劉 榮，姜元松，何 嬌，王振宇，2，*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090）

近年來(lái)由于抗氧化劑能消除由人體產(chǎn)生的內(nèi)源性自由基，減少自由基氧化損傷人體生物大分子，因而備受關(guān)注，而合成的抗氧化劑安全性受到質(zhì)疑，所以從食源性植物中找到可以開發(fā)利用的天然抗氧化劑具有重要意義。植物多酚由于其酚羥基能提供活潑質(zhì)子而成為具有清除自由基及抗氧化功能的物質(zhì)，其抗氧化效果甚至高于BHA（叔丁基羥基茴香醚）和BHT（2，6-二叔丁基對(duì)甲酚）等人工合成的抗氧化劑[1]。孫建霞等[2]開展蘋果多酚對(duì)菜籽油和豬油的抗氧化性能實(shí)驗(yàn)表明，蘋果多酚對(duì)植物油和動(dòng)物油均具有較明顯的抗氧化效果，且對(duì)植物油抗氧化效果要遠(yuǎn)優(yōu)于BHT，張峻等[3]利用不同的有機(jī)溶劑對(duì)葡萄籽進(jìn)行提取多酚，其多酚對(duì)豬油有很好的抗氧化性能，且效果優(yōu)于BHT。Aviram M等[4]也曾報(bào)道多酚類物質(zhì)能抑制低密度脂蛋白的氧化性。

樟子松（Pinus sylvestris L.）又名海拉爾松（日）、西伯利亞松，為松科喬木，是我國(guó)三北地區(qū)主要優(yōu)良造林樹種之一。因其中含黃酮、多酚類物質(zhì)、有機(jī)酸、鞣質(zhì)等豐富的有效成分而具有藥用開發(fā)價(jià)值。近期研究發(fā)現(xiàn)松科植物體內(nèi)含有大量的生物活性的多酚類化合物，這類物質(zhì)統(tǒng)稱為松多酚。松多酚的獨(dú)特結(jié)構(gòu)賦予了它一系列獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)，不僅使其成為一種色素類天然抗氧化劑[5]，還使其具有抗腫瘤[6]、防治冠心病與中風(fēng)等心腦血管疾病、抗動(dòng)脈硬化、降血脂降血糖[7-8]以及抗菌等多種生理功能。松多酚作為一種天然抗氧化劑，會(huì)伴隨著飲食攝入后，通過(guò)機(jī)體吸收增加血液抗氧化能力，有助于預(yù)防癌癥和心腦血管疾病的發(fā)生，因而在健康、營(yíng)養(yǎng)以及醫(yī)藥領(lǐng)域的關(guān)注度逐漸提高[9]。目前，關(guān)于松多酚體外抗氧化效果的研究評(píng)價(jià)相對(duì)較少。

本文以樟子松樹皮為原料，旨在通過(guò)提取一種新型來(lái)源的植物多酚—松多酚并對(duì)其進(jìn)行純化，通過(guò)研究純化前后主要化學(xué)成分含量以及其體外抗氧化活性，為樟子松樹皮多酚的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樟子松（Pinus sylvestris L.）樹皮 收集于黑龍江哈爾濱，收集時(shí)間為2012年10月份，自然烘干至恒重后粉碎過(guò)40目篩，備用；三羥甲基氨基甲烷（Tris堿）、1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、抗壞血酸、蘆丁、原花青素 美國(guó)Sigma公司；大孔樹脂D101 天津海光試劑公司；其他化學(xué)試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DK-8D型三孔電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)有限公司；JA2003型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；722型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；SHB－Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；FW135型中藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；玻璃層析柱（2.5cm×70cm）上海滬西分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料的制備[10]稱取一定質(zhì)量的樟子松樹皮粉末，以體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇為作為溶劑，按料液比1∶25進(jìn)行水浴浸提，水浴溫度為50℃，浸提時(shí)間4h，將浸提液在4000r/min的條件下離心分離15min后減壓濃縮蒸去乙醇，得到多酚粗提物；將上述粗提物在上樣濃度3mg/mL，上樣體積30mL，洗脫劑乙醇濃度為53%條件下進(jìn)行一次純化，控制上樣流速5BV/h，洗脫流速4.25BV/h；收集純化物，減壓濃縮蒸去乙醇，得到樟子松樹皮多酚一級(jí)純化產(chǎn)物。

