(宜興市人民醫(yī)院，江蘇宜興，214200)

阿霉素(ADR)屬于蒽醌類抗生素，被認為是最有效的蒽環(huán)類廣譜抗癌藥物之一。然而，ADR在抗腫瘤的同時具有嚴重的心臟毒性，臨床應用受到限制［1］。ADR的心臟毒性機制尚未完全明確，然而近期研究表明［2，3］，其心臟毒性與心肌組織大量的自由基生成和脂質過氧化引起心肌細胞凋亡有關。姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的天然色素，為姜黃的主要活性成分。姜黃素具有抗炎、保肝利膽、抗血脂、抗氧化、抗腫瘤及抗炎等諸多藥理作用［4］。近期研究［5，6］表明，姜黃素對缺血和炎癥引起的心臟功能損害具有保護作用。2013年5～6月，我們建立大鼠ADR急性心臟毒性模型，檢測心臟組織中丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性及凋亡相關蛋白Caspase-3和Bcl-2水平，以探討姜黃素對ADR致心臟損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 普通級雄性SD大鼠，體質量220～240 g，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。藥品:姜黃素(Sigma公司)，用含6%(體積分數(shù))乙醇和6%(體積分數(shù))聚乙二醇400的蒸餾水溶解;鹽酸多柔米星注射液(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)，采用生理鹽水稀釋。試劑:乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、肌酸激酶(CK)試劑盒、肌酸激酶同工酶(CKMB)試劑盒均購于寧波亞太生物技術公司，SOD試劑盒和MDA試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所;兔抗大鼠Caspase-3和Bcl-2多克隆抗體購自Cell Signaling公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白質分子量標準、Western blot封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒均來自碧云天生物技術研究所。其他均為AR級化學試劑。實驗儀器:751G-可見紫外分光光度計(上海分析儀器廠)，高速勻漿機(上海弗魯克流體機械制造有限公司)，Bio-Rad model 680酶標儀、電泳儀(美國 Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將40只大鼠隨機分為對照組、模型組和姜黃素低、中、高劑量組各8只。模型組和對照組每日給予生理鹽水0.02 mL/g灌胃，第5天分別腹腔注射等量生理鹽水、鹽酸ADR 20 mg/kg。姜黃素低、中、高劑量組造模前分別給予10、20、40 mg/kg姜黃素灌胃，1次/d，連續(xù)5 d;于第5天給藥1 h后腹腔注射鹽酸ADR 20 mg/kg，后繼續(xù)給藥2 d。

1.2.2 血清 LDH、CK、CKMB 測定 造模后72 h，戊巴比妥麻醉動物，腹腔靜脈取血;開胸取出心臟，將心臟組織置于－80℃超低溫冰箱中保存待用。按試劑盒方法，檢測血清LDH、CK、CKMB。

1.2.3 心臟組織中SOD活性及MDA水平檢測取心臟組織于冷生理鹽水中勻漿，按試劑盒方法進行操作，采用比色法檢測SOD活性及MDA水平。

1.2.4 心臟組織Caspase-3和Bcl-2蛋白檢測 采用免疫印跡法。提取心臟組織總蛋白，以BCA法進行蛋白定量。各取100μg上清進行SDS-PAGE電泳(濃縮膠50 g/L，分離膠150 g/L)，100 V轉移約120 min。取轉移后的硝酸纖維素濾膜(NC膜)，加1∶10稀釋的麗春紅儲存液，搖床室溫緩搖15 min，去離子水洗3 min×5次。將膜置入Western封閉液中，室溫搖床上緩搖封閉2 h，在搖床上快搖洗膜3 min×5次。加特異性一抗，兔抗鼠激活型Caspase-3(1∶1 000)、Bcl-2(1∶500)抗體。膜置于一抗中，4℃ 冰箱過夜孵育，TBST洗膜5 min×3次。分別加特異性二抗，堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG，膜置于二抗液內室溫下孵育2 h，TBST洗膜5 min×3次。然后TBS洗膜5 min×3次，置BCIP/NBT顯色液顯色。掃描蛋白印跡顯影圖，利用凝膠自動分析成像Image J軟件計算目的蛋白表達的灰度值，蛋白表達量以Caspase-3、Bcl-2和β-actin的光密度比值表示。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據以±s表示，組間比較采用one-way ANOVA分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素對大鼠血清心肌酶的影響 見表1。

表1 姜黃素對大鼠血清LDH、CK、CKMB水平的影響(n=8，U/L，±s)

