劉 平，邢亞閣，張曉鳴，黃 湛

(1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039;2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122)

目前，國內(nèi)外對(duì)MRPs中非揮發(fā)性化合物的研究，主要是針對(duì)氨基酸－還原糖模式體系，研究集中于初級(jí)階段的產(chǎn)物或高級(jí)階段產(chǎn)物中低分子量的有色組分的分離［1］。而對(duì)肽－還原糖體系中MRPs的研究較少，主要研究的是單純二肽或三肽模型體系的反應(yīng)活性、揮發(fā)性化合物和抗氧化性［2－3］，而對(duì)肽與氨基酸體系中所形成的非揮發(fā)性化合物的研究較少。一方面是由于美拉德反應(yīng)的復(fù)雜性，另一方面由于大部分非揮發(fā)性MRPs的極性極強(qiáng)，且很多結(jié)構(gòu)中沒有發(fā)色團(tuán)，很難通過傳統(tǒng)的液相色譜－紫外聯(lián)用手段來檢測(cè)。雖然采用紫外檢測(cè)器檢測(cè)MRPs有一定的缺陷，但受目前條件和技術(shù)所限，國際上對(duì)MRPs中非揮發(fā)性成分的研究仍采用此法，許多報(bào)道［4－5］仍采用配備紫外檢測(cè)器或(和)熒光檢測(cè)器的液相色譜進(jìn)行分離檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合LC－MS/MS進(jìn)行分析。

Ogasawara等［6］通過二次超濾法利用 1000～5000u大豆肽制備的1000～5000u美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(即美拉德肽)具有良好的風(fēng)味增強(qiáng)效果。但二次超濾成本較高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

本研究以二甘肽－木糖美拉德模式反應(yīng)體系，通過凝膠色譜及高效液相色譜分離其MRPs，并結(jié)合LC－MS及LC－MS/MS技術(shù)進(jìn)行分析，并通過同位素示蹤法驗(yàn)證糖肽交聯(lián)產(chǎn)物的形成，以期為肽－糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(尤其是美拉德肽)的有效制備提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

二甘肽(diglycine，分子量132.12)上海億欣生物科技有限公司;D－木糖 中國惠興生化試劑有限公司;［13C5］－木糖 Omicron Biochemicals Inc，美國;葡聚糖凝膠G－10 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他化學(xué)試劑均為分析級(jí)。

玻璃層析柱(1.6×100cm) 上海廈美生化科技發(fā)展有限公司;SunfireTM C18柱(5μm，4.6×150mm) 美國 Waters公司;Ultimate? AQ－C18色譜柱(5μm，4.6×250mm)月旭材料科技(上海)有限公司;XBridge HILIC Hillic色譜柱(5μm，4.6×250mm)美國Waters公司;Atlantis T3柱(5μm，10×150mm)美國Waters公司。

HD－3紫外檢測(cè)儀 上海青浦滬西分析儀器廠;恒流泵 上海青浦滬西儀器廠;XWT－S小型臺(tái)式記錄儀 上海儀表儀器廠;DBS－100電腦全自動(dòng)部分收集器 青浦滬西分析儀器廠;TG16－WS臺(tái)式高速離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;F－7000熒光分光光度計(jì)日立公司;液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI SYNAPT Q－TOF MS)美國Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 美拉德反應(yīng) 將1.0g二甘肽與0.3g木糖溶于9mL去離子水中，混合均勻，用6N NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，定容至10mL，使混合溶液的最終濃度達(dá)到11.5%。每次取1mL混合液于反應(yīng)瓶中，密封，在120℃下反應(yīng)30、60、90和120min，反應(yīng)結(jié)束后迅速采用冰水冷卻，反應(yīng)液于4℃下存放用于分析測(cè)定。

