曾林涓， 李景果， 張秋波， 錢辰琛， 林 忠， 陳茵婷， 黃開紅

(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣東珠海 519000)

人胰腺癌PANC-1細(xì)胞裸鼠移植瘤模型建立及其用于觀察載siRNA納米微粒體內(nèi)效應(yīng)的研究*

曾林涓， 李景果， 張秋波， 錢辰琛， 林 忠， 陳茵婷△， 黃開紅△

(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣東珠海 519000)

目的：探討建立人胰腺癌PANC-1裸鼠移植瘤模型的最佳實(shí)驗(yàn)方法，并應(yīng)用該模型進(jìn)行載基因納米微粒體內(nèi)效應(yīng)的研究。方法：將不同數(shù)量PANC-1細(xì)胞懸液接種于BALB/c(nu/nu)小鼠右側(cè)背部皮下，當(dāng)腫瘤體積達(dá)100 mm3時(shí)尾靜脈注射siRNACY5.5納米復(fù)合物進(jìn)行活體熒光成像。此外，于尾靜脈注射負(fù)載siRNAKras納米復(fù)合物，蛋白印跡及免疫組織化學(xué)染色法觀察腫瘤組織Kras蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：1×107cells/300 μL接種成瘤率達(dá)100%，成瘤時(shí)間＜2周。熒光呈像及組織學(xué)檢查顯示載siRNA納米微粒可靶向聚集在腫瘤組織發(fā)揮體內(nèi)基因沉默效應(yīng)。結(jié)論：本研究報(bào)道的人胰腺癌裸鼠移植瘤模型建立方法成瘤率達(dá)100%，成瘤時(shí)間短，是研究藥物示蹤和觀察療效的理想模型。

胰腺腫瘤;模型，動(dòng)物;納米微粒;RNA干擾

胰腺癌(pancreatic cancer，PA)是一類惡性度高、進(jìn)展快、預(yù)后極差的消化道腫瘤，嚴(yán)重危害人類身體健康。早期根治性手術(shù)切除是可能治愈PA的唯一手段，但是，絕大多數(shù)PA患者就診時(shí)已屬晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，PA早診率和長期生存率均不到5%。利用納米載體靶向腫瘤組織進(jìn)行化學(xué)藥物治療、基因治療或者攜帶影像對(duì)比劑進(jìn)行腫瘤診斷是近年來的研究熱點(diǎn)［1］。建立動(dòng)物移植瘤模型是進(jìn)行納米抗腫瘤研究中不可缺少的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過確定最佳接種條件，使得人胰腺癌裸鼠移植瘤模型在2周內(nèi)100%成瘤，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 細(xì)胞株

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1購自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，用含10%胎牛血清、4 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM(高糖)培養(yǎng)基在37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

2 動(dòng)物

4～5周齡雌性BALB/c(nu/nu)小鼠購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)為SCXK(粵)2011-0029］。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并飼養(yǎng)于該實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)屏蔽環(huán)境中，小鼠分籠飼養(yǎng)，4～5只/籠，自由飲水和進(jìn)食。

3 主要試劑

納米載體PEG-PLL由中山大學(xué)化工學(xué)院提供，具體合成方法及表征參見文獻(xiàn)［2］。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco，針對(duì)突變Kras基因siRNA(siKras)及陰性對(duì)照siRNA(scrambled control RNA，SCR)由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成，CY5.5標(biāo)記的陰性對(duì)照 siRNA (siCY5.5)由廣州銳博公司設(shè)計(jì)合成。KrasⅠ抗購自Gene Tex。

siKras正義鏈5’-AGUUGGAGCUGAUGGCGUA dTdT-3’，反義鏈3’-dTdT UCAACCUCGACUACCGCAU-5’;SCR正義鏈 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈 3’-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5’。

4 主要方法

4.1 人胰腺癌BALB/c(nu/nu)小鼠皮下移植瘤模型的建立 將PANC-1細(xì)胞用PBS制成細(xì)胞懸液，分別取1×106cells/100μL PBS、5×106cells/100μL PBS、1×107cells/100μL PBS、1×107cells/300μL PBS液接種于BALB/c(nu/nu)小鼠右側(cè)背部皮下，每3 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，腫瘤體積(mm3)= L×W2/2，其中L為腫瘤長徑，W為與L垂直的最短徑(單位均為mm)，觀察時(shí)間為5周。

