張 松，朱 琳，郝 軍，鄭書深

糖尿病腎病是危害糖尿病病人生命的重要并發(fā)癥之一［1］，其發(fā)生涉及高血流灌注、氧化應(yīng)激［2］、糖基化末端產(chǎn)物、高血糖［3］、高胰島素和血脂異常等。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病人和實(shí)驗(yàn)動物的腎組織均出現(xiàn)脂滴積聚，進(jìn)一步證實(shí)脂質(zhì)積聚在糖尿病腎病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用［4］。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element binding protein-1，SREBP-1）是1993年首次從體外培養(yǎng)的人HeLa細(xì)胞核抽提物中純化出來的，該蛋白屬于螺旋－環(huán)－螺旋－亮氨酸鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族，其在脂質(zhì)代謝中起著重要調(diào)節(jié)作用，其高表達(dá)往往激活脂質(zhì)合成相關(guān)的酶基因，引起脂肪酸、甘油三酯的合成增多［5］。脂肪分化相關(guān)蛋白（adipose differentiation related protein，ADRP）是一種重要的脂滴表面蛋白，也是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的特征性指標(biāo)［6］。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯脂滴，脂質(zhì)代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1明顯上調(diào)并伴有脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）的升高；進(jìn)一步的體外研究又證實(shí)，給予人腎小管上皮細(xì)胞高糖刺激可上調(diào)SREBP-1，進(jìn)而增加 FASN和乙酰輔酶 A羧化酶（Acetyl CoA carboxylase，ACC）的表達(dá)［7］，細(xì)胞內(nèi)脂滴增多，提示高糖是糖尿病導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)積聚的原因之一，然而是否還有其他因素也參與其中還未完全闡明。

細(xì)胞因子已被證實(shí)參與了糖尿病的發(fā)生發(fā)展［8］，其中腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是其中重要的細(xì)胞因子。有研究揭示：TNF-α在肝細(xì)胞［9］和皮脂腺細(xì)胞中［10］，均可上調(diào)SREBP-1表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚。然而，TNF-α是否參與了糖尿病腎臟脂質(zhì)積聚還未見報道，因此，本課題組擬構(gòu)建糖尿病小鼠模型，檢測血清中TNF-α和腎臟脂質(zhì)的含量，明確二者之間的關(guān)系。對于闡明糖尿病腎臟脂質(zhì)積聚的機(jī)制有重要意義，也為將來的臨床治療提供可靠的靶點(diǎn)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料 SREBP-1抗體（可同時識別SREBP-1a和SREBP-1c）和 β-actin抗體購自于 Epitomics公司，ADRP抗體購自Santa Cruz公司。鏈脲佐菌素購自Sigma公司。SP法免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB購自北京中杉金橋試劑公司?？剐∈骉NF-αELISA試劑盒購自欣博盛公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型構(gòu)建 動物實(shí)驗(yàn)使用CD1小鼠，擬分為以下兩組：對照組和糖尿病組，每組7只。糖尿病模型采用腹腔注射鏈脲佐菌素150 mg·kg－1體重（streptozotocin，STZ，溶于 0.1 mol·L－1枸櫞酸鹽緩沖液中，pH值4.5），對照組只注射相當(dāng)體積的枸櫞酸鹽緩沖液，72 h后，空腹血糖大于16.7 mmol·L－1者確定為1型糖尿病模型。每周檢測血糖，剔除血糖恢復(fù)的小鼠（2只）。喂養(yǎng)1個月后，水合氯醛麻醉小鼠，眼球摘除取血，并處死動物切取腎臟。全血室溫放置約1 h后3 000 r·min－1離心10 min，收集血清；腎臟切取皮質(zhì)，部分置于中性福爾馬林固定，制作石蠟切片，部分液氮速凍后－70℃冰箱保存。

1.2.2 ELISA ELISA方法檢測正常和糖尿病小鼠血清的TNF-α水平。從冰箱中取出預(yù)包被的酶標(biāo)板，平衡至室溫，空白孔加通用稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)孔加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（0、15.6、31.25、62.5、125、250、500和 1 000 ng·L－1），樣品孔加待測的樣品100μl，封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃ 孵育90 min，后續(xù)步驟參照說明書進(jìn)行，最后酶標(biāo)儀上測量每個孔的OD450值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品的TNF-α濃度。

1.2.3 免疫組織化學(xué) 采用SP法，以PBS代替一抗作陰性對照。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)后3%過氧化氫室溫孵育20 min，血清37℃封閉30 min，一抗（1∶100稀釋），37℃孵育 2 h，PBS洗 3次，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min，PBS洗3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素37℃孵育30 min，PBS洗3次，DAB顯色、蘇木精復(fù)染、分化、返藍(lán)、脫水封片。

1.2.4 Western blot 腎組織塊加入10倍體積的冰冷裂解液，經(jīng)研磨后置于EP管中，4℃、12 000 r·min－1離心20 min，吸取上清，考馬斯亮藍(lán)法測定上清液蛋白濃度。每孔加80μg總蛋白，經(jīng)7.5%SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%BSA封閉，一抗（1∶1 000稀釋）4℃過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育2 h；滴加ECL發(fā)光試劑，在暗室中壓片、顯影和定影。條帶分析使用Gel-Pro analyzer軟件，目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin條帶的積分光密度（integrated optical density，IOD）比值作為相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2．1 糖尿病小鼠血清中TNF-α明顯升高 正常CD1小鼠血糖平均值為11.3 mmol·L－1，糖尿病小鼠的血糖平均值為30.78 mmol·L－1。ELISA檢測顯示正常對照小鼠血清TNF-α濃度平均為31.05 ng·L－1，糖尿病小鼠血清TNF-α濃度平均為240 ng·L－1。相比于正常對照組小鼠，糖尿病小鼠的血清TNF-α升高了大約7.73倍，經(jīng)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fig 1）。

