王 潔， 陸克義， 周軍濤， 李險(xiǎn)峰△

(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，2核醫(yī)學(xué)科，3放療科，山西太原 030001)

X線照射增加大鼠心肌對(duì)缺血/再灌注損傷的敏感性*

王 潔1， 陸克義2， 周軍濤3， 李險(xiǎn)峰3△

(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，2核醫(yī)學(xué)科，3放療科，山西太原 030001)

目的：觀察胸部X線放射治療大鼠對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的敏感性。方法：用胸部單次照射X線20 Gy構(gòu)建放射性心臟損傷模型，采用完全隨機(jī)分組方法將Wistar大鼠分為假損傷組、損傷組、假損傷+假手術(shù)組、假損傷+缺血/再灌注組、損傷+假手術(shù)組和損傷+缺血/再灌注組，于創(chuàng)傷后2周行心肌缺血/再灌注。通過BL-410生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)記錄各組大鼠左心室發(fā)展壓(LVDP)、左心室壓力上升的最大速率(+dp/dtmax)和左心室壓力下降的最大速率(-dp/dtmax);采用ELISA方法檢測大鼠血清心肌肌鈣蛋白I(cTnI)和肌酸激酶同工酶(CK-MB);用BI2000圖像分析軟件測定心肌梗死面積占總面積的百分比。結(jié)果：損傷+缺血/再灌注組離體心功能明顯低于假損傷+缺血/再灌注組(P＜0.01)，損傷+缺血/再灌注組血清cTnI和CK-MB水平顯著高于假損傷+缺血/再灌注組(P＜0.01)，損傷+缺血/再灌注組心肌梗死面積顯著大于假損傷+缺血/再灌注組(P＜0.01)。結(jié)論：X線照射增加大鼠心肌對(duì)缺血/再灌注損傷的敏感性。

放射性心臟損傷;心肌缺血;再灌注損傷;敏感性

隨著三維適形、調(diào)強(qiáng)適形及圖像引導(dǎo)等精確放射治療技術(shù)的廣泛應(yīng)用，胸部腫瘤患者的生存時(shí)間明顯延長［1］，而在放射治療過程中位于縱膈的心臟不可避免地要受到射線影響。已有臨床資料顯示這部分患者心血管疾病的發(fā)病率和死亡率都明顯高于對(duì)照人群;據(jù)統(tǒng)計(jì)，由放療所導(dǎo)致的放射性心臟損傷(radiation-induced heart disease，RIHD)已成為非腫瘤死亡的首要原因［2］。X線照射可導(dǎo)致繼發(fā)性心臟損傷，臨床表現(xiàn)為冠狀動(dòng)脈疾病、心功能障礙，甚至出現(xiàn)充血性心力衰竭，從而抵消了腫瘤患者由放射治療產(chǎn)生的部分生存受益［3-4］。因此，在強(qiáng)調(diào)通過放射治療提高腫瘤患者生存率的同時(shí)，避免RIHD是提高這些患者療效和生存質(zhì)量的重要保證。然而，RIHD是由于X線照射直接損傷所致還是放射治療后心臟組織對(duì)不良刺激(如缺血/再灌注損傷)的敏感性增高所致還不清楚。為此，本文通過研究放射治療后心肌組織對(duì)缺血/再灌注損傷的反應(yīng)性，擬探討RIHD的可能機(jī)制，從而為臨床尋找放射治療所致RIHD的最佳預(yù)防及治療方案、進(jìn)而降低死亡率提供直接的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

材料和方法

1 動(dòng)物、主要試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循《中華人民共和國衛(wèi)生部令(第55號(hào))-醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》，以及《山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理細(xì)則》，并得到了山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)的批準(zhǔn)。健康雄性Wistar大鼠72只，體重200～250 g，清潔級(jí)。心肌肌鈣蛋白I (cardiac troponin I，cTnI)測定試劑盒(Burlingame);肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)測定試劑盒(上海玉蘭生物技術(shù)研究所);硝基四氮唑藍(lán)(nitroblue tetrazolium，NBT;Sigma);直線加速器(Varian IX);計(jì)算機(jī)生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)(BL-410);小動(dòng)物呼吸機(jī)(DH-150);注射用甲氧異腈［Cu (MIBI)4BF4］(北京師宏藥物研制中心);高锝［99Tcm］酸鈉注射液(原子高科股份有限公司); BHP6602小型γ相機(jī)(濱松光子股份有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠放射性心臟損傷模型的建立及分組 將大鼠按完全隨機(jī)分組方法分為 6組:假損傷組(sham)、損傷組(RIHD)、假損傷+假手術(shù)組(sham +NIR)、假損傷+缺血/再灌注組(sham+IR)、損傷+假手術(shù)組(RIHD+NIR)和損傷+缺血/再灌注組(RIHD+IR)，每組12只，6只用于離體心功能和血清學(xué)指標(biāo)測定，6只用于心肌梗死面積測定。RIHD模型制備:10%水合氯醛麻醉，仰臥位固定，行螺旋CT定位心臟，采用Varian IX直線加速器局部照射，采用前、后、左、右4個(gè)野照射，按生物效應(yīng)劑量(biological effective dose，BED)公式將臨床常規(guī)分割照射劑量(80 Gy)換算為單次照射劑量約為20 Gy，單次照射源靶距100 mm。