1.2.2 熒光強(qiáng)度的測(cè)定 根據(jù)Morales等［7］的方法稍作修改，將美拉德反應(yīng)液稀釋50倍，取200μL樣品加入2.3mL pH8.5 0.2moL/L硼酸鹽緩沖液，混勻，在347nm激發(fā)波長下進(jìn)行發(fā)射波長掃描，同時(shí)以去離子水作空白。

1.2.3 分子量分布的測(cè)定 參考Liu等［8］方法。

1.2.4 MRPs的分離純化方法

1.2.4.1 葡聚糖凝膠柱色譜分離 將二甘肽－木糖MRPs混合液在10000r/min離心10min，取出上清液，并配制成 50mg/mL的溶液，取 2mL樣品上Sephadex G－10色譜柱分離，洗脫液為過0.45μm微孔濾膜的去離子水，以30mL/h的流速洗脫，用紫外檢測(cè)儀在220nm下檢測(cè)，收集峰Ⅰ，減壓濃縮后冷凍干燥。

1.2.4.2 HPLC色譜柱的選擇及分離 將Sephadex G－10收集到的峰Ⅰ組分，選用不同類型的色譜柱進(jìn)行分離，分離條件如下:

Sunfire色譜柱:進(jìn)樣體積5μL;流速1mL/min;柱溫35℃;檢測(cè)波長，220nm;梯度洗脫條件:0～10min，5～30%B;10～25min，30%～85%B;25～35min，85%～100%B;35～40min，100%B(其中 A:含0.1%TFA的水溶液，B:含0.1%TFA的乙腈溶液)。

Hillic色譜柱:進(jìn)樣體積5μL;流速1mL/min;柱溫35℃;檢測(cè)波長220nm;梯度洗脫條件:0～10min，100～30%B;10～25min，30%～0%B(其中 A:50/50乙腈/10mmoL/L醋酸銨，pH9;B:95/5乙腈/10mmoL/L 醋酸銨，pH9)。

Ultimate? AQ－C18色譜柱:進(jìn)樣體積5μL;流速1mL/min;柱溫35℃;檢測(cè)波長220nm;梯度洗脫條件:0～20min，10～80%B(其中 A:含 0.1%TFA 的水溶液;B:含0.1%TFA的乙腈溶液)。

Atlantis色譜柱:進(jìn)樣體積5μL;流速1mL/min;柱溫 35℃;檢測(cè)波長 220nm;梯度洗脫條件:0～12min，2～16%B;12～20min，16～70%B;20～35min，70～100%B(其中 A:含0.1%TFA 的水溶液;B:含0.1%TFA的乙腈溶液)。

1.2.5 LC－MS及 LC－MS/MS分析 儀器名稱:Waters Synapt MALDI Q－TOF MS(USA)。

液相色譜條件:儀器 Waters ACQUITY UPLC;BEH C－18色譜柱(1.7μm，2.1mm ×100mm);紫外檢測(cè)器:檢測(cè)波長范圍200～400nm。進(jìn)樣體積:2μL，流速0.3mL/min。流動(dòng)相:A:5%乙腈(含0.1%TFA)，B:60%乙腈(含0.1%TFA)。梯度洗脫條件:0～5min，20%～30%B;5～10min，30% ～50%B;10～15min，50%～100%B。

質(zhì)譜條件:離子源:ESI;離子模式:正離子;毛細(xì)管電壓:3.5kV;錐孔電壓:30V;離子源溫度:100℃;脫溶劑氣溫度:400℃;錐孔反吹氣流量:50L/Hr;脫溶劑氣流量:500L/Hr;質(zhì)量掃描范圍:50～1000m/z;碰撞電壓:6.0～20eV，數(shù)據(jù)采用MassLynxs 4.0軟件分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光強(qiáng)度的變化

美拉德反應(yīng)過程中熒光性物質(zhì)的形成符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。MRPs具有典型的熒光波譜特征，激發(fā)波長為 340～370nm 和發(fā)射波長為 420～440nm［9－10］。通過熒光強(qiáng)度的變化，可分析MRPs中新物質(zhì)的生成情況。二甘肽－木糖體系在不同反應(yīng)時(shí)間下的MRPs在激發(fā)波長347nm下的熒光強(qiáng)度如圖1所示。

