彭曉明，高 莉，霍仕霞，閆 明

（新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆維吾爾醫(yī)方劑學實驗室，新疆烏魯木齊 830049）

阿爾采末病（Alzheimer’s disease，AD）是一種老年性中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為記憶力減退和認知功能障礙。目前該病在我國65歲以上人群中發(fā)病率在3% ～5%［1］，并呈逐年上升趨勢，因此研究開發(fā)有效的AD防治藥物成為當今醫(yī)學領域的熱點。類葉升麻苷（acteoside，AS）是傳統(tǒng)補益中藥——肉蓯蓉中的一種苯乙醇苷類活性成分，含量在 0.3%以上。前期研究工作表明［2－4］，AS對D-半乳糖或東莨菪堿誘導的小鼠學習記憶以及對H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷均具有明顯改善作用，因此AS可能在AD治療中具有潛在應用價值。已有研究表明［5］，通過D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁誘導小鼠90 d后，可出現(xiàn)學習記憶能力減退、老年斑及神經細胞凋亡等AD病樣特征。caspase-3是神經細胞凋亡調控的關鍵基因，其與AD發(fā)病具有重要聯(lián)系［6］。本實驗利用D-半乳糖和三氯化鋁聯(lián)合誘導小鼠建立AD模型，研究AS對AD小鼠皮層組織中caspase-3基因表達的影響，為初步闡明AS治療AD的作用機制及其新藥研制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 類葉升麻苷（AS，純度＞98%），由本實驗室自制［7］；D-半乳糖（批號 1401534546030 21）購自 Sigma公司；AlCl3·6H2O（批號 20110704）為天津光復精細化工研究所產品；vitamin E（VitE，批號YY11518）購自上海源葉生物科技有限公司；AChE試劑盒（批號20130717）、BCA試劑盒（批號20130712）為南京建成生物工程研究所產品；4%多聚甲醛（批號09B27C68）、SABC免疫組化試劑盒（批號SA132100）購自武漢博士德生物工程有限公司；Caspase 3一抗（批號 GR123686-1）、β-actin一抗（批號 GR123987-1）、山羊抗兔 IgG二抗（批號GR119224-5）為Abcam公司產品。

1.2 主要儀器 IVC獨立送風隔離籠具（蘇州馮氏實驗動物設備有限公司，IVC-Ⅱ），跳臺儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司，YLS-3TB），分析天平［BS224S，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］，全波長酶標儀（美國ThermoFisher公司，Multiskan Go 1510），高速低溫離心機（美國 Beckman公司，ALLEGRA64R），光學顯微鏡（德國 LEICA公司，DM2500），生物組織攤烤片機（天津天利航空機電有限公司，KZPJ-1A），生物組織包埋機（浙江科迪儀器設備有限公司，KD-BMⅡ），組織脫水機（浙江科迪儀器設備有限公司，KEDEE KD-TS3D），石蠟切片機（德國LEICA公司，RM2135）。

1.3 動物模型制備及分組給藥 KM小鼠（♀，18±2 g），購自新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物中心。于IVC盒中適應性飼養(yǎng)7 d，經強迫游泳和疲勞轉棒測試，剔除體能和智力較差的小鼠。選取120只小鼠，稱取體重，隨機分成6組，即：正常組，模型組，陽性藥（VitE）組，AS低、中、高劑量組，每組20只。分組完成后，正常組小鼠分別腹腔注射和灌胃10 ml·kg－1·d－1的生理鹽水，其余各組小鼠腹腔注射60 mg·kg－1·d－1的 D-半乳糖和灌胃 5 mg·kg－1·d－1的AlCl3，連續(xù)造模60 d。從 d 61開始，上午小鼠繼續(xù)造模，下午對小鼠進行灌胃給藥，連續(xù)給藥30 d（造模和給藥共 90 d）：① 正常組：10 ml·kg－1·d－1的生理鹽水；② 模型組：10 ml·kg－1·d－1的生理鹽水；③ VitE組：150 mg·kg－1·d－1的維生素E；④ AS低劑量組：30 mg·kg－1·d－1的 AS；⑤ AS中劑量組：60 mg·kg－1·d－1的 AS；⑥ AS高劑量組：120 mg·kg－1·d－1的 AS。

