and to provide a basis for theArdisia crenatastudy.MethodsBased on the results of the single-factor tests and the Box-Behnken central composite experimental design principles,a response surface methodology which has three factors and three levels was designed to optimize the extraction process ofArdisia crenatabased on the content of saponins.ResultsA maximal extraction yield of total saponins reached 2.29%under the optimal conditions as follows:70%alcohol was used as extraction solvent with the material to liquid ratio of 1∶16,the extraction time was 3 h at 70℃.ConclusionThe optimized extraction process is accurate,reliable and practically valuable.

Ardisia crenata;Total saponins;Response surface methodology;Optimization of extraction

R282.71;TQ460.6

A

1004-0781(2014)08-1080-03

2013-09-24

2013-12-02

吳琴(1974-),女,貴州貴陽人,副教授,博士,主要從事新農(nóng)藥設計與合成。電話:(0)18212819544,E-mail: wuqin1974@163.com。