李娜娜，劉 銘，耿 越

松花粉具有很高的營養(yǎng)、保健及藥用價(jià)值，具有提高機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)代謝、調(diào)血脂和養(yǎng)顏等功效，在國內(nèi)外已被廣泛地應(yīng)用于保健品、藥品、化妝品和飼料添加劑等領(lǐng)域［1］。本實(shí)驗(yàn)室前期工作發(fā)現(xiàn)松花粉多糖尤其是其酯化多糖的免疫調(diào)節(jié)作用非常明顯［2］。多糖經(jīng)硫酸酯化修飾后，由于硫酸基團(tuán)的空間位阻和靜電排斥效應(yīng)等改變了多糖原來結(jié)構(gòu)，提高了硫酸酯化多糖水溶性，具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和抗凝血等生物活性［3］。鈣離子是機(jī)體中多種生理活動(dòng)不可或缺的離子，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高是T細(xì)胞被活化引起的最早變化之一［4］。T淋巴細(xì)胞內(nèi) Ca2＋濃度的上升主要通過CRAC通道來實(shí)現(xiàn)［5］，此外還可能通過P2X嘌呤受體［6］、電壓門控的鈣離子通道［7］來介導(dǎo) Ca2＋內(nèi)流作用。但目前對(duì)硫酸酯化多糖與Ca2＋的關(guān)系研究較少，對(duì)其作用機(jī)制尚不了解，其如何作用于T細(xì)胞表面，進(jìn)而影響胞內(nèi)鈣離子濃度仍需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)分別選用幾種鈣離子信號(hào)通路的抑制劑來研究松花粉酯化多糖組分SPPM60-D對(duì)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞［Ca2＋］i調(diào)控的可能信號(hào)通路，為馬尾松花粉多糖的實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑 破壁馬尾松（Pinus massoniana）花粉（破壁率高于95%）由煙臺(tái)新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)提供。水煮醇沉法提取馬尾松花粉粗多糖。三氯乙酸法除蛋白，不同濃度的乙醇分級(jí)沉淀，得60%乙醇組分PPM60，Sephacryl S-400HR分離純化得組分D，經(jīng)氯磺酸-吡啶法硫酸酯化得SPPM60-D，紅外光譜證實(shí)酯化成功。硫酸鋇比濁法測(cè)定SPPM60-D中硫含量，代入公式后算出取代度為1.202。尼龍毛柱法分離小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞。

胎牛血清（TBD，天津）；RPMI 1640（Gibco，美國）；2-APB、MTT、U73122、LY294002（Sigma，美國），F(xiàn)ura-2／AM、F127（Dojin，日本）；維拉帕米（verapamil，Ver）注射液（上海禾豐制藥有限公司）；TAK-242（Invitrogen，美國）；小鼠 IL-2、IL-4檢測(cè)試劑盒（四正柏生物技術(shù)有限公司，北京）；Anti-Mouse-CD3 FITC（eBioscience，美國）；尼龍毛（Kisker，德國）。

1.2 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（NUAIRE，美國），高壓蒸汽滅菌鍋（新華醫(yī)療器械廠），COIC型倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠），熒光分光光度計(jì)（Cary E-clipse，美國），5804R離心機(jī)（Eppendorf，德國），Stat-Fax-2100型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Awareness，美國）。

2 方法

2．1 多糖及其酯化多糖對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響常規(guī)方法制備小鼠脾臟細(xì)胞后，尼龍毛柱法分離純化小鼠T細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定活細(xì)胞比率＞93%，細(xì)胞液中加入FITC熒光標(biāo)記的抗小鼠CD3單克隆抗體，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，T細(xì)胞純度達(dá)74.6%。用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整T細(xì)胞濃度為2×109個(gè)·L－1，分別設(shè)置空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組及200 mg·L－1的PPM60-D和SPPM60-D實(shí)驗(yàn)組，MTT法測(cè)定T細(xì)胞增殖作用。