1.4 跳臺法測定小鼠學習與記憶能力 小鼠造模d 89，AS給藥2 h后開始訓練，將小鼠放入跳臺箱內適應環(huán)境3min，然后立即通以36V，2mA的交流電。此時，小鼠為了逃避遭受電擊而躍上安全平臺，開始計時并觀察5 min內受電擊的次數(shù)（即錯誤次數(shù)），作為學習成績。同時記錄計時開始至小鼠走下平臺遭受電擊的時間，作為下臺潛伏期，潛伏期超過300 s，則以300 s計算。24 h后測其記憶能力：將訓練過的小鼠穩(wěn)當?shù)胤庞谔_上，通電并開始計時，記錄開始至小鼠走下平臺的時間（下臺潛伏期），以及5 min內小鼠走下平臺遭受電擊的次數(shù)（即錯誤次數(shù)），作為記憶成績，進行統(tǒng)計學檢驗。

1.5 小鼠血清與腦組織中AChE活性的測定 小鼠完成給藥和跳臺測試后，每組取10只摘眼球取血，分離血清。然后在冰上剝離腦組織并稱重，加入9倍的生理鹽水，勻漿并以3 500 r·min－1離心10 min，吸上清液備用。利用南京建成生物工程研究所的AChE試劑盒和BCA試劑盒測定小鼠血清與腦組織中AChE活性，具體測定方法為：分別設置并標記測定管、對照管、標準管（3個）和空白管（3個）。在測定管中加入50μl的待測血清或腦組織勻漿，標準管中加入50μl的1 mmol·L－1標準應用液，空白管加入50μl雙蒸水，對照管不加。然后在所有管中加入500μl的底物緩沖液和500μl的顯色應用液，混勻，37℃反應6 min。反應完成后，依次在所有管中加入30μl的抑制劑、100μl的透明劑、50 μl的穩(wěn)定劑，同時樣品對照管中加入50μl的待測血清或腦組織勻漿?；靹?，室溫放置15 min，于全波長酶標儀測定412 nm處吸光度值。并通過公式計算小鼠血清與腦勻漿中的AChE活性。血清中AChE活力＝（測定OD值－對照OD值）／（標準OD值－空白OD值）×標準品濃度×樣品測試前稀釋倍數(shù)；腦勻漿中AChE活力＝（測定OD值－對照OD值）／（標準OD值－空白OD值）×標準品濃度÷待測樣本蛋白濃度。

1.6 HE染色觀察小鼠皮層組織結構的變化 每組另取10只小鼠，脫頸椎處死，于冰上剝離腦組織，以預冷的生理鹽水洗滌1遍，之后將腦組織固定于4%的多聚甲醛過夜。腦組織經常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（每張切片厚度約為5μm）后，進行HE染色。具體方法為：①二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ10 min→無水乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、80%乙醇各5 s→水洗（直接入自來水洗一遍）。②蘇木精染色5～10 min。③自來水洗，洗去多余的染液（可多洗幾遍）。④鹽酸乙醇分化（先備好足夠的自來水，將切片在鹽酸乙醇缸內快速沾一下，立即入自來水中返藍，換一遍自來水繼續(xù)返藍1 min）。⑤伊紅染液3～5 min。⑥自來水洗，洗去多余的染液（可多洗幾遍）。⑦脫水（梯度酒精80%、95%I、95%乙醇Ⅱ、無水乙醇各5 s）。⑧透明（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5 s），取出封片（中性樹膠）。⑨鏡檢，在顯微鏡下觀察切片并拍照。應用Image-pro plus 6.0分析軟件分別選取相同倍數(shù)下的3個視野，進行神經細胞計數(shù)。

