毛洪雅，楊潔瓊，季 永

硫化氫（Hydrogen sufide，H2S）被認為是繼 NO和CO之后發(fā)現(xiàn)的第三類新型氣體信號分子［1］，在各個系統(tǒng)尤其是心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生物學(xué)效應(yīng)。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，H2S后處理對離體大鼠缺血／再灌注（I／R）損傷的心肌具有保護作用［2］。其保 護機制 與 JAK2／STAT3通路 有 關(guān)［3］?？乖鲋车鞍祝╬rohibitin，PHB）是一種高度保守的蛋白質(zhì)。新近的研究發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)對心肌具有保護作用［4－5］，并且磷酸化的 STAT3可以調(diào)節(jié) PHB的表達［6］。然而，在外源性硫化氫后處理對心肌的保護作用中，是否通過JAK2／STAT3信號通路調(diào)節(jié)PHB蛋白而起保護作用尚未見報道。本研究采用原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞建立缺氧／復(fù)氧損傷模型，應(yīng)用JAK2／STAT3通路抑制劑AG490阻斷其通路，觀察其對硫化氫后處理心肌保護作用及PHB表達的影響，探討JAK2／STAT3信號通路是否通過調(diào)節(jié)抗增殖蛋白而在硫化氫（H2S）后處理中減輕心肌細胞缺氧／復(fù)氧損傷。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 DMEM培養(yǎng)基（Hyclone，美國）；胎牛血清（杭州四季青有限公司）；硫氫化鈉、AG490（Sigma，美國）；乳酸脫氫酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒（北京寶賽生物技術(shù)有限公司）；兔抗總STAT3和磷酸化STAT3抗體（CST，美國）；堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物公司）；SDS-PAGE凝膠配膠試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、BCIP／NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒（碧云天，中國）。

1.2 儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；倒置顯微鏡（日本 Olympus公司）；流式細胞儀（美國 Becton Dickinso公司）；酶標儀（美國Thermo公司）。

1.3 大鼠乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng) 取出生1～3 d的SD大鼠（徐州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供），參照文獻［7］，將左心室剪成1 mm3的小碎塊，用0.125%胰酶、0.08%膠原酶I分離、離心收集心肌細胞，制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)皿中，放在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)90 min，用差速貼壁法去除貼壁細胞，將細胞濃度調(diào)至1×109·L－1，同時加入0.1 mmol·L－15-溴脫氧核苷繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液。取培養(yǎng)72 h的心肌細胞進行實驗。

1.4 心肌細胞缺氧／復(fù)氧模型的制備 參照文獻［8］，用高純氮氣（1 L·min－1）飽和30 min，氧分壓低于7 kPa的缺氧液置換正常的培養(yǎng)液，然后將此心肌細胞置于含95%N2、5%CO2的密閉容器中，并與密閉容器一同放入培養(yǎng)箱中缺氧2 h，即為缺氧；然后將預(yù)先用純氧飽和30 min的復(fù)氧液置換缺氧液，并將此心肌細胞放入含95%空氣、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，即為復(fù)氧。

1.5 分組與方法 將培養(yǎng)的心肌細胞隨機分為6組：①正常對照組（Normal組）：將心肌細胞用復(fù)氧液培養(yǎng)4 h；②缺氧／復(fù)氧組（H／R組）：心肌細胞缺氧2 h，復(fù)氧2 h；③硫化氫后處理組（NP組）：缺氧2 h后，即刻用含10μmol·L－1的 NaHS復(fù)氧液培養(yǎng)30 min，后換成不含NaHS的復(fù)氧液培養(yǎng)1.5 h；④硫化氫后處理＋AG490組（N＋A組）：缺氧2 h后，用含NaHS和AG490的復(fù)氧液培養(yǎng)30 min，后換成不含二者的復(fù)氧液繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h；⑤AG490組（AG組）缺氧2h后，給予 10μmol·L－1的AG490復(fù)氧液培養(yǎng)30 min，后用無AG490的復(fù)氧液繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h；⑥溶媒組（DMSO組）：缺氧2 h后，用含0.1%的DMSO復(fù)氧液培養(yǎng)30 min，后用無DMSO的復(fù)氧液繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h。分別在缺氧前、復(fù)氧2 h檢測心肌細胞的存活率、培養(yǎng)液中LDH的釋放；復(fù)氧末，采用流式細胞術(shù)檢測各組心肌細胞的凋亡率；Western blot檢測t-STAT3、p-STAT3、PHB蛋白的表達情況。

