鞠吉雨，于文靜，高志芹，張維芬，杜長(zhǎng)青，陳麗梅，連 波，趙春玲

（濰坊醫(yī)學(xué)院1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，山東濰坊 261053）

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞失去極性，經(jīng)過(guò)細(xì)胞骨架重塑轉(zhuǎn)變成具有遷移能力的間質(zhì)表型的過(guò)程。研究表明，EMT是促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的一個(gè)關(guān)鍵因素［1］。

PLK1（Polo-like kinase 1）是一種高度保守的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的絲氨酸／蘇氨酸激酶，對(duì)細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)起著重要的調(diào)控作用。近年研究發(fā)現(xiàn)PLK1高表達(dá)在許多人類(lèi)腫瘤，如膀胱癌、直腸癌［2－3］。這表明PLK1參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。我們的研究已發(fā)現(xiàn)PLK1在鱗狀食管癌組織中呈高表達(dá)［4］，慢病毒介導(dǎo)的靶向PLK1的RNA干擾能明顯抑制食管鱗癌細(xì)胞體內(nèi)外的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移［5－6］。為深入研究PLK1促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，我們構(gòu)建了PLK1在食管鱗癌細(xì)胞TE-15中的過(guò)表達(dá)克隆和空載對(duì)照克隆，檢測(cè)PLK1過(guò)表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞EMT的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 過(guò)表達(dá)PLK1的食管鱗癌細(xì)胞株TE-15和空載對(duì)照克隆由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶和 FBS購(gòu)自 Gibco公司；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent購(gòu)自 Invitrogen公司；PrimeScript?RT reagent Kit、SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit均購(gòu)自TaKaRa公司；引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；β-catenin siRNA寡核苷酸序列和非特異性siRNA（siRNA-NC）由上海吉?jiǎng)P基因有限公司合成；RIPA細(xì)胞裂解液、核蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、預(yù)染蛋白質(zhì)marker均購(gòu)自 Beyotime公司；Protein A／G agarose beads購(gòu)自Santa Cruz公司；兔抗人vimentin／E-cadherin單抗、兔抗人 β-catenin、兔抗人 Axin／APC／GSK-3β單抗、兔抗人β-actin單抗和HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗均購(gòu)自Santa Cruz公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自普利萊公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)食管鱗癌細(xì)胞TE-15的PLK1過(guò)表達(dá)克隆和空載對(duì)照克隆。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 siRNA干擾 β-catenin的靶序列：5′-CAGTTGTGGTTAAGCTCTTAC-3′，非 特 異 性siRNA（siRNA-NC）干擾序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。轉(zhuǎn)染前1 d，于60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)種植合適數(shù)量的PLK1過(guò)表達(dá)克隆，轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度為60%～70%。轉(zhuǎn)染前換成無(wú)血清培養(yǎng)基。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合體A：將稀釋總量為50 pmol的siRNA 3μl加入47μl的無(wú)血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫孵育。B：取1μl Lipofectamine 2000加入49μl無(wú)血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5 min。將復(fù)合體A和B輕輕混合，室溫孵育20 min使復(fù)合體形成。將復(fù)合體加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，孵育72 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè) TRIzol提取細(xì)胞中總RNA，取2μg使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)成cDNA后進(jìn)行Real-time PCR。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。vimentin 上 游 引 物： 5′-CCAAACTTTTCCTCCC TGAACC-3′，下 游 引 物：5′-GTGATGCTGAGAAGTT TCGTTGA-3′，擴(kuò)增片段為141 bp；內(nèi)參 β-actin上游引 物：5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下 游 引物：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，擴(kuò)增片段為206 bp。結(jié)果用Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 Western blot檢測(cè) PLK1過(guò)表達(dá)克隆和空載對(duì)照克隆用冰預(yù)冷的PBS洗滌2次后離心，用RIPA細(xì)胞裂解液重懸，冰浴30 min，12 000 r·min－1、4℃離心20 min收集總蛋白。細(xì)胞核蛋白提取按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取80μg蛋白經(jīng)10%的 SDSPAGE電泳分離后，利用半干轉(zhuǎn)印技術(shù)將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗，室溫孵育2 h或4℃過(guò)夜雜交。用含5%脫脂奶粉和0.1%Tween 20的PBS洗膜后，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶2 000稀釋?zhuān)┓跤? h。洗膜后用ECL法顯影。所用的一抗為：兔抗人vimentin單抗（1∶500稀釋?zhuān)?、E-cadherin單抗（1∶1 000稀釋?zhuān)?、?catenin單抗（1∶1 000稀釋?zhuān)ⅵ?actin單抗（1∶5 000稀釋?zhuān)?、Histone H3（1∶1 000稀釋?zhuān)?/p>

