馬靜, 湯承, 岳華

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041)

雛鴨混合感染基因A型和基因C型鴨甲肝病毒研究

馬靜, 湯承, 岳華

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041)

研究了2013年四川地區(qū)某鴨場(chǎng)暴發(fā)的基因A型鴨甲肝病毒(DHAV-A)和基因C型鴨甲肝病毒(DHAV-C)的混合感染病例.疾病發(fā)生于20～25日齡雛鴨, 發(fā)病率25%～30%, 死亡率為20%～30%, 臨死前出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀, 病死雛鴨肝臟腫大, 出血.利用雙重RT-PCR從病死雛鴨的肝臟組織中同時(shí)檢測(cè)出DHAV-A和DHAV-C.這是四川省養(yǎng)鴨密集區(qū)第一次發(fā)現(xiàn)雛鴨混合感染DHAV-A和DHAV-C的情況.此外, 對(duì)2009～2012年四川省各養(yǎng)鴨密集區(qū)鴨甲肝炎流行情況做了調(diào)查.一共從四川省養(yǎng)鴨密集區(qū)采集312份疑似鴨肝炎樣本中檢測(cè)出120份鴨甲型肝病毒性肝炎.其中基因C型鴨肝炎陽性率為75%, 基因A型鴨肝炎僅為25%, 未發(fā)現(xiàn)基因A型和基因C型混合感染情況.結(jié)果說明2009～2012年我省鴨病毒性肝炎以基因C型鴨甲肝病毒為優(yōu)勢(shì)病原.2013年, 開始出現(xiàn)DHAV-A和DHAV-C混合感染病例.因此如何采取有效措施應(yīng)對(duì)其危害, 這應(yīng)該引起養(yǎng)鴨界及相關(guān)部門的高度重視.

A型鴨甲肝病毒; C型鴨甲肝病毒; 混合感染; 流行病學(xué)調(diào)查

鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)引起的雛鴨的一種傳染病,它以發(fā)病急、傳播迅速、肝臟發(fā)生病變和死亡率高為主要特點(diǎn)[1].DHV由星狀病毒科和小RNA病毒科成員組成,其中Ⅰ型DHV(DHV-1)屬于小RNA病毒科, 同時(shí)又被重新命名成鴨甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV),而Ⅱ型DHV(DHV-2)和Ⅲ型DHV(DHV-3)都被劃分成星狀病毒科[2-5].根據(jù)基因組的進(jìn)化分析, DHAV又被分為3個(gè)基因型, 基因A型(DHAV-A)、基因B型(DHAV-B)和基因C型(DHAV-C), 分別對(duì)應(yīng)原有的DHV-1、從臺(tái)灣分離的 NDHV和從韓國和中國分離的 NDHV.其中 DHAV-A和 DHAV-B之間無血清交叉反應(yīng), 而 DHAV-A和DHAV-C僅存在有限的血清交叉中和反應(yīng)[6-7].本實(shí)驗(yàn)室從疑似暴發(fā)肝炎的某鴨場(chǎng)病死雛鴨肝臟中分離出3株病毒, 經(jīng)雙重 RT-PCR方法鑒定及遺傳進(jìn)化分析, 確定為 DHAV-A和 DHAV-C混合感染.此外, 本實(shí)驗(yàn)采用雙重RT-PCR方法對(duì)四川省養(yǎng)鴨密集區(qū)采集的312份疑似鴨肝炎樣本進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果顯示, 120份病料檢測(cè)出鴨甲肝病毒, 其中基因C型鴨甲肝病毒占75%, 基因A型鴨甲肝病毒僅占25%.

1 材料與方法

1.1 病料

1.1.1 四川省資陽市疑似暴發(fā)鴨肝炎疾病的某鴨場(chǎng)送檢的3只25日齡病死雛鴨.同時(shí)在同一鴨場(chǎng)選取3只25日齡未發(fā)病的花邊鴨.

1.1.2 2009年～2012年四川省養(yǎng)鴨密集區(qū)采集疑似鴨肝炎肝臟樣本312份.

1.2 主要試劑

Trizol RNA提取試劑盒購自Invitrogen 公司; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海博瑞克公司; DNA MakerⅠ購自Tiangen公司; Taq DNA聚合酶購和pMD19-T vector試劑盒購自TaKaRa公司; 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和膠回收試劑盒購自北京天根生物有限公司; 其它試劑為國產(chǎn)分析純.

1.3 主要儀器

高速離心機(jī)centrifuge 5804(Eppendorf公司, 德國); 隔水式恒溫培養(yǎng)箱(齊欣公司, 中國上海); 核酸蛋白檢測(cè)儀DU800(Beckman公司, 美國); PCR儀: my cyclerTM, Bio-Rad公司, 美國; 凝膠成像系統(tǒng): Doc2000, Bio-Rad公司,美國; 恒溫水浴器(國華電器, 中國江蘇); 超純水儀Milli-Q(Millipore公司, 法國); 移液器(Eppendorf公司, 德國).

1.4 方法

1.4.1 樣本采集

分別無菌采集死亡和健康雛鴨以及送檢樣本的肝臟組織, 剪碎后立即放入液氮中, 待樣本完全冷凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存.

