趙 麗，曹成建，劉現(xiàn)梅，孔繁琪，馬文斌，周龍霞，陳久凱，張鳴號(hào)，焦 運(yùn)，楊曉玲，姜怡鄧

（寧夏醫(yī)科大學(xué)1.檢驗(yàn)學(xué)院、2.基礎(chǔ)學(xué)院、3.總醫(yī)院，寧夏 銀川 750004）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是甲硫氨酸代謝的中間產(chǎn)物，研究表明其可能通過甲硫氨酸循環(huán)影響基因的甲基化水平參與疾病的發(fā)生［1］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶-1α（endoplasmic reticulum oxidoreductin 1-α，ERO1α）是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種氧化酶，對(duì)維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要的作用［2］，主要負(fù)責(zé)維持肝細(xì)胞生長(zhǎng)、支持細(xì)胞生存等［3］，研究表明，Hcy可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERs）抑制肝細(xì)胞增殖［4］，但 Hcy是否通過影響ERO1αDNA甲基化及其表達(dá)進(jìn)而抑制肝細(xì)胞增殖目前未見報(bào)道。因此，本研究擬從DNA甲基化修飾角度探討ERO1α在Hcy抑制肝細(xì)胞增殖中的作用，為防治高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocy steinemia，HHcy）提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 超凈工作臺(tái)（蘇州安泰，中國）；CO2培養(yǎng)箱（Heraeus，德國）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（上海風(fēng)嶺，中國）；普通PCR儀（Bio-Rad，美國）；Epoch全波段酶標(biāo)儀（BioTek，美國）；電泳儀（Bio-Rad，美國）；凝膠成像儀（Bio-Rad，美國）；RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（Gibco）；青、鏈霉素（碧云天生物技術(shù)研究所）胰酶（Solarbio）；同型半胱氨酸（Hcy，Sigma）；DNA提取試劑盒（TIANGEN）；RNA提取試劑盒（TIANGEN）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermantas）；熒光定量試劑盒（Fermantas）；anti-ERO1α（Abcom）；HRP標(biāo)記二抗（北京中杉）；全蛋白提取試劑盒，MTT試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；lipo2000（Invitrogen）；DNA甲基化修飾試劑盒（ZYMO）；引物（上海生工）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理 HL7220肝細(xì)胞株購自長(zhǎng)沙市湘雅研究所細(xì)胞庫。用含10%胎牛血清及1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。用含100μmol·L－1Hcy的培養(yǎng)液刺激細(xì)胞，并設(shè)置正常對(duì)照組（0μmol·L－1Hcy），每組重復(fù)3次，孵育48 h后收集細(xì)胞，凍存于－80℃，待用。

1.2.2 熒光定量PCR法檢測(cè)ERO1αmRNA的表達(dá)在Pubmed數(shù)據(jù)庫中查詢ERO1α獲取其編碼序列，采用Premier5.0設(shè)計(jì)相關(guān)引物。提取各組細(xì)胞的總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為：42℃60 min，70℃5 min。以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR。ERO1α熒光引物（上游 5′-ATCCTTTGGCTTCTGGTCAAG-3′；下游 5′-GTTGTGTCCCCATTTCTTTTCT-3′），PCR反應(yīng)條件為：95℃ 10 min；95℃15 s，58℃ 30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.3 Western blot檢測(cè) ERO1α蛋白的表達(dá) 采用全蛋白提取試劑盒提取兩組細(xì)胞全蛋白，取20μl進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，120 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h，5%的脫脂奶粉封閉2 h，與anti-ERO1α4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記二抗孵育2 h，于凝膠成像分析儀上成像分析，以 β-actin為內(nèi)參，計(jì)算 ERO1α與 β-actin內(nèi)參灰度值的比值，進(jìn)行分析。

1.2.4 ERO1α重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 提取肝細(xì)胞基因組DNA，擴(kuò)增ERO1αDNA片段。上游引物：5′-CCGCTCGAGATGGGCCGCGGCTGGGGATTCTTGT-3′，下游引物：5′-AATTCTGCAGATGAATATTCTGTAACAAGTTCCTGAAGTTTTC-3′。設(shè)計(jì) XhoI和 Pst I為酶切位點(diǎn)。將提純的ERO1αDNA片段與EGFPN1質(zhì)粒分別用XhoI和Pst I進(jìn)行雙酶切。用T4連接酶將ERO1αDNA片段定向克隆到EGFP-N1質(zhì)粒的XhoI和Pst I酶切位點(diǎn)。構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為EGFP-N1-ERO1α。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑取在含有氨芐青霉素的LB平板生長(zhǎng)的單菌落，小量培養(yǎng)后，用特異性ERO1α引物對(duì)菌液進(jìn)行PCR篩選，電泳驗(yàn)證產(chǎn)物長(zhǎng)度。同時(shí)將培養(yǎng)菌株送上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。肝細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，用lipo2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入肝細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)基孵育6h。除去培養(yǎng)基，以含10%胎牛血清的培養(yǎng)基孵育48 h。