1.2.2 主要化學(xué)成分含量測(cè)定

1.2.2.1 原花青素含量的測(cè)定[11]以原花青素濃度為橫坐標(biāo)，546nm波長(zhǎng)處吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試樣中原花青素的含量。

1.2.2.2 黃酮含量的測(cè)定[12]以50mL中蘆丁質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，415nm處吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出溶液中黃酮類化合物含量。

1.2.2.3 多酚含量的測(cè)定[13]以沒(méi)食子酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，765nm波長(zhǎng)下吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中多酚含量。

1.2.3 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 在Blois[14]測(cè)定方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)：以1mL蒸餾水和3mL無(wú)水乙醇混合液做參比，移取1mL提取液加入3mL 1×10-4mol/L DPPH溶液混勻，室溫放置30min后測(cè)定體系在波長(zhǎng)517nm處的吸光值A(chǔ)i，移取1mL提取液加入3mL無(wú)水乙醇溶液混勻，測(cè)定517nm處的吸光值A(chǔ)j，同時(shí)測(cè)定3mL DPPH溶液與1mL無(wú)水乙醇混合液的吸光度A0，按下式計(jì)算樟子松多酚對(duì)DPPH的清除能力。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)評(píng)價(jià)受試物的抗氧化能力。

1.2.4 羥自由基清除能力的測(cè)定 在郭盛[15]的方法上進(jìn)行改進(jìn)：向試管中依次加入1mmol/L FeSO4溶液1mL，不同提取條件下的樟子松多酚提取液1mL，1mmol/L過(guò)氧化氫溶液1mL，3mmol/L水楊酸溶液2mL混勻，室溫放置30min后于510nm處測(cè)得吸光值A(chǔ)i，用蒸餾水代替水楊酸測(cè)得吸光值A(chǔ)j，用蒸餾水代替多酚溶液測(cè)得吸光值A(chǔ)0，按下式計(jì)算樟子松多酚對(duì)羥自由基的清除能力。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)評(píng)價(jià)受試物的抗氧化能力。

1.2.5 總還原能力的測(cè)定 還原能力的測(cè)定選取Tsai等[16]采用的鐵氰化鉀還原顯色法。還原能力高低與混合試樣700nm下吸光度大小成正相關(guān)。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)評(píng)價(jià)受試物的抗氧化能力。

1.2.6 對(duì)卵黃脂蛋白過(guò)氧化抑制作用的測(cè)定 在張爾賢等[17]的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行修改。取新鮮卵黃，加磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L，pH7.4）制備成4%的卵黃懸液。于試管中，依次加入0.2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的卵黃懸液，1mL不同濃度的樟子松樹皮提取物，0.2mL 25mmol/L的FeSO4溶液，0.6mL 0.0lmol/L pH7.4的磷酸緩沖液，混勻后置于37℃恒溫水浴中反應(yīng)1h。取出后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸1.0mL，充分混合后靜置10min，3500r/min條件下離心10min，取上清液2.0mL并加入l.0mL 0.8%的硫代巴比妥酸溶液，置于沸水浴中反應(yīng)15min，流水冷卻至室溫后，以磷酸鹽緩沖液（0.0lmol/L，pH7.4）空白調(diào)零，于532nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1；以等體積蒸餾水代替不同濃度樟子松樹皮提取物，同法操作測(cè)定吸光度值A(chǔ)0；以等體積蒸餾水代替卵黃液，同法操作測(cè)定吸光度值A(chǔ)2。按照下式計(jì)算樟子松多酚對(duì)卵黃脂蛋白過(guò)氧化的抑制率。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)評(píng)價(jià)受試物的抗氧化能力。

