李露青，李 雙，王春芳，洪夢蓉，方科益，陳樹兵?，曹國洲，韓 超，王傳現(xiàn)

(1．寧波海關(guān)技術(shù)中心,寧波315040; 2．寧波中盛產(chǎn)品檢測有限公司,寧波315040;3．浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院,杭州310015; 4．上海海關(guān) 動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,上海200135)

食品中工業(yè)染料的超量和超種類濫用是目前食品安全面臨的重大問題之一。工業(yè)染料因色彩鮮亮,不易褪色且價(jià)格低廉等特點(diǎn)而被不法商販青睞[1]。工業(yè)染料不僅不能為人體提供營養(yǎng)物質(zhì),反而會危害身體健康,甚至誘發(fā)癌變,在食品中違法添加工業(yè)染料是國家嚴(yán)厲打擊的行為[2-4]。高效液相色譜法(HPLC)、超高效液相色譜法(UPLC)和液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法是目前工業(yè)染料的主流分析方法[1,5-13]。食品中工業(yè)染料分子離子峰的準(zhǔn)確確定是保證待測化合物被準(zhǔn)確篩查的重要前提,但是關(guān)于不同種類工業(yè)染料離子化規(guī)律和分子離子峰的存在形式的研究較少。其中,液相色譜法不僅難以滿足復(fù)雜食品基質(zhì)中低限量檢測要求,還不能提供任何目標(biāo)物的質(zhì)量信息,極易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。質(zhì)譜分析可提供豐富的結(jié)構(gòu)信息,同時(shí)具備高特異性和高靈敏度,通過二級碎片離子可實(shí)現(xiàn)已知化合物的準(zhǔn)確定性,隨著質(zhì)譜儀的發(fā)展和推廣,一次分析檢測完成多個(gè)或多類目標(biāo)物的分析已成為可能,對工業(yè)染料進(jìn)行的檢測也逐漸由用三重四極桿質(zhì)譜的目標(biāo)型檢測向用高分辨質(zhì)譜(HRMS)的精確質(zhì)量非目標(biāo)型全掃描檢測轉(zhuǎn)變[14-15]。全掃描高分辨質(zhì)譜儀與常規(guī)三重四極桿質(zhì)譜儀的區(qū)別在于,它不需要已知待測化合物的特征離子碎片,而是直接采用高分辨率(在m/z200時(shí),分辨率不小于70 000)和高準(zhǔn)確度質(zhì)量數(shù)(質(zhì)量數(shù)誤差不大于1×10－6)對待測樣品進(jìn)行定向或非定向掃描,大大降低了共洗脫的相似質(zhì)量數(shù)的干擾,極大地避免了假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。

本工作采用四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀對92種工業(yè)染料的離子化規(guī)律進(jìn)行了研究,為工業(yè)染料的快速鑒定提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Q-Exactive型四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀,配電噴霧離子(ESI)源;Milli-Q 型超純水發(fā)生器。

標(biāo)準(zhǔn)溶液:10 mg·L－1,分別稱取適量92種工業(yè)染料標(biāo)準(zhǔn)品,用含5 mmol·L－1甲酸銨的乙腈溶液稀釋成10 mg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃避光保存。其中,蘇丹紅Ⅳ用二氯甲烷溶解,乙腈定容;其余31種酸性染料用水溶解,乙腈定容。

92種工業(yè)染料純度不小于95%;乙腈、甲酸銨和二氯甲烷均為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水(18．2 MΩ·cm)。

1．2 儀器工作條件

在樣品運(yùn)行前先對儀器分別進(jìn)行正/負(fù)離子校正;正/負(fù)離子轉(zhuǎn)換模式;一級全掃描范圍:m/z50～800;分辨率70 000(m/z200),自動增益控制(AGC)目標(biāo)值5×105;離子源電壓為2 700 V(ESI－)和3 500 V(ESI＋);碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)能量為10～50 e V;離子傳輸管溫度為300 ℃;鞘氣為氮?dú)?壓力為5 L·h－1;輔助氣為氮?dú)?壓力為5 L·h－1;氣化室溫度為80 ℃;二級質(zhì)譜分辨率為35,000;AGC 目標(biāo)值為2×105,碰撞能量范圍為20～40 eV。注射泵直接進(jìn)樣,流量為10 μL·min－1。