1.7 免疫組化觀察小鼠皮層組織中caspase-3的表達變化 將石蠟切片按方法“1.6”進行脫蠟和水化，然后進行免疫組化染色，具體方法如下：①去除內源性過氧化物酶：3%H2O2室溫10 min，蒸餾水洗，PBS液洗。②預處理（抗原修復）：0.01 mol·L－1枸櫞酸抗原修復液，微波修復，解凍溫度（92～98）℃10 min，室溫冷卻，蒸餾水洗1遍，PBS液洗1遍。③加caspase-3一抗，37℃溫箱孵育60min或4℃冰箱過夜，PBS液洗3遍。④滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體（二抗），37℃溫箱孵育25 min，PBS液洗3遍。⑤新鮮配制的DAB顯色液顯色（顯微鏡下控制顯色時間3～10 min），自來水終止顯色。⑥蘇木精復染5～10 min，蒸餾水洗，鹽酸乙醇分化（快速沾一下），溫水返藍1 min、脫水（梯度乙醇80%、95% Ⅰ Ⅱ、無水乙醇各5 s）、透明（二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5 s）。⑦封片（中性樹膠），顯微鏡觀察并拍照。應用Image-pro plus 6.0分析軟件，分別選取相同倍數(shù)下的6個視野，進行陽性細胞計數(shù)。同時依照細胞陽性著色程度（抗原含量）進行吸光度評分，評分標準為：弱陽性（1分），中等陽性（2分），強陽性（3分）。

1.8 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)均以±s表示，利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，用one-way ANOVA進行組間比較分析。

2 結果

2.1 AS對AD小鼠學習與記憶的影響 小鼠跳臺實驗常被用于評價癡呆小鼠被動回避學習記憶能力。與正常組比較，KM小鼠經D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁誘導90 d后，其下臺潛伏期明顯縮短（P＜0.05），錯誤次數(shù)明顯增加（P＜0.01）。而經 AS給藥30 d后，與模型組相比，AS各劑量組均可明顯減少小鼠下臺的錯誤次數(shù)（P＜0.01），對其下臺潛伏期具有一定延長作用，但差異無顯著性（P＞0.05）。結果表明AS對D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁誘導的小鼠被動回避學習能力具有一定改善作用。從24 h后的小鼠記憶能力測試結果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠回避記憶能力明顯低于正常組小鼠，其下臺潛伏期明顯縮短（P＜0.05）、錯誤次數(shù)明顯增加（P＜0.05）。與模型組相比較，除VitE組以外，其余AS給藥組均能明顯延長下臺潛伏期（P＜0.05或P＜0.01）和減少錯誤次數(shù)（P＜0.05或 P＜0.01）。此外，AS低、中劑量組較正常組能延長小鼠下臺潛伏期（P＜0.05）和減少錯誤次數(shù)（P＜0.05或 P＜0.01），AS高劑量組也能明顯減少錯誤次數(shù)（P＜0.05），結果表明AS具有良好的改善和增強模型小鼠記憶能力損傷的作用（Tab 1）。

2.2 AS對AD小鼠血清和腦組織中AChE活性的影響 乙酰膽堿（ACh）是中樞神經系統(tǒng)的主要神經遞質之一，與學習記憶密切相關，AChE是ACh的水解酶，其活力可間接反映ACh的含量，反映膽堿能神經功能的情況。本實驗中小鼠經D-半乳糖和AlCl3誘導造模90 d后，模型小鼠血清和腦組織中AChE活力明顯高于正常組（P＜0.05），說明造模對小鼠膽堿能神經功能有明顯的損傷作用。而經不同濃度AS治療30 d后，與模型組比較，AS低、中劑量組均能明顯抑制 AChE活力（P＜0.05或 P＜0.01），表明除AS高劑量組以外，其余給藥組對小鼠的膽堿能神經功能的損傷均具有改善作用（Tab 2）。

2.3 AS對AD小鼠皮層組織結構的影響 HE染色后，神經細胞胞質呈紫紅色，核呈紫藍色，可以清楚地觀察細胞的整體形態(tài)。本實驗中正常組小鼠皮層腦細胞結構正常，數(shù)量較多，胞核清晰，胞質豐富，間質無水腫表現(xiàn)。模型組小鼠皮層神經細胞減少，體積變小，胞核與胞質界限模糊，核固縮呈三角形或不規(guī)則形，核仁消失。與模型組比較，VitE組小鼠皮層神經細胞結構較正常，數(shù)量較多，雖仍有不同程度的神經細胞變形，但變形神經細胞數(shù)量明顯減少；AS低、中、高劑量組小鼠皮層神經元細胞結構正常，密度增高，胞核清晰，胞質豐富。表明AS對D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁誘導小鼠皮層組織損傷具有一定的保護作用（Fig 1，2）。