Fig 1 Serum TNF-αconcentration of normal and diabetic mice

2．2 糖尿病小鼠腎臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因SREBP-1和ADRP明顯升高 免疫組織化學(xué)檢測顯示，糖尿病小鼠腎臟SREBP-1和ADRP表達(dá)主要定位于腎小管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)，呈明顯的棕黃色，顆粒狀，而正常小鼠腎臟僅見少量腎小管上皮細(xì)胞有棕黃色顆粒（Fig 2）。

Fig 2 SREBP-1 and ADRP expression in kidney of normal control mice and diabetic mice by immunohistochemistry（×400）

Western blot檢測結(jié)果見Fig 3，糖尿病小鼠腎臟SREBP-1前體片段、成熟片段和ADRP均明顯升高，分別是正常小鼠的2.31倍、1.74倍和1.72倍，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

Fig 3 Expression of SREBP-1 and ADRP in kidney of normal control mice and diabetic mice by Western blot

2．3 小鼠血清TNF-α含量和腎臟ADRP表達(dá)呈正相關(guān) 采用Pearson相關(guān)分析對小鼠血清TNF-α含量和腎臟ADRP表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果證實(shí)在正常小鼠和糖尿病模型小鼠，隨著血清中TNF-α含量的增加，腎臟ADRP表達(dá)也明顯增強(qiáng)，二者經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示有正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.914，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fig 4）。

3 討論

糖尿病是一種以血糖升高為臨床特征的慢性疾病，并發(fā)癥的出現(xiàn)嚴(yán)重危害人類健康，其中糖尿病腎病以腎臟高血流灌注、系膜細(xì)胞增生肥大、腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及腎間質(zhì)纖維化為特征，可導(dǎo)致腎功能不全，甚至引起患者死亡。研究揭示多種因素參與了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展，例如：高血糖、高血脂、糖基化終末產(chǎn)物、細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激。近年來，不斷有研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動物及糖尿病患者腎臟出現(xiàn)脂質(zhì)積聚，在系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多的脂滴。然而，具體的機(jī)制還未闡明［11］。

Fig 4 Correlation analysis between serum TNF-α and renal ADRP in mice

大量的研究已證實(shí)，免疫及炎癥反應(yīng)在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。糖尿病腎病可看作一種由代謝紊亂引起的炎癥性疾病［12］。炎癥因子可通過旁分泌和自分泌方式發(fā)揮病理生理作用，促進(jìn)腎臟細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)分泌和聚積、細(xì)胞肥大等，并且與疾病晚期腎小管間質(zhì)纖維化（tubular interstitial fibrosis，TIF）關(guān)系密切［13］。然而，炎癥因子是否和糖尿病腎臟的脂質(zhì)代謝異常相關(guān)目前尚未見報道。

腫瘤壞死因子有2種亞型：TNF-α和 TNF-β。TNF-α又被稱為惡質(zhì)素，主要由巨噬細(xì)胞分泌，其在體內(nèi)有兩種存在形式，一種為跨膜型（tmTNF-α），分子質(zhì)量為26 ku；另一種為游離型TNF-α，分子質(zhì)量為17 ku。其中，過多游離型TNF-α?xí)鹨幌盗械难仔愿腥炯白陨砻庖咝约膊。?4］。

本研究揭示糖尿病小鼠血清TNF-α水平明顯升高，這和 Hussain等［15］及 Kayal等［16］的研究相似，他們分別在糖尿病患者和實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)血清TNF-α的明顯升高。本研究還發(fā)現(xiàn)糖尿病腎臟脂質(zhì)代謝調(diào)控因子SREBP-1和脂滴標(biāo)記物ADRP也明顯高于正常對照小鼠，提示糖尿病狀態(tài)下，高TNF-α可能是引起腎臟脂質(zhì)調(diào)控因子升高的因素之一。進(jìn)一步對血清TNF-α水平和腎臟ADRP之間的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果揭示隨著血清TNF-α的升高，腎臟表達(dá) ADRP也相應(yīng)上調(diào)。相似地，Endo等［9］在小鼠的研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射TNF-α后，很快引起了血清游離脂肪酸升高和肝臟的脂質(zhì)積聚，同時肝臟脂肪酸合成酶和SREBP-1c mRNA水平的表達(dá)也明顯升高。Choi等［10］在SZ95人皮脂腺細(xì)胞的研究也揭示：TNF-α刺激人皮脂腺細(xì)胞，增加細(xì)胞內(nèi)脂滴形成，同時伴有脂肪酸合成酶上調(diào)和SREBP-1激活，但對PPARs未產(chǎn)生影響。綜上所述，血清TNF-α升高可能是導(dǎo)致糖尿病腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)積聚的因素。然而，涉及這一調(diào)控的具體機(jī)制還不清楚，有待深入的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究。

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