2．2 T細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的測(cè)定［8］制備2×109個(gè)·L－1小鼠脾臟T細(xì)胞懸液，在CO2培養(yǎng)箱中預(yù)溫5 min后加入終濃度為1 pmol·L－1的 Fura-2／AM，在 37℃恒溫避光孵育45 min，1 000 r·min－1離心5 min后，倒掉上清液，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液沖洗2～3次，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為10 mg·L－1的 ConA和 200 mg·L－1的 PPM60-D、SPPM60-D。測(cè)定條件：激發(fā)狹縫與發(fā)射狹縫寬度均設(shè)為10 nm，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)為500 nm，用340／380 nm雙波長(zhǎng)交替來測(cè)定熒光比值。作用5 min后熒光強(qiáng)度比值為R值，隨后加入終濃度為0.1%的Triton X-100破壞細(xì)胞膜，此時(shí)測(cè)定的為最大熒光比值Rmax，5 min時(shí)加入EGTA使其終濃度為10 mmol·L－1，測(cè)定最小熒光比值Rmin。［Ca2＋］i計(jì)算公式如下：

生理?xiàng)l件下，Kd＝224 nmol·L－1，［Ca2＋］i的單位為 nmol·L－1。

2．3 PPM60-D及SPPM60-D與抑制劑對(duì)T細(xì)胞內(nèi)［Ca2＋］i的影響 T細(xì)胞處理同“2.2”，實(shí)驗(yàn)組分別加入200 mg·L－1的 PPM60-D或 SPPM60-D。抑制劑組分別加入終濃度為1 mg·L－1的TAK-242，終濃度為 20μmol·L－1的 2-APB、LY294002，終濃度為10μmol·L－1的 U73122，終濃度為 10 mg·L－1的維拉帕米（Ver）孵育后，再加入 PPM60-D或SPPM60-D。鈣離子濃度測(cè)定同“2.2”。

2．4 PPM60-D及SPPM60-D對(duì)T細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響 取分離的脾臟T淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞密度2×109個(gè)·L－1，設(shè)置空白對(duì)照組，ConA（終濃度 10 mg·L－1）組，PPM60-D及 SPPM60-D（200 mg·L－1）組，TAK-242及 2-APB抑制劑組，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，1 200 r·min－1離心10 min，取上清放入EP管中，－20℃保存?zhèn)溆?。參照試劑盒的相關(guān)操作步驟檢測(cè)上清中的細(xì)胞因子。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以ˉx±s表示，組間比較采用F檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3．1 對(duì)T細(xì)胞增殖的影響 如Fig 1所示，用SPPM60-D培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞48 h后，對(duì)T細(xì)胞增殖能力明顯高于PPM60-D的作用（P＜0.01）。

Fig 1 Influences of PPM60-D and SPPM60-D on the proliferation of T lymphocytes（48h）（n＝3）

3．2 PPM60-D、SPPM60-D對(duì) T細(xì)胞內(nèi)［Ca2＋］i的影響 與對(duì)照組相比，LPS和SPPM60-D分別使T細(xì)胞內(nèi)［Ca2＋］i升高 211.5%、201.8%（Fig 2），而PPM60-D則無明顯作用。

Fig 2 Influences of ConA，PPM60-D and SPPM60-D on［Ca2＋］i level in T lymphocytes（n＝3）

3．3 T細(xì)胞鈣離子通路抑制劑對(duì)其胞內(nèi)［Ca2＋］i的影響 結(jié)果顯示，TLR-4抑制劑TAK-242對(duì)T細(xì)胞內(nèi)［Ca2＋］i并無明顯抑制作用，結(jié)果見Fig 3。說明SPPM60-D不是通過TLR-4發(fā)揮作用的。

PI3K的抑制劑LY294002使SPPM60-D促進(jìn)［Ca2＋］i升高率降為96.1%，抑制率為35%。說明除了PI3K之外還有其他信號(hào)分子介導(dǎo)SPPM60-D引起的T細(xì)胞內(nèi)［Ca2＋］i的升高。

