穆云萍，焦海霞，朱壯麗，戴 耄，黃秋虹，王瑞幸，林默君

（福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，心血管科學(xué)研究室，福建福州 350108）

肺高壓（pulmonary hypertension，PH）是指由異源性疾病和不同發(fā)病機(jī)制引起的以肺血管阻力進(jìn)行性增加為主要特點(diǎn)的臨床病理生理綜合征［1］。典型的病理改變是血管張力增加、血管重塑和原位血栓形成，最終演化為危及生命的右心衰，是嚴(yán)重的慢性肺循環(huán)疾?。?］。現(xiàn)已證實(shí)，在慢性低氧（chronic hypoxia，CH）致 PH大鼠，其肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）內(nèi)升高的Ca2＋濃度介導(dǎo)肺血管阻力進(jìn)行性增加與PASMCs增生，是低氧性肺高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）致病的關(guān)鍵因素［3］。而PASMCs上鈣池操縱性 Ca2＋通道（store-operated calcium channels，SOCC）與細(xì)胞內(nèi)Ca2＋穩(wěn)態(tài)的維持密切相關(guān)［4］。經(jīng)典瞬時(shí)感受器電位（canonical transient receptor potential，TRPC）家族編碼的通道蛋白是SOCC的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［5］，SOCC可被 Ca2＋池耗竭劑環(huán)匹阿尼酸（cyclopiazonic acid，CPA）激活，引起Ca2＋池操縱性 Ca2＋內(nèi)流（store-operated calcium entry，SOCE）［3，6］，參與平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)或血管重塑等病理改變。前期工作表明，HPH大鼠模型 PASMCs上，TRPC1表達(dá)上調(diào)，它所介導(dǎo)的SOCE和血管收縮張力都明顯增強(qiáng)［7］，提示，由于上調(diào)的 TRPC導(dǎo)致SOCE所介導(dǎo)的肺動(dòng)脈（pulmonary arteris，PAs）收縮增強(qiáng)，可能是HPH發(fā)生的重要原因。因此本研究利用 HPH大鼠模型，分別檢測(cè)低氧 1、3、5、7、14、21 d等不同時(shí)間點(diǎn)，TRPC1表達(dá)與SOCE介導(dǎo)PAs收縮變化，通過(guò)比較兩者時(shí)間上的相互關(guān)系，進(jìn)一步闡明TRPC1／SOCE的上調(diào)，在PH發(fā)病過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 CH肺高壓模型的建立 清潔級(jí)♂ SD大鼠（200～220克），購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（閩）2012－0001］，隨機(jī)分為慢性低氧0d組（NOR組）、1、3、5、7、14、21 d組，各組大鼠同時(shí)放于密封的有機(jī)玻璃飼養(yǎng)箱內(nèi)，飼養(yǎng)箱內(nèi)氧分壓調(diào)至9.5% ～10.5%。

1.2 右心室內(nèi)壓測(cè)定 各組大鼠，用20%烏拉坦（0.5 g·kg－1）腹腔麻醉并進(jìn)行肝素化處理，迅速經(jīng)右頸外靜脈行右心室插管術(shù)，記錄大鼠平均右心室收縮壓（mRVSP）。

1.3 右心室重量指數(shù)測(cè)定 右心室插管操作完成后，迅速取出大鼠的心、肺組織，用眼科剪沿房室交界剪去全部的左右心房及大血管，僅保留兩側(cè)心室，沿室間隔分離出右心室（RV），濾紙吸干后用分析天平稱重，同法稱取左心室與室間隔（LV＋S）重量，計(jì)算 RVMI＝RV／（LV＋S）。

1.4 半定量RT-PCR檢測(cè)TRPC1的 m RNA表達(dá)水平 測(cè)完右心室內(nèi)壓后，迅速取出肺葉，體視顯微鏡下分離出肺小動(dòng)脈，縱向剪開(kāi)，棉簽去除內(nèi)皮。在液氮中將標(biāo)本充分研磨后，加 TRIzol試劑提取RNA，用紫外分光光度法測(cè)定RNA的濃度及純度。按試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR。擴(kuò)增條件：94℃2 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，68℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)。引物序列：TRPC1上游引物5′-ATGGGACAGATGTTACAAGATTTTGGG-3′；下游引物 5′-AGCA-AACTTCCATTCTTTATCCTCATG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為402 bp。β-actin上游引物 5′-GGTGTGATGGTGGGTATGGGT-3′；下游引物 5′-CTGGG-TCATCTT-TTCACGGT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為240 bp。利用Genetool軟件計(jì)算目的基因和內(nèi)參（β-actin）條帶的平均灰度值，以目的條帶和β-actin的比值衡量各組目的基因表達(dá)的相對(duì)量。