2.2 心肌缺血/再灌注模型的制備 大鼠在X線照射后2周行心臟缺血/再灌注。Wistar大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，仰臥位，于頸部至劍突去毛切開皮膚，鈍性分離氣管，連接麻醉呼吸機(jī)，開胸后進(jìn)行輔助呼吸，吸氣∶呼氣比為1∶2。于胸骨左緣第一肋間開胸暴露心臟，輕壓擠出心臟，剪開心包膜，在左心耳下方以心臟表面左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，用6/0號(hào)細(xì)線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支中上部，迅速將心臟放回胸腔。心肌缺血30 min后，松開結(jié)扎細(xì)線恢復(fù)血供，心肌再灌注3 h。術(shù)前、缺血后及再灌注后各記錄心電圖1次，以缺血后ST段抬高作為心肌缺血造模成功的標(biāo)志。假手術(shù)組僅穿線而未結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。

2.3 Langendorff離體心臟灌流 猛擊大鼠后枕部致昏，迅速開胸取出心臟，放入預(yù)冷的Krebs-Henseleit液(K-H液)中，修剪后將主動(dòng)脈懸掛于Langendorff灌流裝置上，用充以95%O2與5%CO2混合氣體的 K-H液灌流。K-H液的成分為:118 mmol/L NaCl，4.75 mmol/L KCl，1.19 mmol/L KH2PO4，1.19 mmol/L MgSO4·7H2O，2.54 mmol/L CaCl2·2H2O，25 mmol/L NaHCO3，0.5 mmol/L EDTA，11 mmol/L glucose(pH 7.4，37℃)。將起搏電極置于離體心臟右室，刺激強(qiáng)度設(shè)置為2倍閾強(qiáng)度，頻率為200 beats/min。將一乳膠水囊(直徑約3～5 mm)經(jīng)左心房插入左心室內(nèi)，水囊內(nèi)充有一定量的灌流液，水囊導(dǎo)管另一端與壓力換能器相連，穩(wěn)定15～20 min后采用BL-410生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)記錄大鼠左室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)、左室壓力升高最大速率(+dp/dtmax)及左室壓力下降最大速率(-dp/dtmax)。

2.4 ［99Tcm］-MIBI制備與心肌顯像 取甲氧異腈凍干品1瓶，在無菌操作條件下，依高锝［99Tcm］酸鈉注射液的放射性濃度，取2～6 mL(370～3 700 MBq)注入瓶內(nèi)，充分振搖，使凍干品溶解后立于沸水浴中直立加熱 10～15 min，取出冷卻至室溫，得到［99Tcm］-MIBI。?。?9Tcm］-MIBI 18.5 MBq，經(jīng)大鼠尾靜脈緩慢推注，30 min后采集前位平面顯像，采集儀器為BHP6602小型γ相機(jī)，探頭配置低能高分辨針孔準(zhǔn)直器，能峰為140 keV，窗寬20%，矩陣256× 256×16，計(jì)數(shù)預(yù)置500K。應(yīng)用感興趣區(qū)(regions of interest，ROI)技術(shù)勾畫心臟及上縱隔區(qū)域，得到其平均計(jì)數(shù)，應(yīng)用心臟/縱隔比值半定量分析心臟的［99Tcm］-MIBI攝取值。

2.5 血清學(xué)指標(biāo)檢測 各組大鼠于造模后3 h，麻醉狀態(tài)下從腹主動(dòng)脈取血3 mL，將血液常溫靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，取上清液放入-20℃冰箱待測。參照試劑盒說明操作，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定cTnI和CK-MB。