2.4 AS對AD小鼠皮層組織中caspase-3表達的影響 應用免疫組織化學染色法檢測各組小鼠皮層caspase-3表達的變化，光鏡下可見caspase-3免疫組化染色陽性標記物為深淺不一的棕黃色顆粒，位于神經元胞質內。結果顯示模型組小鼠皮層組織可以見到較多的caspase-3免疫反應陽性神經元，其陽性細胞數(shù)目以及光密度值評分均較正常組明顯增高（P＜0.01）。而 AS各給藥組小鼠皮層均可見caspase-3免疫反應陽性神經元減少，染色變淺，其陽性細胞數(shù)目以及光密度值評分均較模型組明顯降低（P＜0.05或 P＜0.01），而VitE組無明顯變化（P＞0.05）（Fig 3，Tab 3）。

Tab 1 Effects of acteoside on learning and memory ofm ice induced by a combination of D-galactose and AlCl3±s，n＝12）

Tab 1 Effects of acteoside on learning and memory ofm ice induced by a combination of D-galactose and AlCl3±s，n＝12）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group.

Group Concentration／mg·kg－1·d－1 Learning Memory Step-down latency／s Error frequency／t Control 127.44±25.35 3.56±0.89 186.72±55.2 Step-down latency／s Error frequency／t 1.00±0.29 Model 86.94±27.69* 6.44±1.20** 135.72±49.58* 1.50±0.25*VitE 150 95.24±33.32 3.41±1.17＃＃ 168.65±48.65 1.41±1.58 AS 30 104.78±45.96 3.44±0.57＃＃ 252.33±61.526*＃＃ 0.56±0.25*＃＃AS 60 98.94±26.37 3.82±1.07＃＃ 258.59±70.77*＃＃ 0.29±0.22**＃＃AS 120 103.29±89.32 3.94±1.46＃＃ 216.35±101.16＃ 0.65±0.38*＃0

3 討論

AD作為一種原因不明、進行性、與衰老相關的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，是老年癡呆的最常見原因。迄今為止，AD的發(fā)病機制仍不明確，由于缺少理想的細胞及動物評價模型，因而導致AD的預防、治療及新藥研制受到限制。文獻資料顯示［8－9］，D-半乳糖會引起腦神經元的一系列退行性變化。D-半乳糖可在醛糖還原酶的作用下生成半乳糖醇和H2O2，同時在反應過程中生成超氧陰離子。通過對嚙齒類動物長期注射D-半乳糖可引起過量的氧自由基，在動物體內與細胞中的脂質、蛋白和核酸產生非酶糖基化、氧化應激－自由基損傷作用及誘導醛糖還原酶活性增強等一系列病理改變，進而使其多器官功能衰退而出現(xiàn)亞急性衰老表現(xiàn)。AD患者腦組織中的鋁含量也較正常人有所增高［10］，含量可達（3.6±2.9）mg·g－1。鋁元素具有神經毒性，其通過離子形式可透過腸屏障和血腦屏障，進入大腦取代Ca2＋和Mg2＋，與氨基酸鏈上的谷氨酸或精氨酸的羧基結合形成谷氨酸鋁鹽或精氨酸鋁鹽的穩(wěn)定復合物。Yang［11］和 Luo［5］等利用 D-半乳糖和三氯化鋁共同作用，成功誘導小鼠產生學習記憶力減退，腦內AChE活性升高，Aβ水平升高等AD病理特征。因此，應用D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁對大腦的綜合毒性模型，更貼近人類的AD病癥，也更有利于AD藥物的藥效評價。

Fig 1 Effect of acteoside on tissue structure changes of cerebral cortex in m ice induced by a combination of D-galactose and AlCl3（400×）A：Control group；B：Model group；C：VitE group；D：AS（30 mg·kg－1·d－1）；E：AS（60 mg·kg－1·d－1）；F：AS（120 mg·kg－1·d－1）

Tab 2 Effects of acteoside on activity of AChE in serum and brain ofm ice induced by a combination of D-galactose and AlCl3（xˉ±s，n＝10）

Tab 2 Effects of acteoside on activity of AChE in serum and brain ofm ice induced by a combination of D-galactose and AlCl3（xˉ±s，n＝10）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model.