4.2 活體熒光成像 當(dāng)腫瘤體積達(dá)100 mm3時(shí)隨機(jī)選取3只荷瘤鼠進(jìn)行活體成像實(shí)驗(yàn)。小動(dòng)物活體熒光成像儀(Carestream In Vivo Fx Pro.)用于觀察PEG-PLL/siCY5.5納米微粒(nanoparticles，NPs)在體內(nèi)的分布。將75 μg PEG-PLL和20 μg siCY5.5混合，室溫靜置20 min以制備PEG-PLL/siCY5.5復(fù)合物(siCY5.5-NPs)，然后將復(fù)合物用等量PBS稀釋后經(jīng)尾靜脈緩慢注入。分別在注射前以及注射后2、6、24 h采集熒光圖像，注射前采集的圖像用以扣除動(dòng)物自身發(fā)出的熒光。在預(yù)設(shè)的時(shí)點(diǎn)將動(dòng)物安樂死，取出腫瘤組織和心、肝、腎等器官，再次進(jìn)行熒光成像。

4.3 激光共聚焦顯微鏡觀察 將腫瘤組織冰凍包埋，-20℃條件進(jìn)行冰凍切片，連續(xù)制備6 μm組織切片，在激光共聚集顯微鏡(Zeiss)下觀察熒光物質(zhì)的分布。

4.4 載siRNA納米微粒的體內(nèi)效應(yīng) 當(dāng)腫瘤體積達(dá)100 mm3時(shí)隨機(jī)選取18只荷瘤鼠隨機(jī)分為3組(每組6只)進(jìn)行體內(nèi)基因沉默實(shí)驗(yàn)，分別于尾靜脈注射(1)PBS;(2)PEG-PLL/SCR(SCR-NPs);(3) PEG-PLL/siKras(siKras-NPs)，siRNA用量為每只動(dòng)物20 μg。1周以后將荷瘤鼠安樂死，剖出腫瘤組織稱重，并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)和免疫組織化學(xué)染色觀察腫瘤組織Kras蛋白表達(dá)水平。

4.4.1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)移植瘤中Kras蛋白的表達(dá) 常規(guī)方法抽提組織總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，取50 μg蛋白于12%SDS-PAGE，后恒流60 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶室溫封閉2 h，加入目的蛋白和內(nèi)參蛋白Ⅰ抗，于4℃搖床孵育過夜，加入HRP標(biāo)記Ⅱ抗，室溫孵育2 h，把PVDF膜置于曝光盒內(nèi)，均勻涂上化學(xué)發(fā)光液，蓋上膠片，暗室內(nèi)曝光0.5～5 min后顯影、定影，觀察條帶。用ImageJ軟件對(duì)獲得的條帶進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH為內(nèi)參照，以目的/內(nèi)參照比值來比較其表達(dá)差異。

4.4.2 免疫組織化學(xué)染色 新鮮剝離的腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，6 μm連續(xù)切片10張，分別進(jìn)行HE染色及免疫組化染色。KrasⅠ抗工作液濃度為1∶100，以PBS代替第Ⅰ抗體作陰性對(duì)照，顯色劑為DAB。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 人胰腺癌BALB/c(nu/nu)小鼠皮下移植瘤成瘤時(shí)間及體積

接種細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞懸液體積明顯影響成瘤率及成瘤時(shí)間，5×106cells/100 μL PBS成瘤率低、成瘤時(shí)間長，1×107cells/100 μL PBS成瘤率有較大提高，但成瘤時(shí)間仍超過3周，以1×107cells/300 μLPBS接種成瘤效果最好，成瘤率達(dá)100%，成瘤時(shí)間短(＜2周)，見圖1、2和表1。3周時(shí)移植瘤肉眼可見潰瘍發(fā)生率為0%，而至5周時(shí)，則30%的移植瘤發(fā)生潰瘍，見圖3。

Figure 1.The subcutaneous PANC-1 xenograft model in BALB/c (nu/nu)mice.A:mice inoculated with PANC-1 cells (1×107cells/300 μL)for 2 weeks;B:the excised tumors after inoculated with PANC-1 cells(5×106cells/100 μL or 1×107cells/300 μL)for 3 weeks.圖1 不同接種條件建立的裸鼠移植瘤模型

Figure 2.The number of inoculated PANC-1 cells affected the volume of xenograft tumor.Mean±SD.n=20.*P＜0.05 vs 5×106cells.圖2 接種不同數(shù)量PANC-1細(xì)胞3周和5周后移植瘤體積的變化

表1 不同接種條件的成瘤率及成瘤時(shí)間Table 1.Tumor development after injection with different numbers of PANC-1 cells

Figure 3.The xenograft tumors tended to necrosis(ulcer，black arrow)as the inoculation time prolonged圖3 隨成瘤時(shí)間延長，移植瘤發(fā)生潰瘍?cè)龆?/p>