另外L-型鈣離子通道的抑制劑Ver、PLC的抑制劑U73122和CRAC通道的抑制劑2-APB都能降低SPPM60-D引起的 T細(xì)胞內(nèi)［Ca2＋］i的升高，升高率與SPPM60-D相比分別降為104.2%、55.1%、48.6%（Fig 3），抑制率分別為 32.3%、48.6%、50.77%。說明SPPM60-D引起的T細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高主要是通過CRAC通道介導(dǎo)的，L-型鈣離子通道也起一定作用，但不是主要通道。

Fig 3 Influences of SPPM60-D on［Ca2＋］i level in T lymphocytes with TAK242／Verapamil／LY294002／U73122／2-APB（n＝3）

3．4 PPM60-D及SPPM60-D對(duì)T細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響 SPPM60-D作用后與對(duì)照組相比可使IL-2和IL-4分泌量分別升高6.94倍和5.95倍，且上清中IL-4的濃度要高于IL-2的濃度，而PPM60-D的作用效果不明顯。而加入TLR4的抑制劑TAK-242后，IL-2和IL-4的分泌水平與非抑制劑組相比并無明顯降低，加入CRAC的抑制劑2-APB后，IL-2和IL-4的分泌水平與無2-APB組相比明顯下降（Fig 4、Fig 5），SPPM60-D誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌水平上升與TLR4信號(hào)通路關(guān)系不大，而受細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)通路影響較大。

4 討論

Fig 4 Influences of PPM60-D and SPPM60-D with／without inhibitors TAK242，2-APB on cytokine IL-2 in T lymphocytes supernatant（n＝3）

Fig 5 The influence of PPM60-D and SPPM-D with／without inhibitors TAK242，2-APB on cytokine IL-4 in T lymphocytes supernatant（n＝3）

本實(shí)驗(yàn)室前期關(guān)于PPM60和SPPM60兩種多糖對(duì)多種細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的作用做過大量研究。夏瑜等［9］研究發(fā)現(xiàn)SPPM60對(duì)離體蟾蜍心臟有正性肌力作用，而維拉帕米可以抑制上述作用，猜測(cè)SPPM60的正性肌力作用可能是通過作用于心肌細(xì)胞上的L-型鈣離子通道從而增加鈣離子內(nèi)流實(shí)現(xiàn)的。劉媛等［10］研究發(fā)現(xiàn)PPM60明顯抑制心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，而SPPM60對(duì)胞內(nèi)鈣離子卻有促進(jìn)作用，用Ver處理，SPPM60的正向作用被抑制。說明PPM60和SPPM60對(duì)興奮性細(xì)胞的活性影響存在很大區(qū)別，硫酸化修飾可以明顯增強(qiáng)多糖的生物學(xué)活性。劉媛等［11］發(fā)現(xiàn)SPPM60能明顯提高小鼠脾細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度，提高率達(dá)188.4%，而PPM60作用并不明顯，Ver可部分抑制酯化多糖促鈣離子濃度升高的作用。在細(xì)胞外液無鈣離子時(shí)，IP3R抑制劑低分子肝素（LMWH）可以拮抗SPPM60促進(jìn)內(nèi)鈣的釋放；毛華等［8］研究發(fā)現(xiàn)SPPM60-A能明顯提高脾細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，而Ver和LMWH均可使SPPM60-A促［Ca2＋］i升高率有所降低，除此之外用TLR4、PI3K、PLC的抑制劑分別處理脾細(xì)胞，結(jié)果對(duì)SPPM60-A促［Ca2＋］i升高率都有不同程度的降低，推測(cè)鈣離子信號(hào)通路為SPPM60A－TLR4－PI3K－PLC－IP3R－Ca2＋。因此我們推測(cè)在興奮性細(xì)胞中，［Ca2＋］i的上升可能主要是通過L-型鈣離子通道介導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子濃度的上升，而在非興奮性細(xì)胞中，介導(dǎo)［Ca2＋］i升高的通路相對(duì)更復(fù)雜，除了可能通過L-型鈣離子通道外，還可能通過內(nèi)鈣釋放引起外鈣內(nèi)流的方式升高胞內(nèi)鈣離子濃度。前期工作研究對(duì)象是脾臟混懸細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Con-A與SPPM60-D都能明顯升高純化T細(xì)胞內(nèi)［Ca2＋］i。