1．3 試驗(yàn)方法

對配制好的10 mg·L－192種工業(yè)染料標(biāo)準(zhǔn)溶液通過直接進(jìn)樣的方式,按照儀器工作條件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2．1 分子離子峰的確定

通常選擇一級質(zhì)譜中既能代表化合物結(jié)構(gòu)信息,強(qiáng)度又比較高的母離子作為準(zhǔn)分子離子峰對待測樣品進(jìn)行快速篩查,按照儀器工作條件對92種工業(yè)染料標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析,通過比較正負(fù)離子模式下的響應(yīng)強(qiáng)度,確定每種染料的最佳電離方式和分子離子峰的存在形式,92種工業(yè)染料的最佳電離方式、分子離子峰的存在形式和基峰m/z見表1。

表1 92種工業(yè)染料的最佳電離方式、分子離子峰的存在形式和基峰m/zTab．1 The optimum ionization modes，molecular ion peaks and m/z values of the base peaks of the 92 industrial dyestuffs

表1(續(xù))

表1(續(xù))

由表1可知:蘇丹染料和分散染料等含電負(fù)性偶氮基團(tuán)的弱極性染料,容易在ESI＋模式下形成[?M＋H]＋;酸性和堿性染料的最佳電離模式分別為ESI－和ESI＋,但由于兩者分子結(jié)構(gòu)中所含官能團(tuán)的差異,其分子離子峰存在形式比較復(fù)雜,且存在較大差異。

2．2 堿性染料分子離子峰存在形式的討論

多數(shù)堿性染料分子式中含有氯元素,氯元素的存在狀態(tài)決定了分子離子峰的存在形式。典型的幾種存在形式見圖1。

由圖1可知:當(dāng)氯元素是以鹵化氫的形式存在時(shí),去掉一個(gè)鹵化氫后,剩下的部分形成了準(zhǔn)分子離子峰,通過提取[?M＋H]＋的質(zhì)量數(shù)即可進(jìn)行定性和定量分析(?M 為脫鹽酸后的中性分子),例如:堿性紅1[圖1(a)];當(dāng)氯元素是以Cl－的形式存在時(shí),含有強(qiáng)極性基團(tuán)(分子中氮原子呈現(xiàn)帶有4個(gè)鍵的正離子狀態(tài))的堿性染料是通過丟掉Cl－形成分子離子峰,可直接通過提取[?M]＋的質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性和定量分析(?M 為丟掉Cl－后形成的分子離子峰),這也是堿性染料分子離子峰的主要存在形式。對于含有硫元素的堿性染料,當(dāng)硫元素是以HSO4－的形式存在時(shí),含有強(qiáng)極性基團(tuán)(分子中氮原子呈現(xiàn)帶有4個(gè)鍵的正離子狀態(tài))的堿性染料是通過丟掉HSO4－形成分子離子峰,可直接通過提取[?M]＋的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性和定量分析(?M為丟掉HSO4－后形成的分子離子峰),例如:堿性綠1[圖1(b)]和堿性藍(lán)9[圖1(c)],其中,堿性藍(lán)9比較特殊,除含Cl－外,還含有水分子和硫元素;但是硫元素并不是以HSO4－的形式存在,提取準(zhǔn)分子離子峰時(shí)不需要考慮。對于含水合物的工業(yè)染料,是通過丟掉水分子形成的準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行分析的,例如:堿性藍(lán)9[圖1(c)],是通過提取[?MH2O]＋的質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性和定量分析(?M 為脫Cl－后形成的分子離子峰)。小部分不含有氯元素和硫元素的堿性染料形成的分子離子峰和弱極性染料的類似,可直接通過提取[M＋H]＋的質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性和定量分析,例如:結(jié)晶紫內(nèi)酯[圖1(d)]。

圖1 不同堿性染料中分子離子峰的存在形式Fig．1 Existing forms of molecular ion peaks of various basic dyestuffs

