亓翠玲， 周鑫磊， 葉 杰， 楊 揚， 章倩倩， 李江超， 蘭 天， 何曉東， 王麗京

(廣東藥學院血管生物學研究所，廣東廣州 510006)

穿心蓮內酯對口腔癌生長的影響*

亓翠玲， 周鑫磊， 葉 杰， 楊 揚， 章倩倩， 李江超， 蘭 天， 何曉東， 王麗京△

(廣東藥學院血管生物學研究所，廣東廣州 510006)

目的：探討穿心蓮內酯對口腔癌的作用及其機制。方法：用穿心蓮內酯及其對照藥物治療金黃地鼠頰囊癌，通過測量腫瘤體積觀察治療效果。用免疫組化檢測穿心蓮內酯對腫瘤血管和腫瘤細胞增殖的作用，用TUNEL法檢測穿心蓮內酯對腫瘤細胞凋亡的作用，用免疫組化檢測凋亡信號分子caspase-3的表達情況。結果：穿心蓮內酯治療組頰囊癌的腫瘤體積明顯比對照組小，腫瘤微血管密度和增殖的腫瘤細胞也明顯低于對照組，腫瘤細胞的凋亡率明顯高于對照組，而且治療組中caspase-3明顯被活化。結論：穿心蓮內酯通過抑制腫瘤血管生成和腫瘤細胞增殖以及促進腫瘤細胞凋亡，抑制了金黃地鼠頰囊癌的生長。穿心蓮內酯通過caspase-3途徑誘導了腫瘤細胞的凋亡。

穿心蓮內酯;細胞凋亡;血管生成;口腔腫瘤

穿心蓮是爵床科穿心蓮屬植物，是一種天然的抗炎植物藥。穿心蓮內酯(andrographolide，Andro)是其主要有效成分之一，是一種二環(huán)雙萜內酯類化合物。Andro是一種傳統(tǒng)的抗炎藥物，而且研究報道Andro還對動脈粥樣硬化及高血壓有一定療效以及具有免疫調節(jié)等作用［1-2］。許多研究報道 Andro對腫瘤具有明顯的抑制作用。體外研究表明Andro對MCF-7乳腺癌細胞及HCT-116直腸癌細胞有顯著的抑制作用［3］，Andro還可以提高腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor alpha，TNF-α)的表達及細胞周期蛋白標志物的表達，使得淋巴細胞抗腫瘤細胞的細胞毒活性增加，這可能起到間接的抗腫瘤作用。Andro可以通過阻滯細胞周期影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究報道Andro使MCF-7細胞滯留在G0/G1期，主要是通過半合成一個 Andro的類似物 DRF3188，DRF3188使細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶和細胞周期蛋白D1等細胞周期因子表達量明顯減少［4］。Andro還可誘導HL-60細胞周期阻滯［5］，Andro可以通過激活caspase-3及caspase-8誘導前列腺癌PC3細胞凋亡［6］。研究報道Andro還具有抗血管生成的作用。通過主動脈環(huán)實驗發(fā)現(xiàn)Andro可以阻抑微血管的生長。Andro治療黑色素瘤后，發(fā)現(xiàn)腫瘤的微血管數(shù)與對照組相比有顯著差異［1］。本研究用二甲基苯并蒽［7，12-dimethylbenz(a)anthracene，DMBA］誘導金黃地鼠頰囊癌模型，發(fā)現(xiàn)Andro可以抑制地鼠頰囊癌的增殖，誘導頰囊癌細胞凋亡，抑制腫瘤誘發(fā)的新生血管的生成，從而發(fā)揮抑制頰囊癌生長的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 敘利亞金黃地鼠80只，6～8周齡，體重80～100 g，雌雄各半，購于中山大學實驗動物中心。

1.1 試劑 DMBA購自 Sigma。工作液濃度: 0.5%;配制量:100 mL。配制方法:DMBA粉末5 mg溶解于100 mL丙酮中，-20℃保存。BrdU粉末及rabbit anti-mouse BrdU抗體購自北京中杉金橋有限公司。Rabbit anti-mouse vWF(von Willebrand factor)抗體購自Santa Cruz，rabbit anti-mouse caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology。TUNEL試劑盒購自Roche。

2 方法

2.1 金黃地鼠頰囊癌模型的構建 每周一、三、五下午以4號水彩筆在地鼠單側頰囊(右側)涂致癌劑DMBA，沿同一方向刷3次，涂抹劑量相當于0.1 mL，至9周時停止涂藥。至第14周時用Andro治療地鼠頰囊癌模型。測量每只動物的腫瘤體積(計算公式:0.52×長徑×短徑2)，將腫瘤體積過大和過小的動物剔除后，還剩余52只腫瘤模型動物，然后將實驗動物用單純隨機數(shù)字法分組，隨機分為3組，分組情況為Andro治療組22只，對照組分別為4H-Andro(Andro經(jīng)過化學結構修飾后藥物活性消失的化合物)組16只和Blank組14只。圖1為金黃地鼠頰囊癌模型的建立。