2 藥物在腫瘤組織中的分布

如圖4A所示，siCY5.5-NPs經(jīng)尾靜脈注射2 h后可清晰顯示出腫瘤形態(tài)，提示納米微粒在腫瘤區(qū)域聚集(紅色箭頭指示)，至6 h，肝臟攝取的納米微粒經(jīng)代謝有所減少(白色箭頭指示)，但腫瘤組織中的熒光信號(hào)未見明顯減弱，提示納米微粒被阻滯在腫瘤組織中。至24 h，活體熒光成像采集的熒光強(qiáng)度已明顯減弱，因此24 h為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，將荷瘤鼠安樂死，剖出腫瘤組織及重要器官(如心臟、肝臟、脾臟、腎臟)，用生理鹽水清洗去除血液后再次進(jìn)行熒光成像。如圖4B所示，離體熒光成像顯示腫瘤組織的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，經(jīng)肝臟及腎臟排泄，心臟及脾臟中基本沒有納米微粒滯留，與活體熒光呈像結(jié)果一致。腫瘤組織切片的激光共聚焦顯微鏡檢查進(jìn)一步證實(shí)了siCY5.5-NPs在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的分布，見圖4C。以上結(jié)果顯示，載siRNA NPs可靶向聚集在腫瘤組織并將siRNA輸送入腫瘤細(xì)胞。

3 藥物的體內(nèi)效應(yīng)

為了證實(shí)以納米載體導(dǎo)入的siRNA能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)出基因干擾效應(yīng)，3組荷瘤鼠(n=6)分別經(jīng)尾靜脈注射PBS(對(duì)照組)、SCR-NPs以及siKras-NPs。如圖5所示，siKras-NPs處理組腫瘤組織重量和Kras蛋白表達(dá)水平較PBS和SCR-NPs處理組均降低，而SCR-NPs處理組對(duì)Kras表達(dá)沒有影響。

Figure 4.The biodistribution of siCY5.5-NPs in mice after injection through tail veins.A:in vivo imaging of tumorbearing mice injected with siCY5.5-NPs;B:siCY5.5-NPs accumulated in different organs;C:siCY5.5-NPs were captured by tumor cells as observed under a laser scanning confocal microscope.The color bars(from red to blue)indicate the change of fluorescence intensity from high to low.圖4 尾靜脈注射siCY5.5-NPs不同時(shí)點(diǎn)荷瘤鼠體內(nèi)的分布

討論

PANC-1細(xì)胞株是最常用的人胰腺癌細(xì)胞株之一，基因表型為Kras、p53和p16基因突變，其生物學(xué)特性包括較強(qiáng)的黏附、轉(zhuǎn)移和侵襲能力;分泌較高水平的血管內(nèi)皮生長因子等［3］。但是，根據(jù)已有的實(shí)驗(yàn)報(bào)道，PANC-1皮下移植瘤成瘤時(shí)間大于6周［4］，甚至有長達(dá)4個(gè)月才成瘤者［5］。影響移植瘤成瘤的因素，除腫瘤細(xì)胞本身致瘤性強(qiáng)弱外，接種的細(xì)胞數(shù)量也是關(guān)鍵。我們的結(jié)果顯示不同接種細(xì)胞數(shù)量成瘤率及成瘤體積1×107細(xì)胞＞5×106細(xì)胞＞1×106細(xì)胞。此外，我們的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)用于接種的細(xì)胞懸液體積顯著影響成瘤時(shí)間。盡管1×107cells/100 μL與1×107cells/300 μL最終都可達(dá)到目標(biāo)腫瘤體積(100 mm3)，但后者所用時(shí)間明顯縮短，這可能是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)囊后w環(huán)境，為腫瘤細(xì)胞提供了生長空間，更有利于移植瘤的種植。成瘤時(shí)間是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的另一重要因素。實(shí)體瘤新生血管豐富，血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)、功能尚不完善，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙較寬，因此大分子物質(zhì)(如納米微粒)具有選擇性通過腫瘤組織血管內(nèi)皮并在腫瘤組織中滯留的特性，這種現(xiàn)象稱為“增強(qiáng)滲透和滯留效應(yīng)”(enhanced permeability and retention effect，EPR effect)［6］。納米微粒通過EPR效應(yīng)在腫瘤組織中聚集，稱為納米微粒對(duì)腫瘤的“被動(dòng)靶向性”。因此，移植瘤模型的血管密度、血管內(nèi)皮間隙是影響納米微粒在腫瘤組織中聚集的關(guān)鍵因素。研究表明，成瘤時(shí)間為3周以內(nèi)的血管密度最高，隨成瘤時(shí)間延長，移植瘤的新生血管密度下降［7］。另外，由于新生血管減少，當(dāng)成瘤大于6周時(shí)腫瘤組織容易發(fā)生壞死，影響藥效評(píng)價(jià)［7］。我們的結(jié)果也證實(shí)成瘤3周時(shí)無肉眼可見潰瘍發(fā)生，但延長至5周則30%的移植瘤發(fā)生潰瘍。因此，成瘤時(shí)間過長的移植瘤模型不適用于藥效評(píng)價(jià)及影像學(xué)成像等實(shí)驗(yàn)。