1.5 肺動(dòng)脈血管張力檢測(cè) 測(cè)完右心室內(nèi)壓，取出肺葉，體視顯微鏡下分離出肺小動(dòng)脈，剪成約3～5 mm的肺動(dòng)脈環(huán)，去內(nèi)皮后置于四腔浴槽中，給以1 g負(fù)荷，在RM6240多道生理記錄儀（成都儀器廠）上描記張力曲線，平衡2 h。實(shí)驗(yàn)前先給予60 mmol·L－1KCl收縮血管，判斷血管環(huán)是否具有活性。然后，加苯腎上腺素（phenylephedrine，PHEN，終濃度0.1μmol·L－1）預(yù)收縮達(dá)最大反應(yīng)，再加乙酰膽堿（acetylcholine，ACh，10μmol·L－1），觀察血管的舒張效應(yīng)，以此來(lái)驗(yàn)證血管環(huán)去內(nèi)皮情況［8］。血管環(huán)活性及去內(nèi)皮度驗(yàn)證完畢后，觀察環(huán)匹阿尼酸（cyclopiazonic acid，CPA，Sigma公司）對(duì)不同低氧時(shí)間點(diǎn)PAs的收縮效應(yīng)，CPA誘發(fā)PAs的收縮作用以60 mmol·L－1KCl收縮效應(yīng)的百分?jǐn)?shù)來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間差異比較用one-way ANOVA方差分析，用Sigma Plot 11.0軟件繪制曲線。

2 結(jié)果

2.1 慢性低氧上調(diào)mRVSP和RVM I CH誘發(fā)PH大鼠模型的過(guò)程中，分別在 0、1、3、5、7、14、21 d七個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)大鼠的mRVSP和RVMI，并對(duì)其變化做時(shí)間依賴性曲線（Fig 1）。如圖所示，RVSP在慢性低氧1 d就明顯升高，7 d達(dá)到峰值（9.8±0.37）kPa，14 d后略有下降，直至21 d維持在 NOR組（4.0±0.16）kPa的兩倍水平左右（9.7±0.66）kPa。但是，體循環(huán)動(dòng)脈壓和心率均沒(méi)有差別［9］，表明慢性低氧僅能夠使右心室內(nèi)壓／肺動(dòng)脈壓增高。RVMI低氧3 d開(kāi)始增加，一直維持增加狀態(tài)，并未出現(xiàn)平臺(tái)期，表明慢性低氧3 d后就開(kāi)始發(fā)生右心重構(gòu)，右心室肥大。的收縮效應(yīng)約為NOR組的1.5倍（P＜0.01），低氧5 d時(shí)收縮效應(yīng)達(dá)最大值（90.2% ±15.1%，P＜0.01），隨后繼續(xù)維持在較高水平，直至低氧21 d收縮效應(yīng)仍較NOR組有明顯增強(qiáng)，約為NOR組的2倍（87.2% ±7.1%，P＜0.01），低氧增強(qiáng) PAs血管環(huán)收縮效應(yīng)的變化與TRPC1 mRNA表達(dá)量變化的時(shí)間曲線趨于一致，提示在低氧初期 TRPC1與SOCC介導(dǎo)的PAs的收縮效應(yīng)即明顯增強(qiáng)。

Fig 1 CH up-regulatesm RVSP and RVM IAverage values ofmRVSP at various time points after CH-induced（A，n＝10 for each time point）；average values of RVMIat various time points after CH-induced（B，n＝10 for each time point）**P＜0.01 vs control.

Fig 2 Time curve of expression of TRPC1 in PAsThe timetable ofmRNA expression of TRPC1（A）.Semi-quantitative RT-PCR analysis of TRPC1 mRNA expression in PAs usingβ-actin as internal standard（n＝3，**P＜0.01）.The time-dependent curve of TRPC1′s expression on CH rats（B）

Fig 3 Time curve of vascular tone of PAsmediated by SOCETime course of change in CPA-induced PA contraction in CH-treated rats（A）.The time-dependent curve of CPA（10μmol·L－1）response on CH rats（B），**P＜0.01 vs CON.