1.2.5 免疫共沉淀 細(xì)胞總蛋白裂解液中加入約10μl Axin抗體，4°C孵育過(guò)夜。再加入20μl protein A／G瓊脂糖珠子，共同在室溫孵育4 h。3 000 r·min－1離心10 min，收集免疫共沉淀復(fù)合物，使用裂解緩沖液小心地洗免疫復(fù)合物3～5次，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。兔抗人的 Axin、APC、GSK-3β均按照1∶500稀釋。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PLK1促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞EM T的發(fā)生 用Western blot法檢測(cè)食管鱗癌細(xì)胞TE-15的空載對(duì)照克隆和PLK1過(guò)表達(dá)克隆中EMT標(biāo)志蛋白分子，發(fā)現(xiàn)PLK1過(guò)表達(dá)克隆中，間質(zhì)標(biāo)志蛋白vimentin的表達(dá)明顯上調(diào)，而上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)明顯下調(diào)（Fig 1A）。這表明PLK1能夠促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞TE-15發(fā)生EMT。采用Real-time PCR檢測(cè)vimentinmRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在PLK1過(guò)表達(dá)克隆中，vimentin mRNA表達(dá)水平明顯升高（Fig 1B，P＜0.05），這提示PLK1上調(diào)vimentin表達(dá)可能是發(fā)生在對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。

Fig 1 Overexpression of PLK 1 influences the expression of EMT-related protein markers（A）and upregulates the expression of vimentin mRNA（B）in ESCC cells*P＜0.05 vs vector.

2.2 PLK1上調(diào)食管鱗癌細(xì)胞總蛋白和胞核中βcatenin的蛋白表達(dá)水平 由于β-catenin在對(duì)vimentin表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控中起重要作用，我們繼續(xù)檢測(cè)了PLK1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞TE-15中β-catenin蛋白表達(dá)的影響。分別提取空載對(duì)照克隆和PLK1過(guò)表達(dá)克隆的細(xì)胞總蛋白和胞核蛋白，Western blot的結(jié)果顯示，在PLK1過(guò)表達(dá)的克隆中，細(xì)胞總蛋白和胞核蛋白中β-catenin表達(dá)都明顯增加（Fig 2）。

Fig 2 Overexpression of PLK 1 increasesβ-catenin expression in ESCC cells（A）and nucleus（B）

2.3 PLK1通過(guò)提高食管鱗癌細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)水平而上調(diào)vimentin 為了確證PLK1上調(diào)食管鱗癌細(xì)胞中vimentin表達(dá)是否與其提高β-catenin的表達(dá)水平有關(guān)，我們采用RNA干擾技術(shù)，在PLK1過(guò)表達(dá)克隆中分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶向β-catenin的siRNA和對(duì)照非特異性siRNA，Western blot的結(jié)果顯示，在PLK1過(guò)表達(dá)克隆中降低β-catenin的表達(dá)能引起vimentin的表達(dá)下降（Fig 3）。因此，PLK1確實(shí)通過(guò)提高食管鱗癌細(xì)胞TE-15中β-catenin的表達(dá)水平而上調(diào)vimentin。

Fig 3 PLK 1 upregulates the expression of vimentin by increasingβ-catenin in ESCC cells1：Vector；2：High-PLK1；3：High-PLK1＋siNC；4：High-PLK1＋si β-catenin.

2.4 PLK1能夠抑制食管鱗癌細(xì)胞中β-catenin降解復(fù)合物的聚合 采用免疫沉淀和Western blot，檢測(cè)了PLK1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞TE-15中β-catenin降解復(fù)合物的影響。結(jié)果顯示，在PLK1過(guò)表達(dá)克隆中，Axin免疫沉淀物中的APC及GSK-3β都明顯減少（Fig 4）。這提示，PLK1能夠抑制β-catenin降解復(fù)合物的聚合。

Fig 4 PLK 1 inhibits the formation of protein degradation com p lex targetedβ-catenin in ESCC cells

3 討論

EMT是癌癥發(fā)展的主要機(jī)制及轉(zhuǎn)移的起始步驟［7－8］。本研究中，通過(guò)對(duì)EMT相關(guān)的蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)證實(shí)，PLK1能夠促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT，而該過(guò)程可能是通過(guò)上調(diào)vimentin轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)的。