2.6 心肌梗死面積測定 采用硝基四氮唑藍(lán)染色法測定心肌梗死面積。缺血/再灌注后3 h，于麻醉下迅速取心臟，放入生理鹽水中沖洗，仔細(xì)去除左心室外其它部分(兩側(cè)心房、大靜脈及右心室)，-80℃凍存。取出-80℃凍存的心臟，垂直于左心室長軸方向，自心底向心尖將其切成厚度均勻的6片，放入1%的三羥甲基氨基甲烷溶液(pH 7.4)中，37℃水浴5～10 min。正常左室心肌染為暗藍(lán)色，梗死區(qū)心肌則不染色。用BI2000圖像分析軟件測定心肌梗死面積占總面積的百分比，即梗死面積百分比=心肌梗死面積之和/心肌總面積之和×100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 RIHD后2周大鼠心?。?9Tcm］-MIBI攝取的變化

RIHD后2周損傷組心?。?9Tcm］-MIBI攝取明顯減低(1.96±0.13 vs 1.68±0.19，P＜0.05)，這提示RIHD后2周大鼠心肌血流灌注及線粒體功能降低，見圖1。

Figure 1.Changes of［99Tcm］-MIBI uptake in the myocardium 2 weeks after RIHD.H:heart;M:upper mediastinum.A:sham;B:RIHD.圖1 RIHD后2周心肌［99Tcm］-MIBI攝取的變化

2 缺血/再灌注后大鼠離體心功能的變化

LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax指標(biāo)在sham組、RIHD組、sham+NIR組及RIHD+NIR組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。這提示X射線損傷和(或)假手術(shù)不影響LVDP、+dp/dtmax和-dp/ dtmax的變化。sham+IR組LVDP、+dp/dtmax和-dp/ dtmax明顯低于sham+NIR組(P＜0.01);RIHD+IR組LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯低于sham+IR組(P＜0.01)，見表1。這提示RIHD后2周行缺血/再灌注大鼠LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低更明顯。

表1 各組大鼠心功能參數(shù)的比較Table 1.The parameters of cardiac functions in the rats with different treatments(Mean±SD.n=6)

3 缺血/再灌注后大鼠血清cTnI和CK-MB水平變化

RIHD+NIR組cTnI和CK-MB水平高于sham+ NIR組(P＜0.05);sham+IR組cTnI和CK-MB水平明顯高于sham+NIR組(P＜0.01);RIHD+IR組cTnI和CK-MB水平明顯高于sham+NIR組(P＜0.01)，見表2。這提示RIHD后2周行缺血/再灌注術(shù)大鼠cTnI和CK-MB水平升高更顯著。

表2 各組血清cTnI和CK-MB的比較Table 2.The concentrations of cTnI and CK-MB in the rats with different treatments(μg/L.Mean±SD.n=6)

4 缺血/再灌注后大鼠心肌梗死面積的影響

硝基四氮唑藍(lán)染色正常心肌為暗藍(lán)色，梗死區(qū)心肌為紅色。Sham+NIR組與RIHD組心肌梗死面積比較無顯著差異(P＞0.05);sham+IR組和RIHD +IR組明顯高于sham+NIR組(P＜0.01);RIHD+ IR組心肌梗死面積明顯高于 sham+IR組(P＜0.01)，見圖2。這提示RIHD后2周行缺血/再灌注術(shù)心肌梗死面積明顯增大。

討論

Figure 2.The infarct volume of the myocardium in the rats with different treatments(NBT staining).A:sham+NIR; B:RIHD;C:sham+IR;D:RIHD+IR.Mean± SD.n=6.##P＜0.01 vs sham+NIR group;＊＊P＜0.01 vs sham+IR group.圖2 各組心肌梗死的NBT染色

胸部腫瘤發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重威脅人類的健康。放射治療在胸部腫瘤的治療中占有重要地位，而X線照射所導(dǎo)致的心血管疾病的發(fā)病率和死亡率都明顯高于對(duì)照人群［5］。因此，在強(qiáng)調(diào)通過放射治療提高腫瘤患者生存率的同時(shí)，避免RIHD是提高這些患者療效和生存質(zhì)量的重要保證。胸部X射線照射首先損傷心臟的微循環(huán)系統(tǒng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能和結(jié)構(gòu)損傷，形成粥樣斑塊，繼而發(fā)生血管內(nèi)腔狹窄或閉塞，出現(xiàn)微循環(huán)障礙而發(fā)生心肌缺血、缺氧，進(jìn)而累及心肌細(xì)胞，引起心肌細(xì)胞死亡，并最終導(dǎo)致心功能損傷［5］，在臨床上可表現(xiàn)為冠心病、急性心衰等。

