徐星新，蔣興明，梁永紅，王志清，馬興才，李映新，宋 慧

(1廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧530021;2南寧市第七人民醫(yī)院)

蛇毒具有多種生物活性，目前關(guān)于蛇毒蛋白抗腫瘤的報道越來越多，但其單一成分抗腫瘤作用的研究仍然比較少，且作用機制尚不明確［1，2］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，富含半胱氨酸分泌蛋白(CRISPs)廣泛存在于一些爬行動物、軟體動物的毒液中，具有先天宿主免疫和離子通道抑制等多種功能。Natrin是從廣西眼鏡蛇蛇毒中分離得到的一種CRISPs［3］，具有抗脂質(zhì)過氧化、阻斷 Ca2+通道的作用［4，5］，但其抗腫瘤作用卻鮮有報道。2012年12月～2013年10月，我們觀察了Natrin對人卵巢癌SKOV3細胞凋亡的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌SKOV3細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞研究所，由廣西醫(yī)科大學(xué)細胞培養(yǎng)室傳代培養(yǎng);廣西眼鏡蛇毒凍干粉由廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所提供;多用電泳儀購于美國BIORAD公司，流式細胞分析儀購于美國BECKMAN COULTER公司。

1.2 方法

1.2.1 Natrin的分離與細胞培養(yǎng) 參照蔣興明等［6］的方法分離 Natrin，經(jīng) SDS-聚丙烯酞胺凝膠還原電泳檢測Natrin蛋白的分子量，其分子量為25 Ku，純度符合標(biāo)準(zhǔn)。SKOV3細胞用含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，生長旺盛的細胞每2～3 d傳代1次。

1.2.2 細胞生長抑制率測算 采用MTT法。取對數(shù)生長期的SKOV3細胞株，按每孔2.0×104接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，棄上清液。觀察組加入終濃度為1.25、6.25、12.5、62.5、125、200、250 mg/L的Natrin液100μL，對照組加入等體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，采用酶標(biāo)儀測定592 nm波長下各孔吸光度(A)值，計算抑制率、IC50。抑制率 =(A對照組－A觀察組)/A對照組×100%。

1.2.3 細胞凋亡形態(tài)觀察 取對數(shù)生長期的細胞，按每瓶5.0×105接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后，觀察組分別加入終濃度為6.25、12.5 mg/L的Natrin液3 mL，對照組加入等體積的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出細胞消化，離心，棄上清，PBS洗滌2次;3%戊二醛固定2 h以上，0.1 mol/L PBS洗滌3次;1%鋨酸固定2 h，0.1 mol/L PBS洗滌3次。梯度濃度乙醇、丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618浸透包埋，徠卡UC7超薄切片機超薄切片，醋酸鈾—檸檬酸鉛雙重染色，10 000倍透射電子顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)。

1.2.4 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術(shù)檢測。取對數(shù)生長期的細胞株，按每孔2.0×105接種于6孔板，待細胞貼壁后棄去舊培養(yǎng)液，觀察組加入終濃度為6.25、12.5、25.0、62.5 mg/L 的 Natrin 溶液200 μL/孔，每組設(shè)3個復(fù)孔，對照組加入等體積培養(yǎng)液。置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，消化收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次;4℃，1 000 r/min離心10 min;用結(jié)合緩沖液調(diào)整細胞為1.0×106/mL。取190μL細胞懸液置于流式管中，加入標(biāo)記有異硫氰酸熒光素(FITC)的磷酯酰絲氨酸結(jié)合蛋白V(Annexin V)5μL，碘化丙啶(PI)5μL，混勻室溫下避光孵育5 min，立即上流式細胞儀分析，根據(jù)AV-FITC/PI染色情況確定正常、早期凋亡、晚期凋亡或壞死細胞，計算細胞早、晚期凋亡率。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Natrin 對 SKOV3 細胞增殖的影響 1.25、6.25、12.5、62.5、125、200、250 mg/L 的 Natrin 作用 SKOV3 細胞24 h 生長抑制率分別為13.24% ±0.01%、22.60%±0.01%、47.94% ±0.01%、67.73% ±0.01%、80.21%±0.03%、87.88% ±0.01%、88.94% ±0.01%，不同濃度間比較，P均＜0.01。Natrin作用SKOV3細胞24 h的 IC50為26.13mg/L。