圖1 二甘肽－木糖MRPs的熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.1 Changes in fluorescence intensity of MRPs from diglycine－xylose systems as a function of time

由圖1可知，美拉德反應(yīng)開始前，體系中只有糖和肽時(shí)，肽在發(fā)射波長347nm處時(shí)有最大熒光強(qiáng)度。隨著加熱時(shí)間的延長，產(chǎn)物中肽的最大熒光強(qiáng)度值逐漸減小，同時(shí)有一新的峰生成，其在430nm處有最大熒光強(qiáng)度。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，產(chǎn)物熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，這個(gè)現(xiàn)象與Morales等［7］的研究結(jié)果類似。通常熒光強(qiáng)度是衡量蛋白質(zhì)糖苷化產(chǎn)物和熒光性反應(yīng)產(chǎn)物生成量的指示劑。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肽糖的交聯(lián)物也有此熒光性特征。由此說明，在美拉德反應(yīng)中，肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，產(chǎn)物中有新的物質(zhì)生成，這些新的物質(zhì)包括糖肽的交聯(lián)產(chǎn)物等。Baisier等［11］猜測(cè)熒光性化合物的積累來源于氨基化合物的Strecker降解或中間產(chǎn)物中活性還原性化合物的進(jìn)一步反應(yīng)形成的。熒光性物質(zhì)和有色化合物的關(guān)系目前還不完全清楚，熒光性化合物通常被認(rèn)為是有色物質(zhì)形成的前體物。

2.2 分子量分布分析

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)小肽與木糖在美拉德反應(yīng)中的交聯(lián)作用，采用凝膠液相色譜對(duì)二甘肽－木糖各體系在120℃下反應(yīng)120min的產(chǎn)物的分子量分布進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 二甘肽－木糖MRPs的分子量分布圖Fig.2 Distribution of molecular weight of MRPs derived from diglycine－xylose system

由圖2可知，在二甘肽－木糖體系中，相對(duì)分子質(zhì)量700～5000的產(chǎn)物相對(duì)百分含量占1.86%，500～700產(chǎn)物占3.16%，180～500產(chǎn)物之間的占46.27%。由此可知，小肽與還原糖在高溫下反應(yīng)可形成較高分子量的 MRPs。Kim 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在100℃ 下加熱甘氨酸/二甘肽/三甘肽－葡萄糖體系，各體系中大分子物質(zhì)的比例隨著加熱時(shí)間的延長也顯著增加。Clark等［13］研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)骨架與糖通過聚合形成含高分子量的化合物。

2.3 二甘肽－木糖體系MRPs的分離分析

2.3.1 葡聚糖凝膠柱色譜的分離 葡聚糖凝膠是根據(jù)分子量差異進(jìn)行分離的一種技術(shù)，是蛋白質(zhì)和肽等化合物分離中常用的分離手段，近年來的研究將其用于MRPs中不同分子量組分的分離［14］。由于二甘肽—木糖MRPs中分子量幾乎都是相對(duì)分子質(zhì)量小于700的組分，因此選用葡聚糖凝膠G－10對(duì)此體系120min的產(chǎn)物進(jìn)行初步分離，結(jié)果如圖3所示。從圖3可知，經(jīng)葡聚糖凝膠G－10分離后，可得到三個(gè)組分，組分Ⅰ和組分Ⅱ是有色物質(zhì)，組分Ⅲ是無色物質(zhì)。其中，組分Ⅰ中分子量分布較大的產(chǎn)物的比例相對(duì)較高，因此收集該組分并進(jìn)行進(jìn)一步的分離。

圖3 凝膠過濾色譜G－10分離二甘肽－木糖MRPs在220nm下的圖譜Fig.3 UV－vis spectrum at 220nm of MRPs derived from diglycine－xylose system purified by Sephadex G－10