1.6 心肌細胞存活率檢測 將心肌細胞按照每孔體積200μl接種至96孔板內(nèi)培養(yǎng)，按照實驗方案處理后，每孔加入20μl的MTT溶液（5 g·L－1），37℃孵育4 h后吸棄上清，每孔加入150μl的DMSO，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測各孔的吸光度。細胞存活率／%＝（試驗組檢測值／對照組檢測值）×100%。

1．7 培養(yǎng)液中LDH釋放量的檢測 分別在缺氧前、復(fù)氧2 h收集細胞培養(yǎng)液，按照試劑盒說明書測定上清液中LDH的釋放情況。

1.8 細胞凋亡檢測 用Annexin V-FITC凋亡試劑盒檢測心肌細胞的凋亡情況。各組細胞按照實驗方案處理后，用胰酶消化并收集各組細胞，加入預(yù)冷的PBS液1 ml洗滌2～3次；用200μl的 Binding buffer重懸細胞；將10μl Annexin V-FITC加入細胞懸液中并混勻，避光室溫孵育15 min；再加入300μl的Binding buffer和5μl的PI工作液，輕輕混勻并上機檢測。細胞凋亡率（%）以早期凋亡細胞（LR）和晚期凋亡細胞（UR）所占比例表示。

1．9 Western blot檢測 p-STAT3、t-STAT3、PHB表達水平 按照Folin酚法測定蛋白濃度，配平煮沸5 min，取等量的心肌樣本進行SDS-PAGE電泳，分離后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%的脫脂奶粉室溫封閉 2 h，加入一抗（p-STAT3，t-STAT3，1∶2 000稀釋；PHB，1∶500稀釋），4℃過夜，Washing buffer漂洗后，加入二抗（堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG，1∶1 000稀釋；堿性磷酸酶標記的兔抗山羊IgG，1∶1 000稀釋），室溫震蕩孵育 2 h，Washing buffer漂洗后BCIP／NBT顯色試劑盒顯色，掃描條帶，采用Image J圖像分析軟件對蛋白條帶進行半定量分析。

2 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，各組間比較采用單因素方差分析，差異有顯著性時采用LSD（least significant differernce）法進行兩兩比較。

3 結(jié)果

3.1 硫化氫后處理抑制缺氧／復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞毒性 實驗結(jié)果顯示，缺氧前各組心肌細胞的存活率、培養(yǎng)液中LDH的釋放基本一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。復(fù)氧2 h，NP組可明顯的抑制H／R引起的細胞毒性，使細胞存活率明顯的升高，LDH的釋放明顯減少，與H／R組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示硫化氫后處理可以對抗缺氧／復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞毒性，見Fig 1A、1B。

3．2 硫化氫后處理抑制缺氧／復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡 用Annexin V-FITC和PI對心肌細胞進行染色，流式細胞術(shù)檢測各組心肌細胞的凋亡情況。如Fig 2所示，與對照組（7.76±1.26）%相比，H／R組細胞凋亡率明顯的升高（25.37±4.73）%；與H／R組比較，NP組細胞凋亡率明顯的降低，為（14.97±2.03）%，說明硫化氫后處理可以抑制H／R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

Fig 1 Hydrogen sulfide postconditioning inhibits the cytotoxicity by hypoxia／reoxygenation（%，ˉx±s，n＝5）

Fig 2 Hydrogen sulfide postconditioning inhibits the apoptosis by hypoxia／reoxygenation（%，ˉx±s，n＝3）

3．3 硫化氫后處理對缺氧／復(fù)氧心肌細胞的STAT3通路的激活 實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，H／R組p-STAT3表達水平增高（P＜0.05）。加入NaHS使p-STAT3蛋白表達水平進一步升高（P＜0.05），而DMSO組與H／R組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。當(dāng)加入JAK2／STAT3信號通路抑制劑AG490后，與NP組相比，發(fā)現(xiàn)NaHS同時加入AG490明顯抑制了p-STAT3蛋白表達的升高 （P＜0.05），說明硫化氫后處理可以激活STAT3通路，見Fig 3。

Fig 3 Hydrogen sulfide postconditioning induces the STAT3 phosphorylation in cardiomyocytes（ˉx±s，n＝3）

3．4 硫化氫后處理上調(diào)心肌細胞PHB蛋白的表達Western blot結(jié)果顯示，應(yīng)用 10μmol·L－1的NaHS（H2S供體）后處理心肌細胞，可以明顯的增加PHB蛋白的表達水平，與對照組和H／R組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而 NaHS同時加入AG490可以明顯抑制升高的PHB蛋白的表達（P＜0.05），上述結(jié)果提示硫化氫后處理可以上調(diào)PHB蛋白的表達，并且可能與激活的STAT3有關(guān)，見Fig 4。