2．3 酸性染料分子離子峰存在形式的討論

酸性染料分子中均含有1個(gè)或多個(gè)水溶性的磺酸基,屬于強(qiáng)極性的陰離子染料,極易溶于水電離生成陰離子,在ESI－模式下進(jìn)行檢測,母離子一般為[M-Na]－,然而試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有15 種酸性染料都是以多種價(jià)態(tài)離子共存,形成的準(zhǔn)分子離子峰的類型和信號強(qiáng)度與分子結(jié)構(gòu)中Na＋、磺酸基的數(shù)目、氮或硫元素及鹵素的存在狀態(tài)有關(guān),這些分子傾向失去所有Na＋,然后再從溶劑中獲得氫原子結(jié)合在磺酸基上,在溶液中形成一系列[(M－xNa＋yH)/(xy)]－離子。

針對只含有單個(gè)Na＋的酸性染料,其典型的分子離子峰的存在形式見圖2。

圖2 酸性藍(lán)1和甲基橙1的分子離子峰的存在形式Fig．2 Existing forms of molecular ion peaks of acid blue 1 and methyl orange

由圖2可知:不管是含有強(qiáng)極性基團(tuán)(分子中氮原子呈現(xiàn)帶有4個(gè)鍵的正離子狀態(tài))且含有磺酸基(SO3－)數(shù)量為2[酸性藍(lán)1,圖2(a)]還是化合物中的所有氮元素均不是強(qiáng)極性基團(tuán)(分子中氮原子呈現(xiàn)帶有4個(gè)鍵的正離子狀態(tài))且含有磺酸根數(shù)量為1的酸性染料[甲基橙,圖2(b)]均可通過直接提取準(zhǔn)分子離子峰[?M]－進(jìn)行定性定量分析(?M 為丟掉鈉離子后形成的分子離子峰)。

含有2個(gè)或以上Na＋或者含有碘、溴等鹵素離子且不含磺酸根的酸性染料的分子離子峰的存在形式見圖3。

圖3 酸性紅27、橙G 和酸性紅51的分子離子峰的存在形式Fig．3 Existing forms of molecular ion peaks of acid red 27,orange G and acid red 51

含有2個(gè)或以上Na＋,且具有同等數(shù)量的磺酸根的酸性染料化合物在ESI－模式下會形成一系列[(M－xNa＋yH)/(x－y)]－多離子共存的狀態(tài)(其中?M 為脫去所有Na＋后的帶電離子),其中多以二價(jià)準(zhǔn)分子離子為基峰,因?yàn)閱蝺r(jià)態(tài)和更高價(jià)態(tài)的分子離子峰響應(yīng)較低,例如:酸性紅27[圖3(a)]。此類化合物(如:酸性紅27)形成的分子離子峰的價(jià)態(tài)形式隨著錐孔電壓的增加而改變,在較低錐孔電壓下容易形成一價(jià)和二價(jià)分子離子峰,但過低錐孔電壓會影響待測化合物的響應(yīng)值;增大錐孔電壓時(shí),則主要形成一價(jià)分子離子峰,但過高的錐孔電壓會導(dǎo)致化合物發(fā)生碰撞誘導(dǎo)解離,雖然能產(chǎn)生較豐富的碎片離子,但也會降低準(zhǔn)分子離子峰響應(yīng)值;所以本工作將錐孔電壓設(shè)定為20 eV。極性偏小的酸性染料容易行成二價(jià)準(zhǔn)分子離子峰,例如:酸性紅27[圖3(a)]。極性偏大的酸性染料容易形成一價(jià)準(zhǔn)分子離子峰,例如:橙G[圖3(b)]。對于含有碘、溴等鹵素離子的酸性染料,當(dāng)此類化合物中不含有磺酸根時(shí),在ESI－模式下會直接形成[?M＋H]－(其中?M 為脫去所有Na＋后的帶電離子),例如:酸性紅51[圖3(c)]。

本工作采用四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀,對92種工業(yè)染料直接進(jìn)行高分辨率和高準(zhǔn)確度質(zhì)量數(shù)(分辨率不小于70 000,m/z200)的正/負(fù)離子全掃描試驗(yàn),獲得92種工業(yè)染料的電離方式、準(zhǔn)分子離子峰和基峰。在實(shí)際樣品檢測中,可通過直接提取一級質(zhì)譜中準(zhǔn)分子離子峰高準(zhǔn)確度質(zhì)量數(shù)對待測化合物進(jìn)行快速篩查。