1.2.7 ABTS+自由基清除能力測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用碧云天ABTS試劑盒進(jìn)行測(cè)定：在96孔板的孔中依次加入受試樣品溶液50μL，以及ABTS溶液250μL，充分混勻于734nm波長(zhǎng)下測(cè)定混合體系溶液吸光值記為Ai，在另一組加入受試樣品溶液50μL的孔中加入磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH=7.4）250μL，充分混勻于734nm波長(zhǎng)下測(cè)定混合體系溶液吸光值記為Aj，同時(shí)在第三組孔中加入蒸餾水50μL以及ABTS自由基工作液250μL作為空白組，避光反應(yīng)6min，于734nm波長(zhǎng)下測(cè)混合體系溶液吸光值記為A0。按公式計(jì)算樟子松多酚對(duì)ABTS+自由基的清除能力，同時(shí)以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)評(píng)價(jià)受試物的抗氧化能力。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)評(píng)價(jià)受試物的抗氧化能力。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 本研究所有進(jìn)行實(shí)驗(yàn)均平行三次，數(shù)據(jù)表示為：結(jié)果±標(biāo)準(zhǔn)差；圖像及圖表分析均采用Exce（l2007）以及SAS（9.1）軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法，分別得到原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0049x+0.0055，R2=0.9993，式中，y-溶液在546nm處的吸光度，x-原花青素濃度（μg/mL）；黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.6282x+0.0044，R2=0.9994，式中，y-溶液在415nm處的吸光度，x-50mL中蘆丁含量（mg）；總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.01081x+0.0047，R2=0.9994，式中，y-溶液在765nm處的吸光度，x-沒(méi)食子酸的濃度（μg/mL）。

2.2 主要化學(xué)成分含量測(cè)定

對(duì)純化前和純化后的樟子松樹皮提取物分別測(cè)定其中多酚含量、原花青素含量和黃酮含量，結(jié)果如表1所示。樟子松樹皮提取物中黃酮含量最低，原花青素含量較高，多酚含量最高，并且經(jīng)過(guò)純化后各種物質(zhì)的含量均有所提升，多酚含量提高近一倍，說(shuō)明大孔樹脂對(duì)樟子松樹皮提取物的純化具有一定作用。

2.3 樟子松樹皮多酚對(duì)DPPH自由基的清除作用

樟子松樹皮多酚及抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除率測(cè)定結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，樟子松樹皮提取物對(duì)DPPH自由基具有顯著的清除作用，且在一定濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的增加，對(duì)DPPH清除率也逐漸增加。在0 ～50μg/mL的濃度范圍內(nèi)，樟子松樹皮提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用增強(qiáng)顯著，成線性增長(zhǎng)關(guān)系，50μg/mL之后，隨受試物濃度升高，清除作用增加不明顯。樟子松樹皮多酚清除DPPH自由基機(jī)理可能是在DPPH乙醇溶液中加入多酚提取物后，其中的抗氧化活性物質(zhì)可以與DPPH·結(jié)合或發(fā)生替代，使DPPH·數(shù)量減少，溶液顏色變淺，其在517nm波長(zhǎng)處的吸光度不斷減小，直至達(dá)到穩(wěn)定。經(jīng)SPSS軟件計(jì)算，抗壞血酸的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（11.91±0.24）μg/mL，未純化和純化的樟子松多酚的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為（29.54±0.98）、（19.47±0.74）μg/mL，說(shuō)明純化及未純化的樟子松樹皮多酚對(duì)DPPH·的清除作用均弱于陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸，而純化的樟子松樹皮多酚對(duì)DPPH自由基的清除作用要強(qiáng)于未純化的。

圖1 樟子松樹皮多酚對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.1 The DPPH·scavenging activity of Pinus sylvestris L.bark polyphenol

2.4 樟子松樹皮多酚對(duì)羥自由基的清除作用

通過(guò)測(cè)定水楊酸捕獲羥自由基所得到的產(chǎn)物確定羥自由基的清除率。由圖2可知，樟子松樹皮多酚對(duì)羥自由基具有一定的清除能力，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的增加，樟子松樹皮多酚對(duì)羥自由基的清除率逐漸上升，但上升速率緩慢，弱于同濃度的抗壞血酸。在樣品濃度為2mg/mL時(shí)，未純化的樟子松樹皮提取物對(duì)羥自由基的清除率為54.52%±1.66%，純化的為57.95%±1.37%，同濃度條件下的抗壞血酸對(duì)羥自由基的清除率可達(dá)99.64%±0.40%。經(jīng)計(jì)算得，抗壞血酸的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（0.85±0.05）mg/mL，未純化和純化的樟子松多酚的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為（1.87±0.21）、（1.70±0.14）mg/mL。這是由于松多酚類物質(zhì)存在一定的轉(zhuǎn)移氫原子的能力，可作為鏈斷裂抗氧化劑抑制自由基的形成。松多酚羥基自由基清除的機(jī)理可能為向羥基自由基提供一個(gè)氫原子或電子中斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，形成一種較為穩(wěn)定的物質(zhì)。此結(jié)果表明，樟子松樹皮多酚對(duì)羥自由基具有一定的清除作用，但效果弱于抗壞血酸。