3 討論

臨床PH的發(fā)生常繼發(fā)于慢性阻塞性肺病等呼吸系統(tǒng)疾患，低氧是形成PH的重要因素，所以闡明HPH的發(fā)病機(jī)制一直是PH的研究熱點(diǎn)。在低氧環(huán)境下，血管對(duì)活性物質(zhì)的反應(yīng)可明顯增強(qiáng)，呈現(xiàn)慢性痙攣和過(guò)度肌化狀態(tài)，導(dǎo)致低氧性肺血管收縮（hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV）。一定水平的HPV是機(jī)體為適應(yīng)氧分壓的降低而采取的一種保護(hù)措施，能夠維持低氧肺泡區(qū)內(nèi)適當(dāng)?shù)耐庋鞅戎?，起到通氣代償作用。但持續(xù)的HPV會(huì)引起肺循環(huán)外周阻力增加，最終形成HPH［10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，RVMI在低氧3 d開(kāi)始增加，隨時(shí)間延長(zhǎng)呈增高趨勢(shì)，并且在低氧21 d內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)平臺(tái)期；而RVSP在低氧1 d就明顯升高，低氧7 d即達(dá)到峰值，并且在低氧21 d時(shí)維持在NOR組的兩倍水平。以上結(jié)果提示持續(xù)低氧3 d即發(fā)生肺血管病理性改變，低氧7 d由于HPV加劇，導(dǎo)致肺血管重構(gòu)，形成HPH，并隨低氧時(shí)間延長(zhǎng)建立穩(wěn)定的PH模型。

先前的研究表明在慢性HPH大鼠，PASMCs上TRPC1表達(dá)與SOCE功能明顯增高，升高的SOCE使PAs的收縮緊張度明顯增強(qiáng)［7］。為了探討TRPC1與SOCE功能的增強(qiáng)是否參與了HPH的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了低氧不同時(shí)間TRPC1表達(dá)和PAs收縮變化的時(shí)間曲線。結(jié)果顯示TRPC1 mRNA表達(dá)在低氧1 d即明顯增加，低氧3 d時(shí)達(dá)最高水平，低氧21 d保持為NOR組的2倍。而低氧3 d時(shí)PAs的收縮效應(yīng)開(kāi)始較NOR組有所增強(qiáng)，至低氧5 d時(shí)收縮效應(yīng)達(dá)到最大值，隨后維持在較高水平，至低氧21 d時(shí)收縮效應(yīng)也為NOR組的2倍。從結(jié)果中可以看到，低氧增強(qiáng)的PAs血管環(huán)收縮效應(yīng)與TRPC1 mRNA表達(dá)變化，在時(shí)間上稍有延遲卻又保持相同趨勢(shì)。該結(jié)果提示TRPC1表達(dá)增強(qiáng)導(dǎo)致SOCE上揚(yáng)，而后者又是介導(dǎo)PAs收縮增強(qiáng)的首要因素，最終引起HPH發(fā)生。

TRPC通道作為一類(lèi)新發(fā)現(xiàn)的Ca2＋通道，自其發(fā)現(xiàn)以來(lái)，就被認(rèn)為與SOCE密切相關(guān)。研究表明，TRPC參與構(gòu)成功能性SOCC，其介導(dǎo)產(chǎn)生SOCE調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞器之間的Ca2＋水平，TRPC過(guò)表達(dá)或表達(dá)下調(diào)直接影響SOCE水平［11］，這與本研究觀察到的兩者在低氧不同時(shí)間點(diǎn)變化的同步性一致。在眾多的TRPC通道中，TRPC1主要的功能為參與受體介導(dǎo)的Ca2＋依賴的分泌和收縮過(guò)程。TRPC1是PASMCs以及體循環(huán)細(xì)胞中SOCE的主要成分［12］，過(guò)表達(dá)大鼠PAs中的TRPC1會(huì)增強(qiáng)SOCE介導(dǎo)的血管收縮［13］。在增生的人PASMCs上，TRPC1表達(dá)與SOCE功能增強(qiáng)，經(jīng)TRPC1反義寡核甘酸處理后，SOCE受到抑制。siRNA敲低大鼠PASMCs中的TRPC1會(huì)使thapsigargin激活的SOCE減弱，這些研究都提示TRPC1直接介導(dǎo)SOCE［3］。而本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，在發(fā)生HPH的過(guò)程中，PASMCs上TRPC1 mRNA表達(dá)升高在前，隨即由SOCE介導(dǎo)的PAs收縮增強(qiáng)，而持續(xù)的肺血管收縮引起RVSP升高，到CH的21 d時(shí)，形成了穩(wěn)定的PH模型。

綜上所述，本工作通過(guò)記錄HPH模型建立的21 d內(nèi) RVSP、RVMI、TRPC1 mRNA以及 PAs收縮張力變化的時(shí)間曲線，明確了TRPC1表達(dá)上調(diào)與SOCE功能增強(qiáng)之間的關(guān)系，其在PH發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵作用。

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