2.3.2 液相色譜柱的篩選 根據(jù)MRPs具有較強(qiáng)的極性特性，選用 Sunfire、Hillic、Ultimate和 Atlantis T3色譜柱對(duì)葡聚糖凝膠G－10中收集到的組分Ⅰ進(jìn)行分離，經(jīng)分離條件初步優(yōu)化后，在各柱較好的分離條件下的分離結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，經(jīng)Sunfire、Hillic和Ultimate色譜柱分離后，出現(xiàn)的峰較少，分離效果較差，表明該三種色譜柱不適合二肽－木糖高溫MRPs的分離。相比之下，采用Atlantis T3色譜柱分離后，分離效果較好，色譜圖中出現(xiàn)的峰較多，表明該柱子較適合該類產(chǎn)物的分離。因此，選用 Atlantis T3色譜柱對(duì)二甘肽－木糖的MRPs進(jìn)行分離。

2.3.3 Atlantis T3色譜柱對(duì)二甘肽－木糖MRPs的分離 對(duì)葡聚糖凝膠G－10中分離得到的組分Ⅰ采用Atlantis T3色譜柱進(jìn)行分離，經(jīng)分離條件優(yōu)化后，得到的最佳條件下的分離結(jié)果如圖5所示。

如圖5所示，圖譜中出現(xiàn)六個(gè)峰，各峰經(jīng)液質(zhì)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，各峰中仍含有多種化合物，峰Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ中檢測(cè)到的主要是質(zhì)荷比較小的物質(zhì)，而峰Ⅴ中的既有質(zhì)荷比較小的物質(zhì)也有較大的物質(zhì)，因此集中收集峰Ⅴ，并采用液相色譜對(duì)其進(jìn)一步分離。

2.3.4 二次液相色譜的分離 對(duì)第一次液相色譜分離收集到的峰Ⅴ組分，仍采用液相色譜進(jìn)行二次分離，經(jīng)液相色譜柱的進(jìn)一步篩選后，發(fā)現(xiàn)Atlantis T3色譜柱分離效果較好，因此仍采用此柱繼續(xù)分離，結(jié)果如圖6所示。

由圖6發(fā)現(xiàn)，經(jīng)第二次液相色譜分離，圖譜中出現(xiàn)8個(gè)峰，表明待分離組分在Atlantis T3色譜柱上被較好的分離，將收集到的8個(gè)組分進(jìn)一步采用LC－MS技術(shù)進(jìn)行分析。

2.3.5 LC－MS分析 通過選擇合適的電噴霧電壓、碰撞能量等質(zhì)譜分析條件，并在正、負(fù)離子兩種掃描方式下分別對(duì)二次HPLC技術(shù)分離得到的8個(gè)組分進(jìn)行一級(jí)全掃描質(zhì)譜分析，得到分子離子峰，該美拉德在正離子下信號(hào)相應(yīng)值較高。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各峰的一級(jí)質(zhì)譜中仍含有多個(gè)離子峰，其中峰Ⅱ中有離子峰較大的組分，其它組分中的離子峰均較小，因此著重對(duì)峰Ⅱ進(jìn)行研究，其紫外圖譜和總離子流圖譜如圖7所示。

圖4 不同液相色譜柱的分離效果圖Fig.4 HPLC spectrums from different columns

由圖7所示，紫外圖上顯示有兩個(gè)主要的峰，在4min以前化合物基本上從色譜柱上洗脫下來。與紫外圖譜上的兩個(gè)峰上的保留時(shí)間對(duì)應(yīng)，在總離子流圖上在4min以前也基本有兩個(gè)峰。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，第一個(gè)峰中各化合物的分子離子峰基本上均不超過m/z 379，第二個(gè)峰中各化合物的分子離子峰m/z較小，主要是低于300的離子峰。在二甘肽－木糖美拉德反應(yīng)體系中，盡管分子量分布測(cè)出MRPs中相對(duì)分子質(zhì)量超過500以上的產(chǎn)物比例超過5%，而通過質(zhì)譜并未檢測(cè)出這段分子量所對(duì)應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)荷比，這種現(xiàn)象可能是由于該體系中高分子量的MRPs在質(zhì)譜上的信號(hào)較弱所致［15－16］。