圖2 樟子松樹皮多酚對(duì)羥自由基的清除作用Fig.2 The OH·scavenging activity of Pinus sylvestris L.bark polyphenol

2.5 樟子松樹皮總還原能力

檢驗(yàn)受試物是否為良好電子供體的最簡(jiǎn)單方法就是測(cè)定其總還原能力，還原力的測(cè)定也是評(píng)價(jià)抗氧化劑活性較常用的方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示樟子松樹皮多酚具有較強(qiáng)的總還原能力，且與濃度呈正相關(guān)，純化后樟子松樹皮多酚的總還原能力強(qiáng)于未純化的，而兩者的還原作用均弱于抗壞血酸。

圖3 樟子松樹皮多酚總還原能力曲線Fig.3 The reducing ability assay of Pinus sylvestris L.bark polyphenol

2.6 樟子松樹皮多酚對(duì)卵黃脂蛋白過(guò)氧化抑制作用

如圖4顯示，樟子松樹皮多酚可以顯著抑制卵黃的過(guò)氧化作用。在濃度為0.02mg/mL時(shí)，純化的樟子松樹皮多酚對(duì)卵黃過(guò)氧化的抑制率為70.10%±3.35%，未純化的樟子松樹皮多酚對(duì)其抑制率為50.00%±1.60%，而抗壞血酸對(duì)其抑制率僅為26.92%±1.06%。濃度為0.1mg/mL時(shí)，抑制率基本達(dá)到平衡，平衡時(shí)純化的樟子松樹皮多酚對(duì)卵黃過(guò)氧化的抑制率為90.17%±3.73%，未純化的樟子松樹皮多酚對(duì)其抑制率為88.25%±2.28%，而抗壞血酸對(duì)其抑制率僅為87.61%±3.11%。抗壞血酸對(duì)卵黃過(guò)氧化的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（0.041±0.009）mg/mL，未純化和純化的樟子松多酚的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為（0.017±0.007）、（0.016±0.003）mg/mL。此結(jié)果顯示，樟子松樹皮多酚可以有效抑制卵黃過(guò)氧化發(fā)生，且抑制作用強(qiáng)于抗壞血酸。

圖4 樟子松樹皮多酚對(duì)卵黃過(guò)氧化的抑制作用Fig.4 The inhibition curve of Pinus sylvestris L.bark polyphenol for yelk peroxidation

2.7 樟子松樹皮多酚對(duì)ABTS+自由基清除作用

圖5 樟子松樹皮多酚對(duì)ABTS+自由基的清除作用Fig.5 The ABTS+·scavenging activity of Pinus sylvestris L.bark polyphenol

純化前后樟子松樹皮多酚及陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸對(duì)ABTS+自由基的清除率測(cè)定結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，未純化和純化后的樟子松樹皮多酚對(duì)ABTS均具有一定的清除能力，并且清除能力略弱于抗壞血酸。當(dāng)樣品濃度為0.5mg/mL時(shí)，樟子松樹皮多酚對(duì)ABTS+自由基的清除率達(dá)到穩(wěn)定，未純化的清除率為61.99%±0.63%，純化后的清除率為63.82%±1.28%，此時(shí)VC對(duì)ABTS自由基的清除率為70.12%±1.35%。經(jīng)計(jì)算得，抗壞血酸的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（0.039±0.004）mg/mL，未純化和純化的樟子松多酚的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為（0.18±0.014）、（0.088±0.009）mg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樟子松樹皮多酚在清除ABTS自由基方面是不錯(cuò)的抗氧化物質(zhì)。

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)大孔樹脂D101純化，樟子松樹皮提取物中原花青素、黃酮以及多酚含量分別由（0.2023±0.0131）、（0.0014±0.0002）、（0.3373±0.0251）mg/mg提高到（0.3158±0.0215）、（0.0022±0.0004）、（0.6414±0.0586）mg/mg，三種物質(zhì)的含量均有明顯提高。