Song等［12］研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖LPS可以通過與膀胱上皮細(xì)胞表面Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合，激活胞內(nèi)信號(hào)通路，促進(jìn)IL-6的表達(dá)。Caramalho等［13］研究表明，TLR4、TLR5、TLR7和 TLR8可以在C57BL／6小鼠CD＋4CD＋25細(xì)胞（Treg）表達(dá)，有研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞只占整個(gè)CD＋4T細(xì)胞的5%－6%［14］。關(guān)于小鼠Th1和Th2細(xì)胞TLR-4和TLR-2表達(dá)情況未見報(bào)道。Miao等［15］研究硫酸多糖聚甘古酯（SPMG）對(duì)胸腺T淋巴細(xì)胞影響時(shí)，證明SPMG是通過與T細(xì)胞表面的TCR／CD3復(fù)合物結(jié)合而發(fā)揮作用的。

本實(shí)驗(yàn)選用TLR-4抑制劑TAK-242處理T細(xì)胞時(shí)，對(duì)SPPM60-D增加T細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度沒有明顯作用。進(jìn)一步證明SPPM60-D與脾臟T細(xì)胞的結(jié)合不是依賴TLR-4的作用，猜測(cè)主要依靠與T細(xì)胞表面TCR／CD3復(fù)合物的結(jié)合而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。

目前對(duì)鈣離子內(nèi)流通路研究發(fā)現(xiàn)主要有以下幾種：鈣離子釋放激活鈣離子通道（Ca2＋release-activated Ca2＋channels，CRAC）、P2X嘌呤受體通道、瞬時(shí)受體電位通道、電壓門控鈣離子通道［16］。CRAC通道阻滯劑2-APB可以部分抑制SPPM60-D引起的T細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。但沒有降到空白水平，說明還有其他通路介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流。

特異性免疫中大多數(shù)細(xì)胞因子是由活化的 T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的，而細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)天然免疫和適應(yīng)性免疫，促進(jìn)造血以及刺激細(xì)胞活化、增殖或分化等功能［17］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SPPM60-D可以明顯促進(jìn)IL-2、IL-4的產(chǎn)生，并且這種促進(jìn)作用與SPPM60-D促進(jìn)T細(xì)胞外Ca2＋大量?jī)?nèi)流有很大關(guān)系，Ca2＋通路可能激活了T細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高了IL-2、IL-4的分泌水平。而這種細(xì)胞因子的高水平或許能進(jìn)一步激發(fā)和促進(jìn)NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞的功能，從而進(jìn)一步提高整體的免疫功能。

總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了硫酸酯化后的SPPM60-D對(duì)T淋巴細(xì)胞有明顯的激活作用，促進(jìn)增殖、升高［Ca2＋］i以及促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。推測(cè)SPPM60-D可能是通過T細(xì)胞表面TCR／CD3受體作用，誘導(dǎo)PI3K的激活，PI3K的活化又激活PLC，使PIP2產(chǎn)生IP3與DAG兩個(gè)信號(hào)分子，IP3作用于胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫上的IP3R，引起鈣庫鈣離子的釋放到胞質(zhì)，少量的Ca2＋通過SOC誘導(dǎo)大量Ca2＋的跨膜內(nèi)流，從而導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞［Ca2＋］i的上升，如Fig 6。

Fig 6 Speculated calcium signal pathway induced by SPPM60-D

與未酯化的PPM60-D相比，SPPM60-D具有明顯的促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖及增強(qiáng)活性的作用。這種變化是由多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)還是空間結(jié)構(gòu)的變化所引起，T淋巴細(xì)胞如何識(shí)別、接受硫酸酯化多糖，還需進(jìn)一步更深入的研究。

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