Group Concentration／mg·kg－1·d－1 Serum／kU·L－1 Brain／kU·g－1Pro Control 3.427±1.117 0.965±0.146 Model 5.573±1.708* 2.612±0.471**VitE 150 3.588±0.4723＃ 2.047±0.438 AS 30 4.170±0.912＃ 1.352±1.383＃＃AS 60 3.315±1.090＃ 1.109±1.126＃＃AS 120 4.626±0.762 0.939±1.608＃＃

Fig 2 Effect of acteoside on number of neuron changes of cerebral cortex in m ice induced by a combination of D-galactose and AlCl3（ˉx±s，n＝10）*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model.

Tab 3 Expression of caspase-3 of cerebral cortex in m ice induced by a combination of D-galactose and AlCl3（±s，n＝10）

Tab 3 Expression of caspase-3 of cerebral cortex in m ice induced by a combination of D-galactose and AlCl3（±s，n＝10）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model.

Group Concentration／mg·kg－1·d－1 Positive cell rate／%Optical density score Control 14.67±4.58 1.75±0.46 Model 37.12±13.29** 2.75±0.46**VitE 150 28.88±5.54 2.88±0.35 AS 30 20.56±9.07＃＃ 2.11±0.78＃AS 60 14.38±7.21＃＃ 1.62±0.74＃＃AS 120 15.40±3.10＃＃ 1.60±0.52＃＃

Fig 3 Expression of caspase-3 of cerebral cortex in m ice induced by a combination of D-galactose and AlCl3（40×）A：Control group；B：Model group；C：VitE group；D：AS（30 mg·kg－1·d－1）；E：AS（60 mg·kg－1·d－1）；F：AS（120 mg·kg－1·d－1）

本實驗利用D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁誘導小鼠90 d后，與正常組比較，模型組小鼠的學習、記憶能力明顯下降，血清和腦組織中的AChE活性明顯升高，證明AD模型建立成功。通過30、60、120 mg·kg－1·d－1的 AS治療 30 d后，與模型組比較，AS各給藥組小鼠在跳臺檢測中均能延長下臺潛伏期和減少錯誤次數(shù)，同時小鼠血清和腦組織中AChE活性亦明顯降低，表明AS對D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁誘導的小鼠腦損傷具有明顯保護作用，尤其是對小鼠記憶能力的改善作用較明顯。此外，在30～120 mg·kg－1·d－1的給藥濃度范圍內，AS對腦損傷小鼠的保護作用無濃度依賴性。

已有研究表明［6］，AD腦內存在神經元丟失現(xiàn)象，而細胞凋亡與AD發(fā)病關系密切。caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族caspases成員之一，不僅參與AD患者腦內β淀粉樣蛋白的切割，還是細胞凋亡調控的關鍵環(huán)節(jié)之一［12］。正常生理狀態(tài)下，caspase-3以酶原形式（33 ku）存在于細胞質中，一旦受到凋亡信號刺激，活化的caspase-3便能特異性切割DNA，使參與DNA損傷修復過程的PARP以及DNA-PK等失活，促使染色質凝集和核酶激活，而導致細胞凋亡［6］。因此，篩選caspase-3活化抑制劑及神經元凋亡抑制藥物可能是AD治療的一個重要靶向。本研究結果顯示，模型組小鼠皮層組織中的神經細胞明顯減少，caspase-3基因表達明顯上調。而經不同濃度AS治療后，小鼠皮層組織中神經細胞的形態(tài)和數(shù)量均較模型組有明顯改善，且皮層組織中caspase-3的基因表達明顯下調。在給藥濃度范圍內，AS對小鼠皮層組織神經細胞的形態(tài)改善和caspase-3的基因表達調控亦無濃度依賴性。

綜上所述，AS能夠明顯提高由D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁誘導的AD病樣小鼠學習和記憶能力，抑制其血清和腦組織中的AChE活性。研究結果提示，AS對D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁誘導的小鼠腦損傷具有明顯保護作用，其保護機制可能與AS抑制小鼠皮層組織caspase-3基因表達，進而維持皮層組織神經細胞的正常形態(tài)及數(shù)量有關。但是，caspase-3基因僅僅只是caspase凋亡基因家族中的一員，而AD又是多因素引起的復雜性疾病，因此在對AD小鼠治療過程中，AS僅是通過抑制caspase-3基因表達，亦或是其還通過其他作用靶點發(fā)揮作用，仍有待于更深入的研究。

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