本實(shí)驗(yàn)參照Kuse等［6］提出的RIHD模型制備方法，給予實(shí)驗(yàn)大鼠心臟單次局部照射劑量20 Gy，采用［99Tcm］-MIBI心肌顯像來評(píng)價(jià)心肌的血流量和線粒體功能。［99Tcm］-MIBI是臨床上早期診斷冠心病、心肌缺血的常用檢查方法［7-8］，當(dāng)線粒體膜電位正常時(shí)，［99Tcm］-MIBI可通過被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入線粒體膜，而當(dāng)線粒體膜電位下降時(shí)，心肌對(duì)［99Tcm］-MIBI攝取障礙。由于在整體情況下，機(jī)體會(huì)通過神經(jīng)體液調(diào)節(jié)維持重要器官功能的穩(wěn)定性，為排除神經(jīng)體液的影響，我們檢測了創(chuàng)傷后大鼠的離體心功能，其能客觀反映損傷后心臟早期的實(shí)際變化，常用LVDP及±dp/dtmax等指標(biāo)來衡量左室收縮功能，其中+dp/ dtmax反映心肌纖維收縮性能的改變;-dp/dtmax是反映心肌舒張性能的指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2周后大鼠心臟出現(xiàn)線粒體功能損傷，而心臟離體心功能的未出現(xiàn)異常。

RIHD常處于亞臨床狀態(tài)，經(jīng)過相當(dāng)長的潛伏期才出現(xiàn)臨床癥狀，多在放射治療后數(shù)月至數(shù)年，常表現(xiàn)為心包滲出、冠狀動(dòng)脈疾病、心瓣膜功能不全、傳導(dǎo)異常和充血性心衰等［9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與假損傷組比較，損傷后2周大鼠的心肌線粒體功能已發(fā)生改變，而離體心功能并無明顯改變，而線粒體功能受損后是否會(huì)引起心臟對(duì)損傷的敏感性增加尚不清楚。因此，我們選取大鼠RIHD后2周作為缺血/再灌注處理的時(shí)點(diǎn)，采用經(jīng)典的結(jié)扎冠狀動(dòng)脈建立缺血/再灌注模型，觀察心肌損傷的情況。目前，臨床上將cTnI特異性和CK-MB敏感性結(jié)合起來作為判斷心肌細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)［10］。組織解剖學(xué)上心肌梗死面積是觀察心肌損傷的直接指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)RIHD模型大鼠進(jìn)行缺血/再灌注處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)損傷+缺血/再灌注組大鼠與假損傷+缺血/再灌注組、損傷+假手術(shù)組比較，離體心功能明顯下降，血清cTnI和CK-MB顯著升高，心肌梗死面積明顯增大。這些結(jié)果提示，X線照射損傷增加了大鼠心肌對(duì)缺血/再灌注損傷的敏感性。然而具體機(jī)制還不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

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X-ray irradiation increases sensitivity of myocardium to ischemia/reperfusion injury in rats

WANG Jie1，LU Ke-yi2，ZHOU Jun-tao3，LI Xian-feng3
(1Department of Neurology，2Department of Nuclear Medicine，3Department of Radiotherapy，F(xiàn)irst Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China.E-mail:lixianfeng-lxf@263.net)

AIM:To observe the sensitivity of myocardium to ischemia/reperfusion(I/R)injury in the rats with chest radiotherapy.METHODS:The radiation-induced heart disease model was established by local 20 Gy of X-ray irradiation in the chest.Male Wistar rats(n=42)were randomly divided into 6 groups:sham trauma group，trauma group，sham trauma+sham operation group，sham trauma+I/R group，trauma+sham operation group and trauma+I/R group.The rats were subjected to 30 min of ischemia and 1 h of reperfusion 2 week after trauma.The left ventricular developed pressure(LVDP)and±dp/dtmaxwere recorded by BL-410 biological signal recording and analysis system.The serum cardiac troponin I(cTnI)and creatine kinase isoenzyme(CK-MB)were measured by ELISA.The myocardial infarct size was determined by nitroblue tetrazolium(NBT)staining method and BI2000 image analysis software.RESULTS:Compared with sham trauma+I/R group，significant decreases in LVDP and±dp/dtmaxwere observed in trauma+I/R group(P＜0.01)with significant increases in the infarct size and the concentrations of cTnI and CK-MB(P＜0.01).CONCLUSION:Chest X-ray irradiation increases the sensitivity of myocardium to I/R injury in rats.

Radiation-induced heart disease;Myocardial ischemia;Reperfusion injury;Sensitivity

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.007

1000-4718(2014)03-0419-04

2013-10-14

2014-01-16

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81371600);山西醫(yī)科大學(xué)科技創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(No.057279);山西醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(No.055217)

△通訊作者Tel:0351-4639351;E-mail:lixianfeng-lxf@263.net