vimentin作為存在于間質(zhì)細(xì)胞中的一種中間纖維蛋白［9］，在腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、黏附和上皮癌的EMT中均起一定的作用。這提示，vimentin可作為抗腫瘤轉(zhuǎn)移研究和治療的新靶點(diǎn)［10－12］。由于vimentin的表達(dá)往往是一些癌發(fā)生相關(guān)信號(hào)分子的下游分子，已有報(bào)道β-catenin／TCF（T cell factor，T細(xì)胞因子）復(fù)合物能激活vimentin啟動(dòng)子，上調(diào)vimentin的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲潛能［13］。而β-catenin在Wnt／β-catenin信號(hào)通路中起核心作用［14－15］。我們的結(jié)果顯示，PLK1促進(jìn)了細(xì)胞總蛋白和核蛋白中β-catenin表達(dá)。在PLK1過(guò)表達(dá)克隆中，降低β-catenin的表達(dá)引起vimentin的表達(dá)下降。因此，PLK1確實(shí)通過(guò)提高食管鱗癌細(xì)胞中βcatenin的表達(dá)水平而上調(diào)vimentin。由于β-catenin胞質(zhì)穩(wěn)定性是其轉(zhuǎn)位入核，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的前提，而調(diào)節(jié)β-catenin胞質(zhì)穩(wěn)定性的主要因素是Axin／APC／GSK-3β的多蛋白降解復(fù)合物。因此，我們又繼續(xù)檢測(cè)了PLK1對(duì)β-catenin降解復(fù)合物的影響。免疫共沉淀的結(jié)果顯示，PLK1能夠抑制β-catenin降解復(fù)合物的聚合。在PLK1過(guò)表達(dá)克隆中，βcatenin降解復(fù)合物的減少造成了β-catenin不能降解，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，從而在胞質(zhì)中累積，最終引起βcatenin轉(zhuǎn)位入核增加，導(dǎo)致vimentin基因表達(dá)上調(diào)。

基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)PLK1可能通過(guò)穩(wěn)定β-catenin上調(diào)vimentin的表達(dá)，而促進(jìn)了食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT。這為食管鱗癌的生物治療提供了新靶點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。至于PLK1如何抑制βcatenin降解復(fù)合物的聚合，詳細(xì)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Sánchez-TillóE，Liu Y，de BarriosO，etal.EMT-activating transcription factors in cancer：beyond EMT and tumor invasiveness［J］.Cell Mol Life Sci，2012，69（20）：3429－56.

［2］ Fristrup N，Ulh?i B P，Birkenkamp-Demtr?der K，et al.Cathepsin E，maspin，Plk1，and survivin are promising prognostic protein markers for progression in non-muscle invasive bladder cancer［J］.Am JPathol，2012，180（5）：1824－34.

［3］ R?del F，Keppner S，Capalbo G，etal.Polo-like kinase 1 as predictive marker and therapeutic target for radiotherapy in rectal cancer［J］.Am JPathol，2010，177（2）：918－29.

［4］ Zhao C，Gong L，LiW，et al.Overexpression of Plk1 promotes malignant progress in human esophageal squamous cell carcinoma［J］.JCancer Res Clin Oncol，2010，136（1）：9－16.

［5］ 劉曉影，陳麗梅，張寶剛，等.慢病毒介導(dǎo)的人PLK1 RNA干擾對(duì)食管鱗癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑制作用及機(jī)制［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29（11）：421－5.

［5］ Liu X Y，Chen LM，Zhang B G，et al.Inhibitory effect of lentiviral vectormediated RNA interference targeting human PLK1 gene on transplanted esophageal squamous cell carcinoma in nudemice［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（11）：421－5.

［6］ 于文靜，張寶剛，陳麗梅，等.PLK1基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及對(duì)食管鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響［J］.世界華人消化雜志，2013，21（22）：2128－35.

［6］ Yu W J，Zhang B G，Chen L M，et al.Lentiviral－mediated RNA interference targeting the PLK1 gene inhibits invasion and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma cells［J］.World Chin JDigestol，2013，21（22）：2128－35.

［7］ Cervantes-Arias A，Pang L Y，Argyle D J.Epithelial-mesenchymal transition as a fundamentalmechanism underlying the cancer phenotype［J］.Vet Comp Oncol，2013，11（3）：169－84.

［8］ Son H，Moon A.Epithelial-mesenchymal transition and cell invasion［J］.Toxicol Res，2010，26（4）：245－52.

［9］ Coulombe P A，Wong P.Cytoplasmic intermediate filaments revealed as dynamic and multipurpose scaffolds［J］.Nat Cell Bio，2004，6（8）：699－706.

［10］Satelli A，Li S.vimentin in cancer and its potential as amolecular target for cancer therapy［J］.Cell Mol Life Sci，2011，68（18）：3033－46.

［11］Ivaska J，Pallari H M，Nevo J，et al.Novel functions of vimentin in cell adhesion，migration，and signaling［J］.Exp Cell Res，2007，313（10）：2050－62.

［12］潘 燕，韓 婧，張 曄，等.vimentin在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及藥物研究進(jìn)展 ［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，2010，41（6）：413－6.

［12］Pan Y，Han J，Zhang Y，etal.Role of vimentin in tumormetastasis and drug research［J］.Prog Physiol Sci，2010，41（6）：413－6.

［13］Gilles C，Polette M，MestdagtM，et al.Transactivation of vimentin by beta-catenin in human breast cancer cells［J］.Cancer Res，2003，63（10）：2658－64.

［14］Kim W，Kim M，Jho EH.Wnt／β-catenin signalling：from plasma membrane to nucleus［J］.Biochem J，2013，450（1）：9－21.

［15］Clevers H，Nusse R.Wnt／β-catenin signaling and disease［J］.Cell，2012，149（6）：1192－205.