純化與未純化的樟子松樹皮多酚均具有較強(qiáng)抗氧化能力，并且純化后的樟子松樹皮多酚的抗氧化能力要強(qiáng)于未純化的樟子松樹皮多酚。樟子松樹皮多酚對(duì)非生理自由基如DPPH自由基、ABTS+自由基均有非常顯著的清除能力，清除作用略弱于抗壞血酸；而對(duì)生理自由基如羥自由基、超氧陰離子的清除能力較弱；純化前后樟子松樹皮多酚均具有較強(qiáng)的總還原能力；樟子松樹皮多酚對(duì)卵黃脂蛋白過(guò)氧化抑制能力非常強(qiáng)，純化前和純化后的多酚對(duì)卵黃脂蛋白過(guò)氧化抑制能力均強(qiáng)于抗壞血酸。說(shuō)明樟子松樹皮多酚具有顯著的抗氧化活性，此結(jié)果為樟子松樹皮的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供有效的依據(jù)。

[1]李健，楊昌鵬，李群梅.植物多酚的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].廣西輕工業(yè)，2008（12）：1-3.

[2]孫建霞，孫愛(ài)東，白衛(wèi)濱，等.蘋果多酚的提取工藝及其對(duì)油脂的抗氧化作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，37（3）：122-124.

[3]張峻，吉偉之，齊欣.葡萄籽中多酚類物質(zhì)的提取及其對(duì)油脂的抗氧化作用[J].食品科學(xué)，2001，22（10）：43-45.

[4]Aviram M，F(xiàn)uhrman B.Polyphenolic Flavonoides Inhibit Macrophagemediated Oxidation of LDL and Attenuate Atherogenesis[J].Atherosclerosis，1998，137（1）：45-50.

[5]趙海田，王振宇，程翠林，等.松多酚類活性物質(zhì)抗氧化構(gòu)效關(guān)系與作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2012（2）：458-461.

[6]Hsu T Y，Sheu S C，Liaw E T，et al.Anti-oxidant activity and effect of Pinus morrisonicola Hay.on the survival of leukemia cell line U937[J].Phytomedicine，2005，12（9）：663-669.

[7]Liazid A，Schwarz M，Varela R M，et al.Evaluation of various extraction techniques for obtaining bioactive extracts from pine seeds[J].Food and Bioproducts Processing，2010，88（2-3）：247-252.

[8]Pinelo M，Rubilar M，Sineiro J，et al.Extraction of antioxidant phenolics from almond hulls（Prunes amygdalus）and pine sawdust（Pines pinaster）[J].Food Chemistry，2004，85（2）：267-273.

[9]Tourinńo S，Selga A，Jiménez A，et al.Procyanidin fractions from pine（Pinus pinaster）bark：radical-scavenging power in solution，antioxidant activity in emulsion and antiproliferative effect in melanoma cells[J].Agricultural and Food Chemistry，2005，53：4728-4735.

[10]劉榮，何嬌，王振宇.大孔樹脂對(duì)樟子松樹皮多酚純化工藝的研究[J].食品工業(yè)科技，2013（11）：201-205.

[11]蔡曉，楊長(zhǎng)曉.紫外分光光度法測(cè)定保健食品中原花青素的研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，20（4）：744-745.

[12]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)GB/T 20574-2006，蜂膠中總黃酮含量的測(cè)定方法分光光度比色法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007

[13]趙玉紅，翟亞楠，王振宇.樟子松樹皮中松多酚的提取工藝研究及提取方法比較[J].食品工業(yè)科技，2013（4）：304-309.

[14]Blois M S.Antioxidant determinations by the use of a stable free radical[J].Nature，2002，26：1199-1200.

[15]郭盛.和田玉棗黃酮提取工藝及其抗氧化活性的研究[D].西安：陜西師范大學(xué)，2008.

[16]Tsai S Y，Huang S J，Mau J L.Antioxidant properties of hot water extracts from Agrocybe cylindracea[J].Food Chemistry，2007，98：670-677.

[l7]張爾賢，寓麗君，周意琳，等.Fe2+誘發(fā)脂蛋白PuFA過(guò)氧化體系及對(duì)若干天然產(chǎn)物抗氧化作用的評(píng)價(jià)[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1996，28（2）：218-222.