Figure 1. Chemical-induced hamsterbuccalpouch cancer model.A:hamster;B:the fixing device of hamster;C:hamster buccal pouch;D:chemical-induced hamster buccal pouch cancer.圖1 金黃地鼠頰囊癌模型的建立

2.2 治療方案 各組動物均以腹腔注射方式給藥，治療劑量為6.2 μg/g體重，每周治療2次，共治療5周，每次治療前都要觀察腫瘤體積、體重并做記錄。

2.3 免疫組化 將金黃地鼠腫瘤組織用甲醛固定后，石蠟包埋，切片。切片脫蠟后，用PBS洗3次，每次5 min。高壓修復10 min。PBS洗后，用3%H2O2甲醇37℃孵育30 min。10%BSA封閉后，加rabbit anti-mouse vWF抗體、rabbit anti-mouse BrdU抗體或rabbit anti-mouse caspase-3抗體，4℃過夜。第2天，復溫后，PBS洗，滴加anti-rabbitⅡ抗，37℃ 50 min。DAB顯色，蘇木精復染后，脫水、透明、封片。

2.4 TUNEL 組織切片脫蠟至水，沸熱修復7 min。PBS洗后，用3%H2O2甲醇37℃孵育30 min。加TUNEL反應液，37℃孵育90 min。PBS洗后，加Converter-POD，37℃孵育30 min。DAB顯色后蘇木素復染，脫水，封片。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包和SigmaPlot軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 Andro抑制了金黃地鼠頰囊癌腫瘤體積的增長

Andro治療組與實驗對照組相比，治療組金黃地鼠頰囊癌腫瘤體積的增長速度明顯減慢，而對照組腫瘤體積增長速度快，瘤體易破，易出血，說明Andro可以抑制腫瘤的生長，見圖2。

2 Andro對腫瘤細胞增殖的影響

BrdU抗體免疫染色陽性結果為增殖程度高的腫瘤細胞核區(qū)棕黃色著色。BrdU表達結果表明實驗組和對照組有顯著差異(P＜0.01)，見圖3。

3 Andro對腫瘤組織中微血管密度(microvascular density，MVD)的影響

Andro治療組內MVD比對照組明顯降低，見圖4，說明Andro抑制了腫瘤組織內新生血管的形成。

4 Andro對腫瘤組織中細胞凋亡的影響

4.1 Andro促進了腫瘤組織中細胞凋亡 Andro治療組內凋亡細胞明顯比空白對照組和4H-Andro組多，見圖5，說明Andro促進腫瘤組織內細胞的凋亡。

4.2 Andro通過活化caspase-3而誘導腫瘤組織內細胞凋亡 Andro可顯著誘導caspase-3活化，從而促進凋亡的發(fā)生，見圖6。

Figure 2.The effect of Andro on hamster buccal pouch cancer growth.Mean±SD.n=22 in Andro group;n=16 in 4H-Andro group;n=14 in blank group.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs Andro.圖2 Andro抑制了金黃地鼠頰囊癌腫瘤體積的增長

Figure 3.The effect of Andro on hamster buccal pouch cancer cell proliferation.Mean±SD.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank or 4H-Andro.圖3 Andro抑制了腫瘤細胞增殖

Figure 4.MVD in hamster buccal pouch cancer tissues was investigated by vWF immunohistochemicalstaining.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs blank or 4H-Andro.圖4 Andro抑制腫瘤組織內新生血管的形成

Figure 5.Tumor cell apoptosis in hamster buccal pouch cancer tissues was detected by TUNEL.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs blank or 4H-Andro.圖5 Andro促進腫瘤組織內細胞凋亡

討論

口腔癌是人體常見的腫瘤之一［7］。近年來口腔癌的發(fā)病率有明顯的上升趨勢，特別是發(fā)病年齡趨向年輕化。口腔鱗癌不僅發(fā)病率高，且惡性程度較高;往往造成語音、咀嚼、吞咽、面容等功能障礙和嚴重的面容毀損，并威脅到患者的生命;五年生存率只有60%左右。盡管近來口腔癌手術方法的不斷改進以及放療、化療的廣泛應用，但口腔癌的五年生存率并沒有明顯提高［8］。