2.3.6 LC－MS/MS分析 為了進(jìn)一步分析糖肽交聯(lián)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，采用二甘肽－［13C5］－木糖體系作對(duì)照反應(yīng)。在對(duì)照體系所形成的MRPs中，相同保留時(shí)間下LC－MS圖譜中未觀察到分子離子峰為m/z 379，而檢測(cè)出一新的分子離子峰m/z 389，推測(cè)m/z 389和m/z 379所對(duì)應(yīng)的MRPs實(shí)為同位素標(biāo)記和未標(biāo)記的結(jié)構(gòu)相同的化合物。對(duì)分子離子峰m/z 379和m/z 389采用LC－MS/MS技術(shù)進(jìn)行分析，所得的二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果如圖8所示。

圖5 二甘肽－木糖MRPs經(jīng)Atlantis T3色譜柱分離的液相色譜圖Fig.5 HPLC spectrum of MRPs derived from diglycine－xylosel system purified by Atlantis T3 column

圖6 二甘肽－木糖體系MRPs經(jīng)Atlantis T3色譜柱二次分離的液相色譜圖Fig.6 The second HPLC spectrum of MRPs derived from diglycine－xylose system purified by Atlantis T3 column

圖7 峰Ⅱ的紫外圖譜(a)和總離子流圖(b)Fig.7 UV and total ion currency(TIC)profiles of peakⅡ by LC－MS

圖8 分子離子峰m/z 379和m/z 389的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.8 LC－MS/MS profile of molecular ion peak m/z=379 and m/z 389

由圖8a中的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)可知，在二甘肽－木糖體系所形成的MRPs中，m/z 379為分子離子峰，m/z 361、343、221和133是其裂解產(chǎn)生的碎片離子峰。由分子離子峰m/z 379及其碎片離子峰可推測(cè)，分子離子峰m/z 379經(jīng)連續(xù)2次脫水分別形成碎片離子峰m/z 361和m/z 343，后者進(jìn)一步斷裂成碎片離子峰m/z 211和m/z 133。

由圖8b可知，在二甘肽－［13C5］－木糖對(duì)照體系所形成的MRPs中，m/z 389為分子離子峰，其裂解產(chǎn)生的碎片離子峰有 m/z 371、353、221和133。由此可知，分子離子峰m/z 379和m/z 389有相同的特征片段m/z 133，其余對(duì)應(yīng)的碎片離子峰在m/z上相差10，進(jìn)一步驗(yàn)證m/z 379和m/z 389可能為結(jié)構(gòu)相同的物質(zhì)，m/z的差異主要是由于后者反應(yīng)底物為同位素標(biāo)記的［13C5］－木糖產(chǎn)生的。由此可初步推測(cè)，分子離子峰m/z 379所對(duì)應(yīng)的化合物所含有的碳原子中有10個(gè)來源于木糖或木糖的降解產(chǎn)物，除碎片m/z 133外其余的碎片均為含糖碎片。

3 結(jié)論

肽與還原糖經(jīng)高溫美拉德反應(yīng)后，產(chǎn)物變得極為復(fù)雜，分離困難，直接獲得糖肽單一的MRPs難度較大，通過同位素示蹤法初步推斷美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的形成及結(jié)構(gòu)是一種較好的選擇。除了形成揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)外，小肽在高溫下與還原糖或其降解產(chǎn)物可形成較大分子量的交聯(lián)產(chǎn)物。由此推測(cè)，可通過一定分子量的肽開發(fā)具有風(fēng)味增強(qiáng)特性的美拉德肽(1000～5000u MRPs)。

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