楊 娟，張華峰，*，牛麗麗，郭 強(qiáng)

（1.教育部藥用資源與天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，

陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

淫羊藿是小檗科淫羊藿屬多年生草本植物，經(jīng)國(guó)家衛(wèi)生部（現(xiàn)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)）批準(zhǔn)可用于保健食品，在食品和醫(yī)藥工業(yè)中具有廣泛用途[1-2]。淫羊藿的主要有效成分為黃酮類化合物，大量研究表明淫羊藿總黃酮具有抗氧化、耐缺氧、促進(jìn)骨骼發(fā)育、抗衰老等功效[2]，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C與淫羊藿苷4種黃酮醇糖苷具有抗氧化、防治骨質(zhì)疏松癥等功效[3-4]?！吨袊?guó)藥典（2010版）》（以下簡(jiǎn)稱藥典）將總黃酮、淫羊藿苷和朝藿定C列為淫羊藿質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，近年來(lái)的研究顯示朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷皆為淫羊藿的標(biāo)志化合物（marker compound）[3-5]。目前世界上已知的淫羊藿種約有57個(gè)，其中日本約有5種，地中海和西亞地區(qū)約有4種，克什米爾和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)各有1種，其余的種屬大都分布在我國(guó)，因而我國(guó)被認(rèn)為是世界淫羊藿的地理分布中心和物種多樣性中心[6-7]。藥典規(guī)定朝鮮淫羊藿（Epimedium koreanum）、箭葉淫羊藿（E.sagittatum）、心葉淫羊藿（E.brevicornu）、柔毛淫羊藿（E.pubescens）、巫山淫羊藿（E.wushanense）為正品藥材，但是市場(chǎng)上實(shí)際流通的淫羊藿在10種以上，這使得市售淫羊藿的質(zhì)量狀況變得十分復(fù)雜[8]。除了我國(guó)以外，日本、韓國(guó)、東南亞和地中海等國(guó)家與地區(qū)也將淫羊藿列為藥用植物。作為世界淫羊藿及其提取物的主要出產(chǎn)國(guó)，我國(guó)所產(chǎn)淫羊藿的質(zhì)量直接影響著國(guó)際市場(chǎng)上藥材的品質(zhì)。因此，系統(tǒng)調(diào)查我國(guó)市售淫羊藿的品質(zhì)，測(cè)定其中朝藿定、淫羊藿苷和總黃酮的含量，分析其抗氧化活性，對(duì)于了解我國(guó)商品淫羊藿的質(zhì)量現(xiàn)狀、改善淫羊藿功能性食品的品質(zhì)具有重要意義。史萬(wàn)忠等[8]測(cè)定了市售淫羊藿中淫羊藿苷的含量，王治平等[9]測(cè)定了廣州地區(qū)市售淫羊藿中淫羊藿苷和總黃酮的含量，張俊生等[10]分析了市售箭葉淫羊藿總黃酮提取液對(duì)油脂氧化的抑制作用。本研究測(cè)定了33批市售淫羊藿樣品中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和總黃酮的含量，分析了淫羊藿乙醇提取物的抗氧化活性，以期為淫羊藿的品質(zhì)鑒定和開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Trolox（6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯丙二氫吡喃-2-羧酸）純度為98%，美國(guó)Sigma公司；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2，2’-連氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽）美國(guó)Sigma公司；淫羊藿苷、朝藿定、抗壞血酸（VC）對(duì)照品 純度≥98%，美國(guó)ChromaDex公司；乙腈 HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher公司；甲醇、無(wú)水乙醇、冰乙酸和過(guò)硫酸鉀等 國(guó)產(chǎn)分析純；33批淫羊藿樣品 購(gòu)自我國(guó)30多個(gè)省、自治區(qū)和直轄市，具體信息見(jiàn)表1。

高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；超聲波提取器 武漢嘉鵬電子有限公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；旋渦混合儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海精密儀器儀表公司；磁力攪拌器 惠智儀誠(chéng)（北京）科技發(fā)展有限公司；離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 淫羊藿的預(yù)處理 淫羊藿樣品分析之前首先進(jìn)行分類和清理，去掉土塊、羽毛、紙片等雜物，選取葉片并用自來(lái)水、蒸餾水依次淋洗，在55℃烘干后粉碎、過(guò)篩（80目），再在55℃烘干至恒重，裝入帶蓋離心管中避光保存。

1.2.2 黃酮類化合物的提取 稱取0.2g淫羊藿粉末于具塞三角瓶中，加入50%（v/v）乙醇溶液6mL，混勻后在頻率30kHz、功率300W、溫度50℃下超聲波輔助提取30min，共提取3次，提取液合并后用0.45μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，得到黃酮類化合物樣品溶液。若樣品溶液不立即進(jìn)行色譜分析，則置于4℃冰箱避光、密封保存。