當(dāng)基因或藥物被納米載體輸送至腫瘤細(xì)胞，要獲得最大的基因沉默效應(yīng)或細(xì)胞毒作用，最關(guān)鍵的一點(diǎn)是基因或藥物能夠被帶入到每個(gè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)。臨床上，很難在早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌，而且對(duì)化療反應(yīng)性低下原因之一是胰腺癌周圍致密腫瘤基質(zhì)的保護(hù)作用。我們的結(jié)果證實(shí)，siRNA-NPs不僅能夠聚集在腫瘤組織(圖4B，腫瘤中心區(qū)域熒光最強(qiáng))，而且有效地進(jìn)入到了腫瘤細(xì)胞內(nèi)(圖4C)。蛋白印跡及免疫組化檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)納米載體攜帶的siRNAs在體內(nèi)有效地發(fā)揮靶基因沉默效應(yīng)。我們課題組利用此方法批量建立起來的胰腺癌皮下移植瘤模型，分別進(jìn)行了靶向納米砷劑抗胰腺癌的體內(nèi)研究，和納米砷聯(lián)合siRNA治療胰腺癌的體內(nèi)研究［2，8］。兩項(xiàng)研究均證實(shí)藥物或siRNA可較長時(shí)間地聚集在腫瘤部位，發(fā)揮抗瘤效應(yīng)。而另一實(shí)驗(yàn)則顯示參考此方法建立的胃癌模型對(duì)MRI影像對(duì)比劑有良好的反應(yīng)性［9］。

本研究結(jié)果顯示，人胰腺癌裸鼠移植瘤模型建立方法成瘤率達(dá)100%，而且短期內(nèi)即可成瘤，成瘤質(zhì)量好，是研究藥物示蹤、觀察療效的理想模型，增加結(jié)果的可信性與可重復(fù)性，為今后的研究打下基礎(chǔ)。

Figure 5.The in vivo effects of siRNA-NPs.A:seven days after treatment，the mice were sacrificed and the tumor weight was measured;B:Western blotting analysis of Kras expression in PANC-1 tumors;C:representative images of histopathological analysis of each dissected tumor tissue.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs SCR.圖5 載siRNA納米微粒的體內(nèi)效應(yīng)

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Establishment of human pancreatic tumor xenograft mouse model for evaluating tumor-homing and gene-silencing effects of siRNA-loading nanoparticles

ZENG Lin-juan，LI Jing-guo，ZHANG Qiu-bo，QIAN Chen-chen，LIN Zhong，CHEN Yinting，HUANG Kai-hong
(Department of Oncology，The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Zhuhai 519000，China.E-mail:chenyt58 @mail.sysu.edu.cn;huangkh@mail.sysu.edu.cn)

AIM:To establish an effective and rapid method to develop transplanted subcutaneous pancreatic carcinoma by inducing PANC-1 cells into nude mice，and then use this mouse model to evaluate the tumor-homing and gene-silencing effects of siRNA-loading nanoparticles in vivo.METHODS:Different numbers of PANC-1 cells in 100 μL or 300 μL PBS were inoculated subcutaneously into the right flank of BALB/c(nu/nu)mice.When the tumor volume reached 100 mm3，siRNACY5.5nanoparticles were injected through the mouse tail vein to perform in vivo imaging assay.Besides，the mice were randomly divided into 3 treatment groups treated with PBS，scrambled control RNA nanoparticles and siKras nanoparticles，respectively.The protein expression of Kras was detected by Western blotting and immunohistochemical staining.RESULTS:After inoculated with 1×107PANC-1 cells in 300 μL PBS，all mice developed tumors within 2 weeks.The in vivo results showed that siRNA-loading nanoparticles accumulated in the tumor tissues and exerted gene silencing effect.CONCLUSION:In the present study，an effective and rapid method was established for PANC-1 cells to induce transplanted subcutaneous pancreatic carcinoma in nude mice within 2 weeks，which is suitable for in vivo imaging and treatment evaluations as a reproducible and reliable way for the further experiments.

Pancreatic neoplasms;Models，animal;Nanoparticles;RNA interference

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.034

1000-4718(2014)03-0572-05

2013-10-16

2014-01-07

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81072045;No.81302140);廣東省產(chǎn)學(xué)研資助項(xiàng)目(No.2009B090300277);珠

海市科技計(jì)劃(No.2013D0401990026)

△通訊作者Tel:020-81332489;E-mail:陳茵婷chenyt58@mail.sysu.edu.cn;黃開紅huangkh@mail.sysu.edu.cn