3．5 JAK2／STAT3信號通路介導(dǎo)硫化氫后處理對抗缺氧／復(fù)氧引起的心肌細胞損傷 為了明確硫化氫后處理是否通過JAK2／STAT3信號通路對抗缺氧／復(fù)氧引起的心肌細胞損傷，應(yīng)用JAK2／STAT3信號通路的特異性抑制劑AG490，發(fā)現(xiàn)與NP組比較，NaHS同時加入AG490使心肌細胞的毒性明顯升高，細胞的存活率下降，培養(yǎng)液中LDH的釋放增加（P＜0.05，見Fig1A、1B），同時細胞的凋亡率也明顯的增加（P＜0.05），見Fig2。提示AG490可以減弱硫化氫后處理的心肌保護作用，說明JAK2／STAT3信號通路參與了硫化氫后處理對抗缺氧／復(fù)氧引起的心肌細胞損傷。

Fig 4 Hydrogen sulfide postconditioning upregulates PHB expression in cardiomyocytes（ˉx±s，n＝3）

4 討論

近年來，越來越多的研究證明，H2S是心肌缺血／再灌注損傷的保護劑。本課題組前期的研究也表明，H2S后處理可以減輕離體大鼠心臟缺血／再灌注（I／R）損傷，對心肌具有保護作用［2］，其機制可能與抑制線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的開放［9］、激活細胞信號通路［3］、調(diào)節(jié) Cx43蛋白的表達［10］等有關(guān)，但 H2S對心肌缺血／再灌注損傷的具體保護機制仍未闡明。

抗增殖蛋白是一種核基因編碼的蛋白質(zhì)，最初被認為是一種核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)對心肌具有保護作用。在心肌缺血缺氧時，機體一般通過上調(diào)PHB的表達，發(fā)揮心肌保護作用［4－5］。并且過度表達的抗增殖蛋白可以保護由低氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞的死亡［11］。本實驗發(fā)現(xiàn)在NP組PHB蛋白的表達水平增加，同時LDH和細胞的凋亡率降低，推斷PHB在硫化氫后處理減輕心肌缺氧／復(fù)氧損傷中可能發(fā)揮重要的作用。

JAK2／STAT3信號通路是近年來新發(fā)現(xiàn)的一條重要的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路。研究發(fā)現(xiàn)［12－13］，該通路在藥物預(yù)處理及缺血后處理中均起到重要的作用。本課題組前期的實驗也得出p-STAT3在硫化氫后處理的心肌保護中發(fā)揮重要的作用［3］。另外，也有文獻報道p-STAT3可以調(diào)節(jié)PHB蛋白的表達，其抑制劑AG490可以抑制PHB的表達上調(diào)［6］。為了研究PHB在硫化氫后處理心肌中的保護機制，本實驗應(yīng)用JAK2／STAT3通路抑制劑AG490，觀察心肌細胞的存活率、LDH的釋放、細胞凋亡率以及PHB蛋白的表達情況。

通過本實驗，我們發(fā)現(xiàn)與H／R組相比，NP組心肌細胞的存活率明顯提高，LDH的釋放以及細胞凋亡率明顯下降，提示硫化氫后處理可以抑制缺氧／復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞毒性及細胞凋亡。而加入AG490抑制JAK2／STAT3通路后，H2S的上述保護作用被逆轉(zhuǎn)了，使心肌細胞的毒性增加，細胞凋亡率也明顯上升了，說明JAK2／STAT3可以介導(dǎo)H2S后處理抑制缺氧／復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷。同時我們還發(fā)現(xiàn)：在正常條件下，心肌細胞中p-STAT3和PHB蛋白的表達均較少；缺氧復(fù)氧后，二者表達量均上調(diào)，但在H2S后處理后，與H／R組比較，二者的表達水平明顯的升高，提示H2S后處理會誘導(dǎo)上述蛋白的表達；而加入AG490后，上述蛋白的表達量均又下降，提示AG490抑制了H2S后處理誘導(dǎo)p-STAT3和PHB蛋白的表達能力，提示JAK2／STAT3信號可能通過誘導(dǎo)PHB蛋白的表達而參與硫化氫后處理的心肌保護作用。與 Jia等［6］發(fā)現(xiàn)的 p-STAT3通過上調(diào)PHB蛋白的表達發(fā)揮保護心肌細胞作用相一致。

綜上所述，H2S后處理抑制缺氧／復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷可能與PHB的表達上調(diào)有關(guān)，并且可能是通過JAK2／STAT3信號通路的激活而實現(xiàn)的；但硫化氫后處理與PHB之間的具體機制還有待于進一步的研究。

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