1.2.3 朝藿定、淫羊藿苷和總黃酮的定量分析 采用本實(shí)驗(yàn)室建立的反相高效液相色譜法[11]同時(shí)測(cè)定淫羊藿樣品溶液中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C與淫羊藿苷的濃度并計(jì)算淫羊藿藥材中4種標(biāo)志化合物的含量；采用藥典所述紫外分光光度法測(cè)定總黃酮含量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)求平均值。

1.2.4 乙醇提取液的制備 準(zhǔn)確稱取淫羊藿粉末0.2g，傾入50mL帶蓋離心管，加入50%乙醇溶液10mL，擰緊管蓋后用旋渦混合儀使溶劑和樣品充分混合，靜置1h后在90℃水浴鍋中溫浴提取30min（水浴前后稱重，若溶劑有損失則需補(bǔ)足減失的重量），最后用有機(jī)系濾膜過(guò)濾，所得黃綠色濾液即為乙醇提取液（使用前置4℃冰箱避光保存）。

1.2.5 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn) 參考Rao等[12]的方法測(cè)定淫羊藿醇提物的DPPH自由基清除率。取0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液2mL，加入裝有4mL不同濃度淫羊藿醇提物的具塞試管中，試管封口后在旋渦混合儀上充分混合，然后在37℃水浴中保溫30min，取出后在波長(zhǎng)517nm處測(cè)定吸光度As；用4mL無(wú)水乙醇代替4mL醇提物測(cè)得吸光度Ab；用抗壞血酸作陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。淫羊藿醇提物的抗氧化活性用DPPH自由基清除率來(lái)表示，計(jì)算公式為：DPPH自由基清除率（%）=（1-As/Ab）×100。參考李晶晶等[13]的方法計(jì)算EC50值。

1.2.6 ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn) 參考Kriengsak等[14]的方法測(cè)定淫羊藿醇提物的ABTS+自由基清除率。將0.0626g Trolox溶于25mL無(wú)水乙醇中配制成濃度為10mmol/L的母液，再用無(wú)水乙醇稀釋成濃度依次為50、100、150、200、250、300、350、400μmol/L的梯度溶液。分別取250μL不同濃度梯度溶液，各加入4750μL的ABTS+自由基溶液，在30℃水浴中避光反應(yīng)6min后在734nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度As；對(duì)照組用250mL 50%乙醇溶液代替250mL Trolox溶液測(cè)得吸光度Ab；實(shí)驗(yàn)組用250μL淫羊藿醇提物代替250mL Trolox溶液測(cè)定吸光度As。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。以Trolox溶液的濃度為X軸、Trolox對(duì)ABTS+自由基的清除率為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=0.2514X+2.2052，相關(guān)系數(shù)R2=0.9942），以Trolox為參照物計(jì)算淫羊藿醇提物的抗氧化活性和EC50值。ABTS+自由基清除率的計(jì)算公式為：ABTS+自由基清除率（%）=（1-As/Ab）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 淫羊藿黃酮類化合物的含量

由表1可知，不同地區(qū)商品淫羊藿中黃酮類化合物的含量差異很大，變異系數(shù)在29.76% ～87.79%之間。其中，四川成都的朝藿定A含量最高（3.01mg/g），黑龍江哈爾濱最低（0.37mg/g）；上海的朝藿定B含量最高（5.22mg/g），黑龍江哈爾濱最低（0.25mg/g）；福建三明的朝藿定C含量最高（19.27mg/g），寧夏吳忠最低（0.46mg/g）；上海的淫羊藿苷含量最高（13.40mg/g），黑龍江哈爾濱最低（0.41mg/g）；上海的總黃酮含量最高（68.73mg/g），寧夏吳忠最低（18.29mg/g）。藥典規(guī)定總黃酮含量不得低于50mg/g，淫羊藿苷不低于5mg/g，朝藿定C不低于10mg/g。然而，33批市售淫羊藿樣品中僅上海、福建三明等8個(gè)地區(qū)的總黃酮含量達(dá)到藥典要求，達(dá)標(biāo)率為24.2%；上海、天津等14個(gè)地區(qū)的淫羊藿苷含量達(dá)到藥典要求，達(dá)標(biāo)率為42.4%；福建三明、重慶等6個(gè)地區(qū)的朝藿定C含量達(dá)到藥典要求，達(dá)標(biāo)率為18.2%。按照藥典對(duì)總黃酮、淫羊藿苷和朝藿定C的要求，藥材合格率為30.3%?？梢钥闯觯蠖鄶?shù)市售淫羊藿樣品的質(zhì)量較差。史萬(wàn)忠等[8]和王治平等[9]也發(fā)現(xiàn)市售淫羊藿中淫羊藿苷與總黃酮的含量大都沒(méi)有達(dá)到藥典要求。筆者在文獻(xiàn)調(diào)研[8-9，15]和實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上統(tǒng)計(jì)了2001 ～2013年市售淫羊藿藥材合格率的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)近十年來(lái)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)淫羊藿藥材的質(zhì)量呈緩慢下降趨勢(shì)（圖1）。造成這種現(xiàn)象的原因可能是淫羊藿藥材的種植、采摘、收購(gòu)環(huán)節(jié)中缺少必要的檢測(cè)和有效的監(jiān)管。大量研究顯示，淫羊藿體內(nèi)黃酮類化合物的積累過(guò)程既受到遺傳因素的影響[4]，又受到環(huán)境因素（包括采摘時(shí)期、土壤、光照、氣溫、降水量等）的影響[15-18]。如果在種植和采摘環(huán)節(jié)中忽視品種和收獲季節(jié)的選擇，或者在收購(gòu)環(huán)節(jié)中忽視品種的鑒定（含偽品的甄別）和標(biāo)志化合物的檢測(cè)，都可能使藥材質(zhì)量大打折扣。