2.2 Natrin對SKOV3細胞凋亡形態(tài)的影響 觀察組出現(xiàn)了明顯的凋亡形態(tài)，核染色質(zhì)固縮成數(shù)個大小不等的塊狀，有些邊集，有些分散在核的中部;核膜褶皺，胞質(zhì)濃縮;細胞器正常且分布相對集中，胞質(zhì)中偶見空泡。對照組無明顯凋亡形態(tài)，核膜與細胞膜較完整，無內(nèi)陷、褶皺;核染色質(zhì)分布均勻，無固縮、邊集現(xiàn)象。見插頁Ⅲ圖5。

圖5 透射電鏡下觀察被Natrin作用24 h后SKOV3細胞的凋亡形態(tài)（×10 000）

2.2 Natrin對SKOV3細胞凋亡的影響 觀察組隨著Natrin濃度增加，早、晚期和總凋亡率逐漸增大，早期凋亡率均高于晚期凋亡率，P均 ＜0.01。見表1。

表1 Natrin對SKOV3細胞凋亡的影響(%，±s)

表1 Natrin對SKOV3細胞凋亡的影響(%，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與同濃度組早期凋亡率比較，#P＜0.01

組別 n 早期凋亡率 晚期凋亡率 總凋亡率觀察組3 3 1.15 ±0.16 2.01 ±0.49 3.16 ±0.64 6.25 mg/L 10.97 ±1.83* 5.16 ±0.40*# 16.10 ±1.44*12.5 mg/L 23.19 ±0.92* 8.60 ±0.66*#31.70 ±0.88*25.0 mg/L 31.58 ±1.46*20.38 ±1.22*# 51.90 ±0.41*62.5 mg/L 33.03 ±1.78*24.15 ±1.46*# 57.10 ±2.44*對照組

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在婦科惡性腫瘤中排第三位，但其病死率占婦科腫瘤的首位，對女性的生命安全造成嚴(yán)重威脅?；瘜W(xué)藥物治療卵巢癌作用確切，療效顯著，但不良反應(yīng)大、長期應(yīng)用易產(chǎn)生耐藥性等［7］。近年來，腫瘤學(xué)家們發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細胞凋亡密切相關(guān)［8～10］。許多抗腫瘤藥物通過干擾腫瘤細胞的生長、代謝、增殖等過程，最終觸發(fā)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，從而達到治療腫瘤的目的［11］。而且在誘導(dǎo)凋亡的過程中，凋亡細胞很快被體內(nèi)的巨噬細胞清除，周圍的炎癥反應(yīng)很少。

研究證實，蛇毒蛋白具有多種藥理活性，Natrin是從廣西眼鏡蛇毒中分離得到的，可能也具有潛在的抗腫瘤活性。研究發(fā)現(xiàn)，廣西眼鏡蛇毒蛋白Natrin在體外能抑制人肝癌SMMC-7721細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡［12］。Natrin的抗肝癌作用被證實，提示其很可能具有抗人卵巢癌的活性。本研究發(fā)現(xiàn)，在透射電鏡下觀察組細胞呈現(xiàn)典型的細胞凋亡形態(tài)，而對照組細胞則無明顯細胞凋亡形態(tài);隨著Natrin濃度的增加，人卵巢癌SKOV3細胞的生長抑制率和早晚期凋亡率均明顯增加，且早期凋亡率明顯高于晚期凋亡率，提示可將其開發(fā)成腫瘤細胞凋亡觸發(fā)型藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，Natrin作用SKOV3細胞24 h的IC50為26.13 mg/L，與單用順鉑時的IC50很接近［13，14］，表明SKOV3 細胞對 Natrin 較敏感。因此，選擇合適的給藥時間與較低的給藥濃度能有效誘導(dǎo)細胞凋亡，為其進一步開發(fā)成臨床抗腫瘤藥物提供了良好的條件。

總之，Natrin在一定濃度下能抑制人卵巢癌SKOV3細胞生長并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，而這種作用具有劑量依賴性。至于Natrin誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV3細胞凋亡的分子生物學(xué)機制和最佳給藥時間、給藥濃度等還有待進一步研究。

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