1.2.5 MTT檢測(cè)肝細(xì)胞增殖活力 將肝細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，在96孔板中加入細(xì)胞懸液100μl／孔（約1×104），37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)24 h。除去培養(yǎng)液，分別加入普通培養(yǎng)液及含100μmol·L－1Hcy的培養(yǎng)液，每組8孔，孵育48 h后，除去培養(yǎng)液，每孔加50μl 1×MTT，37℃孵育4 h，除去上清，每孔加150μl DMSO，搖勻后用酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度。

1.2.6 巢式降落式甲基化特異性 PCR（ntMSPCR）檢測(cè)ERO1α啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化按DNA提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞全基因組DNA，亞硫酸鹽修飾法對(duì)全基因組DNA進(jìn)行甲基化修飾。nt-MSP法檢測(cè)ERO1α啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化程度的改變。針對(duì) ERO1α啟動(dòng)子區(qū)，在線（http：／／www.urogene.org／cgi-bin／methprimer／methprimer.cgi）設(shè)計(jì)一對(duì)外引物及兩對(duì)內(nèi)引物（外引物：上游5′-CCAATCCTAATCTTTTAA CATTCAAA-3′，下 游 5′-TAGTTTGGGTAATATGGTGAAATTT-3′；甲基化引物：上游5′-ACTAACCTACAATAATAC GATCGCA-3′，下游 5′-AGTTTGGGTAATATGG TGAAA TTTC-3′；非甲基化引物：上游 5′-ACTAACCTA CAATAAT ACAATCACA-3′，下游5′-AGTTTGGGTAATATGGTGAAATTTC-3′）。外引物擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降0.5℃至49℃，72℃7min。以外引物的PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行內(nèi)外引物的擴(kuò)增。反應(yīng)條件同外引物。取5μl PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像分析儀成像并分析甲基化條帶及非甲基化條帶的光密度，按如下公式進(jìn)行計(jì)算：甲基化／%＝甲基化OD值／（甲基化OD值＋非甲基化OD值）×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果以ˉx±s表示。兩樣本間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Hcy抑制肝細(xì)胞增殖 100μmol·L－1Hcy刺激肝細(xì)胞48 h后，以MTT法檢測(cè)正常對(duì)照組及Hcy干預(yù)組肝細(xì)胞增殖活力的改變，結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，Hcy組肝細(xì)胞增殖活力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見 Fig 1。

Fig 1 Hcy inhibits proliferative activity of hepatocytesCellswere treated with 100μmol·L－1 Hcy for48h.**P＜0.01 vs NC group

2.2 Hcy抑制 ERO1α的表達(dá) 100μmol·L－1Hcy刺激肝細(xì)胞48 h后，分別以熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)正常對(duì)照組及Hcy干預(yù)組ERO1α mRNA及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Hcy干預(yù)后，ERO1αmRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01），見 Fig 2。

Fig 2 Hcy inhibits expression of ERO1αA：Change of ERO1αmRNA expression of the NC and Hcy groups；B：Change of ERO1αprotein expression of the NC and Hcy groups.Cells were treated with 100μmol·L－1 Hcy for48 h.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC group

2.3 ERO1α參與Hcy抑制肝細(xì)胞增殖 測(cè)序結(jié)果證明ERO1α重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見Fig 3A。轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光蛋白表達(dá)明顯，見 Fig 3B。qRT-PCR及 Western blot驗(yàn)證ERO1αmRMA及蛋白表達(dá)增加，見Fig 3C，D。MTT法檢測(cè)ERO1α過表達(dá)后肝細(xì)胞增殖活力的改變，與對(duì)照組相比，ERO1α重組組肝細(xì)胞增殖活力明顯升高，差異有顯著性（P＜0.01），見 Fig 3E。

2.4 Hcy導(dǎo)致 ERO1αDNA甲基化改變 100 μmol·L－1Hcy刺激肝細(xì)胞后，分析ERO1αDNA甲基化水平的改變。結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，ERO1αDNA甲基化程度增加，差異有顯著性（P＜0.05），見 Fig 4。