表1 不同地區(qū)商品淫羊藿中黃酮類化合物的含量Table 1 Contents of flavonoids in Epimedii Folium in different areas of China

圖1 不同年份市售淫羊藿質(zhì)量狀況Fig.1 Current status of quality of Epimedii Folium in different years

從表1還可看出，淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷4種標(biāo)志化合物的含量不存在消長(zhǎng)關(guān)系即各自含量沒(méi)有相關(guān)性，例如甘肅蘭州市售淫羊藿中淫羊藿苷含量雖然較低（3.26mg/g），但是朝藿定C含量卻很高（11.55mg/g），而黑龍江哈爾濱的淫羊藿苷和朝藿定B含量均較低（0.41mg/g和0.25mg/g）。朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的功效不盡相同[4]，單純以淫羊藿苷或朝藿定C作為評(píng)價(jià)指標(biāo)不能全面反映淫羊藿的內(nèi)在品質(zhì)[2]。遺憾的是，雖然將朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷4種黃酮醇糖苷作為淫羊藿的標(biāo)志化合物已經(jīng)成為很多學(xué)者的共識(shí)[3-5，19]，但是藥典至今尚沒(méi)有關(guān)于朝藿定A和朝藿定B的含量標(biāo)準(zhǔn)，在一定程度上影響了淫羊藿的質(zhì)量控制。

2.2 淫羊藿的抗氧化活性

由表2可知，不同地區(qū)商品淫羊藿醇提物的抗氧化活性差異很大。在ABTS實(shí)驗(yàn)中，以Trolox溶液濃度為X軸、Trolox對(duì)ABTS+的清除率為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=0.2514X+2.2052，相關(guān)系數(shù)R2=0.9942），計(jì)算出淫羊藿醇提物的EC50值在4.71 ～21.96μg/mL之間，其中黑龍江哈爾濱地區(qū)市售淫羊藿的ABTS+·清除能力最強(qiáng)（4.71μg/mL），福建三明最弱（21.96μg/mL）；在DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中，EC50值的范圍在0.27 ～3.51μg/mL之間，其中湖南邵陽(yáng)地區(qū)市售淫羊藿的自由基清除能力最強(qiáng)（0.27μg/mL），山西清徐最弱（3.51μg/mL），所有淫羊藿樣品的DPPH自由基清除率均高于VC。相關(guān)性分析表明，淫羊藿醇提物的抗氧化活性與朝藿定C、總黃酮含量的相關(guān)性較高，而與朝藿定A、朝藿定B、淫羊藿苷含量的相關(guān)性較低（表3）。這說(shuō)明，朝藿定C是淫羊藿中抗氧化活性較強(qiáng)的黃酮類化合物，但并非唯一的抗氧化物質(zhì)，在淫羊藿中很可能還存在著其他一些抗氧化活性較強(qiáng)的化合物。盡管ABTS實(shí)驗(yàn)與DPPH實(shí)驗(yàn)得出的R2數(shù)據(jù)不同，但是黃酮類化合物與抗氧化活性相關(guān)性的整體趨勢(shì)相似，這可能是由于DPPH與ABTS實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)機(jī)制不同，而反映的抗氧化活性本質(zhì)基本一致。

表2 不同地區(qū)商品淫羊藿醇提物的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activities of alcoholic extracts of Epimedii Folium in different areas of China

表3 淫羊藿黃酮類化合物與抗氧化活性的相關(guān)性Table 3 Relationship between antioxidant capacities and flavonoids in Epimedii Folium

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)測(cè)定了不同地區(qū)商品淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷與總黃酮的含量及其DPPH·、ABTS+·清除能力。結(jié)果表明，不同地區(qū)淫羊藿中黃酮類化合物的含量變異較大，抗氧化活性也存在較大差異，藥材質(zhì)量參差不齊。淫羊藿的抗氧化活性與朝藿定C、總黃酮含量的相關(guān)性較高，而與朝藿定A、朝藿定B、淫羊藿苷含量的相關(guān)性較低。淫羊藿黃酮類化合物的含量變異與抗氧化活性分析為其品質(zhì)鑒定和質(zhì)量控制提供了依據(jù)，同時(shí)也為淫羊藿功能性食品的生產(chǎn)提供了參考。

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