地鼠頰囊癌是Salley［9］在1954年建立的一種化學誘導的自發(fā)性腫瘤模型，是目前公認的研究口腔癌的良好動物模型。地鼠口腔特有的頰囊結構是較為理想的誘癌部位，利用化學致癌劑二甲基苯并蒽誘發(fā)頰囊口腔癌，它與人體自然成癌過程極為相似，能夠動態(tài)、直觀地觀察腫瘤形成中單純增生、異常增生、原位癌、浸潤癌各階段的病理變化和檢測成癌過程中相關分子標志物的動態(tài)改變［10-11］，因此它廣泛地應用于口腔鱗狀細胞癌病理學、細胞動力學、癌變潛力、抗癌藥物篩選和腫瘤早期預防的研究中［12-13］。

Figure 6.The activation of caspase-3 in hamster buccal pouch cancer tissues.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs blank or 4H-Andro.圖6 Andro活化了caspase-3

近年來，文獻報道Andro對多種腫瘤細胞有殺傷作用［3］，但Andro對化學致癌劑誘導的口腔腫瘤形成有何種作用目前國內還未見報道。為回答上述第一個問題，即穿心蓮內酯是否對腫瘤的生長有抑制作用，我們首先構建了金黃地鼠頰囊模型，在誘癌成功后用Andro進行治療，通過觀察腫瘤體積來考察Andro對口腔癌生長的抑制作用。結果顯示An dro治療組腫瘤體積的增長較blank組及4H-Andro組明顯減緩，經(jīng)統(tǒng)計學分析組間有顯著差異，說明Andro可以抑制口腔癌生長。為進一步研究Andro對口腔癌的作用機制，我們取地鼠腫瘤組織，用免疫組織化學的方法探討Andro作用后地鼠頰囊癌組織中其增殖、凋亡及血管等生物學特性變化的情況。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與諸多因素相關，如細胞增殖的增強、凋亡的抑制、新生血管形成等方面，而具有高增殖活性是腫瘤細胞的生物學特性之一。因此我們檢測了地鼠頰囊癌組織中細胞的增殖活性。BrdU是一種可以與胸腺嘧啶競爭性參與細胞S期合成的藥物，又因為其帶有溴標記物，因此可以檢測細胞的增殖情況［14-15］。通過BrdU實驗我們發(fā)現(xiàn)，用Andro治療實驗動物后，其腫瘤組織內細胞的增殖活性受到明顯抑制。腫瘤的增殖與凋亡存在平衡關系。腫瘤的發(fā)展通常是增殖加強與凋亡受阻共同作用的結果。我們通過TUNEL實驗發(fā)現(xiàn)Andro可以顯著促進頰囊癌腫瘤組織中細胞凋亡。同時Andro可以顯著誘導地鼠頰囊組織caspase-3活化水平增加。Zhou等［5］在體外實驗研究中證實，Andro可以通過Bcl-2家族蛋白誘導caspase-3及caspase-9活化從而促進腫瘤細胞的凋亡，這與我們的研究結果相一致。還發(fā)現(xiàn) Andro作用于地鼠頰囊癌后，腫瘤組織內的MVD水平顯著降低，說明Andro可以抑制腫瘤誘發(fā)的新生血管生成。同時有文獻報道，在C57BL/6鼠中，腹腔注射Andro可顯著抑制接種B16F10黑色素瘤細胞誘導的新生血管形成，治療組微血管數(shù)與對照組相比有顯著差異［1］。

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Effect of andrographolide on oral squamous cell carcinogenesis

QI Cui-ling，ZHOU Xin-lei，YE Jie，YANG Yang，ZHANG Qian-qian，LI Jiang-chao，LAN Tian，HE Xiao-dong，WANG Li-jing
(Vascular Biology Institute，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China.E-mail:wanglijing62@ 163.com)

AIM:To study the effect of andrographolide(Andro)on oral squamous cell carcinogenesis.METHODS:Chemical-induced hamster buccal pouch cancer model was used.The tumor cell proliferation，apoptosis and microvessel density(MVD)were detected by immunohistochemical staining.RESULTS:Compared with control group，the tumor volume，MVD and tumor cell proliferation in Andro group were significantly decreased.The cell apoptotic cell number in Andro group was higher than that in control group.Caspase-3 was also activated in Andro group.CONCLUSION:Andro inhibits tumor growth by suppressing proliferation，decreasing MVD and promoting apoptosis in the hamster buccal pouch.Furthermore，Andro promotes tumor cell apoptosis through caspase-3 pathway.

Andrographolide;Apoptosis;Angiogenesis;Mouth neoplasms

R739.8

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.003

1000-4718(2014)03-0400-04

2013-09-23

2013-12-23

國家自然科學基金資助項目(No.31271455)

△通訊作者Tel:020-39352126;E-mail:wanglijing62@163.com