表1 姜黃素對大鼠血清LDH、CK、CKMB水平的影響(n=8，U/L，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

組別LDH CK MDA對照組198.37 ±35.72 386.47 ± 59.62 535.59 ±63.27模型組 423.18 ±43.25*796.34 ±101.55*806.94 ±90.23*姜黃素低劑量組 351.26 ±31.57 565.20 ± 73.59#683.88 ±62.37#姜黃素中劑量組 289.84 ±26.60#512.37 ± 65.24△ 619.30 ±57.25△姜黃素高劑量組 234.42 ±29.93△ 505.87 ± 73.17△ 573.61 ±65.72△

2.2 姜黃素對大鼠心臟組織氧化應激的影響 見表2。

表2 姜黃素對大鼠心臟組織SOD活性及 MDA 水平的影響(n=8，±s)

表2 姜黃素對大鼠心臟組織SOD活性及 MDA 水平的影響(n=8，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 SOD(U/g prot) MDA(mol/g prot)189.41 ±38.60 2.80 ±0.80模型組 102.10 ±24.31* 6.53 ±1.62*姜黃素低劑量組 126.31 ±21.37# 4.95 ±1.47#姜黃素中劑量組 142.31 ±23.58# 3.92 ±1.30△姜黃素高劑量組 159.09±29.71△ 3.25±1.36對照組△

2.3 姜黃素對大鼠心臟組織Caspase-3和Bcl-2蛋白表達的影響 見表3。

3 討論

ADR可引起心肌損害，且前期研究發(fā)現(xiàn)，ADR引起心肌損害的組織學變化與人類心肌病心臟損害相似［2］。本研究采用大鼠構建ADR心肌損害模型，結果發(fā)現(xiàn)，姜黃素對ADR所致心肌損害具有保護作用，抑制血清中心肌酶水平的升高，減輕心臟組織的氧化應激，而且抑制心臟組織Caspase 3蛋白表達的升高，上調Bcl-2蛋白的表達。

表3 姜黃素對大鼠心臟組織Caspase 3及 Bcl-2 表達的影響(n=4，±s)

表3 姜黃素對大鼠心臟組織Caspase 3及 Bcl-2 表達的影響(n=4，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

Caspase-3 Bcl-2對照組組別0.13 ±0.03 0.79 ±0.21模型組 0.37 ±0.08* 0.11 ±0.02*姜黃素低劑量組 0.22 ±0.04# 0.47 ±0.08#姜黃素中劑量組 0.20±0.05△ 0.53±0.14△姜黃素高劑量組 0.17±0.02△ 0.73±0.17△

血清中LDH、CK和CKMB水平能夠反映心肌細胞的損傷，ADR引起心肌細胞損傷或者死亡，可導致血清中 LDH、CK和 CKMB水平顯著升高［7］。因此，通過測定上述血清心肌酶的活性，可以評價ADR引起的心肌細胞損傷程度以及藥物的保護作用。本研究結果顯示，ADR顯著升高了大鼠血清中LDH、CK和 CKMB活性，與前期研究結果相一致［8，9］。提示姜黃素對ADR導致的心肌損傷具有保護作用。

此外，ADR的心臟毒性與過量自由基的生成有關。ADR的半醌結構可引起線粒體呼吸鏈脫偶聯(lián)，誘導自由基的大量生成，而心肌組織中抗氧化酶不足以清除過量生成的自由基，最終導致心肌細胞脂質過氧化和細胞能量代謝紊亂［10～12］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，ADR導致心臟組織MDA水平升高，SOD活性降低，這進一步證實了氧化應激和自由基過量形成參與了 ADR引起的心臟毒性。然而，姜黃素對ADR致心臟組織MDA水平升高和SOD活性降低具有明顯的抑制作用，提示姜黃素的心肌保護作用與抑制ADR引起的氧化應激有關。

同時，機體內氧化應激與細胞凋亡有密切聯(lián)系［13～15］。當機體處于氧化應激狀態(tài)時，細胞內ROS水平相對升高，可啟動氧化應激鏈式反應，易于細胞膜上的各種不飽和脂肪酸及膽固醇反應，導致細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，ADR可致心臟組織凋亡蛋白Caspase-3蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達降低，而姜黃素顯著抑制了ADR導致的Caspase-3蛋白表達上調，并上調了Bcl-2蛋白表達。因此，我們推測姜黃素對ADR導致的大鼠心肌損傷具有保護作用，其保護作用的機制與減少心臟組織MDA過量生成、抑制氧化應激、減輕心肌細胞凋亡有關。

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