3 討論

肝損傷病人依賴于肝臟的再生恢復(fù)正常代謝，而肝細(xì)胞增殖是肝臟再生的基礎(chǔ)。HHcy被認(rèn)為是肝纖維化、非酒精性脂肪肝等的獨(dú)立危險(xiǎn)因子［5－6］。研究表明Hcy可擾亂肝細(xì)胞正常的細(xì)胞周期進(jìn)而抑制其增殖［4］。本研究結(jié)果顯示Hcy刺激后肝細(xì)胞增殖活力減弱，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

ERs是Hcy誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生功能障礙的機(jī)制之一，ERO1α又名內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原樣蛋白（endoplasmic reticulum oxidoreduclin-like protein1α），是一種黃素蛋白，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其編碼基因位于人類第14號(hào)染色體上，研究表明，其主要作用為參與新生肽鏈正確折疊成有生物活性的蛋白質(zhì)［2］、維持細(xì)胞增殖等，其表達(dá)異?？梢饍?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。ERO1α依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可引起Ca2＋釋放，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞凋亡途徑。而ERO1α是否參與了Hcy導(dǎo)致的肝細(xì)胞增殖抑制未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明：Hcy在抑制肝細(xì)胞增殖的同時(shí)，也導(dǎo)致了ERO1αmRNA及蛋白表達(dá)水平的明顯下降。多次重復(fù)試驗(yàn)均得到一致的結(jié)果，提示ERO1α可能參與了Hcy抑制肝細(xì)胞增殖的過程。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)果，構(gòu)建了ERO1α重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞使其過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ERO1α過表達(dá)后Hcy對(duì)肝細(xì)胞增殖的抑制作用明顯降低，表明ERO1α在Hcy抑制肝細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

Hcy是一種含硫氨基酸，是甲硫氨酸代謝的中間產(chǎn)物，參與了甲硫氨酸循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［7］。Hcy濃度異?？蓪?dǎo)致甲硫氨酸循環(huán)紊亂，使甲基供體生成量改變引起多個(gè)基因甲基化狀態(tài)的改變。DNA甲基化是指CpG位點(diǎn)的胞嘧啶被甲基修飾，從而在基因結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變的基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，DNA甲基化是發(fā)現(xiàn)較早的表觀遺傳學(xué)修飾方式之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA穩(wěn)定性、DNA與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合情況的改變［8－9］，從而控制基因表達(dá)。前期研究也發(fā)現(xiàn) Hcy可使多種基因的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變，進(jìn)而影響其表達(dá)。一般來講，DNA甲基化改變包括低甲基化和高甲基化，低甲基化可促進(jìn)基因的表達(dá)，而高甲基化則抑制基因表達(dá)［10］。ERO1α啟動(dòng)子區(qū)富含CpG位點(diǎn)，因此設(shè)想，DNA甲基化這一表觀遺傳學(xué)機(jī)制可能參與了Hcy調(diào)控ERO1α的表達(dá)進(jìn)而抑制肝細(xì)胞增殖，因此我們進(jìn)一步檢測(cè)了Hcy干預(yù)后ERO1α啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的改變。研究結(jié)果表明：Hcy提高了ERO1α啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化程度，而DNA高甲基化是基因轉(zhuǎn)錄抑制的重要標(biāo)志，與ERO1α mRNA及蛋白表達(dá)水平降低相一致。

綜上所述，Hcy可能增加 ERO1α啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化程度，使ERO1α表達(dá)水平降低，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞增殖抑制。此發(fā)現(xiàn)可能是Hcy導(dǎo)致肝功能障礙的重要機(jī)制，為進(jìn)一步了解Hcy與肝臟疾病的關(guān)系提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Fig 3 ERO1αinvolved in Hcy-induced proliferation inhibition of hepatocytesA：Result of sequencing of ERO1αrecombinant plasmid；B：Fluorescence images of hepatocyteswith recombinant plasmids；C：Change of ERO1α mRNA expression after transfected with recombinant plasmids；D：Change of ERO1αprotein expression after transfected with recombinant plasmids；E：Change of proliferative activity after transfected with recombinant plasmids.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC group

Fig 4 Hcy causes the change of ERO1αDNA methylation levelM：Methylated production；U：Unmethylated production.Cells were treated with 100μmol·L－1 Hcy for 48 h.*P＜0.05 vs NC group.

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