1.4.2 組織總RNA的提取及cDNA的合成

根據(jù)Trizol說明書分別提取雛鴨肝臟組織總RNA和采集樣本肝臟總RNA, 然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.4.3 雙重RT-PCR及測(cè)序

擴(kuò)增DHAV-A 3C、3D區(qū)域的引物P1、P2和DHAV-C 3D區(qū)域的引物P3、P4按參考文獻(xiàn)[8]報(bào)道設(shè)計(jì), 引物信息見表1, 引物均由上海生工生物工程有限公司合成.以雛鴨肝臟cDNA為模板, 用雙重RT-PCR方法檢測(cè)DHAV-A和DHAV-C.雙重RT-PCR的反應(yīng)體系按參考文獻(xiàn)[8].PCR產(chǎn)物用2%凝膠電泳, 膠回收試劑盒回收的目的片段與pMD-18T 連接, 轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 挑選含有氨芐青霉素(Amp+)的LB平板上的單菌落進(jìn)行菌落PCR, 陽性菌株送上海生工生物公司測(cè)序.

表1 引物信息Table 1 Information for primers

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷

2013年3月, 四川省資陽市某鴨場(chǎng)的20～25日齡花邊鴨暴發(fā)一種疾病, 發(fā)病率25%～30%, 死亡率為20%～25%.病鴨出現(xiàn)厭食、嗜睡、側(cè)臥、行走不穩(wěn)、部分角弓反張, 在發(fā)病后1～3h內(nèi)死亡.抗生素治療無效.剖檢可見死亡雛鴨的主要病變?cè)诟闻K, 表現(xiàn)為肝臟出血、腫大(見圖1), 而健康雛鴨肝臟剖檢無特征病變(見圖2).

2.2 病料中DHAV-A和DHAV-C的檢測(cè)

雙重RT-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示, 從病死雛鴨肝臟組織反轉(zhuǎn)錄cDNA中同時(shí)擴(kuò)增出了長約為259bp和194bp的特異性條帶, 測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相符.而對(duì)健康雛鴨肝臟組織反轉(zhuǎn)錄cDNA檢測(cè)的結(jié)果呈陰性, 結(jié)果見圖2.

圖1 死亡雛鴨肝臟出血、腫大Figure 1 The livers of died duckling swelling and hemorrhagic focus

圖2 雙重PCR檢測(cè)DHAV-A和DHAV-C檢測(cè)結(jié)果Figure 2.The result of amplification the DHAV-A and DHAV-C genes

2.3 采集樣本檢測(cè)

對(duì)2009～2012年間四川省養(yǎng)鴨密集區(qū)采集的312份疑似鴨肝炎樣本進(jìn)行雙重RT-PCR檢測(cè), 電泳結(jié)果顯示其中120份樣本肝臟組織反轉(zhuǎn)錄cDNA中擴(kuò)增出了長約為259bp或者194bp的特異性條帶, 測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相符.在這120份陽性樣本中, 基因C型鴨肝炎樣本為90份, 占75%; 基因A型鴨肝炎樣本為30份, 占25%.部分檢測(cè)電泳結(jié)果見圖3.

圖3 采集樣本的部分雙重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Figure 3 Detection of the clinical samples by duplex RT-PCR

3 討論

1945年DHAV-A被首次報(bào)道于美國長島[1].直到現(xiàn)在DHAV-A仍然是對(duì)世界范圍養(yǎng)鴨業(yè)的嚴(yán)重的威脅.近年來DHAV-C作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的基因型, 在韓國和中國廣泛流行[9].2002年以前, 我國主要流行的是DHAV-A,但是近幾年的報(bào)道顯示我國同時(shí)流行著DHAV-A和DHAV-C[10-11].本實(shí)驗(yàn)室前期證明, 2009年, 四川省鴨病毒性肝炎以基因C型鴨甲型肝炎為主[8].在本實(shí)驗(yàn)中, 我們檢測(cè)了2009～2012年間四川省養(yǎng)鴨密集區(qū)采集312份疑似鴨肝炎樣本, 檢測(cè)出 120份鴨甲型肝病毒性肝炎.其中 DHAV-A陽性率為 25%, 而 DHAV-C陽性率為 75%.DHAV-C的陽性率遠(yuǎn)高于DHAV-A, 說明DHAV-C已成為我省鴨甲肝炎的優(yōu)勢(shì)病原, 且比例遠(yuǎn)高于我國的其他省份.這一現(xiàn)象應(yīng)該引起我省養(yǎng)鴨界及有關(guān)部門的高度重視, 采取有效措施控制本病的流行.

前期大量的流行病學(xué)資料顯示, DHAV-A和DHAV-C可以在同一區(qū)域同時(shí)流行[12-14], 但是并沒有混合感染的報(bào)道.至2013年4月, Lin-Lin Chen等人首次報(bào)道了DHAV-A和DHAV-C混合感染雛鴨的情況[15].本文通過雙重RT-PCR技術(shù)從死亡雛鴨肝臟cDNA中檢測(cè)出了DHAV-A和DHAV-C, 由此確診2013年3月, 四川省資陽市該鴨場(chǎng)雛鴨暴發(fā)的疾病由DHAV-A和DHAV-C混合感染所致.

在Lin-Lin Chen等人的研究中顯示在中國DHAV-A和DHAV-C混合感染情況很嚴(yán)重, 但是在這之前未發(fā)現(xiàn)任何關(guān)于混合感染的報(bào)道, 可見DHAV-A和DHAV-C混合感染這種現(xiàn)象是新出現(xiàn)的并且蔓延非常迅速.在本研究中雖然檢測(cè)的樣本數(shù)量有限, 但是結(jié)果清楚地表明三個(gè)樣本都同時(shí)感染了DHAV-A和DHAV-C, 說明我省也已經(jīng)開始出現(xiàn)了DHAV-A和DHAV-C混合感染情況, 這給我省的養(yǎng)鴨界帶來了重要的啟示.

四川省是我國主要的養(yǎng)鴨區(qū), 鴨病毒性肝炎是嚴(yán)重影響著養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的重要疫病.本試驗(yàn)對(duì)四川省不同地區(qū)養(yǎng)鴨密集區(qū)采集的樣本進(jìn)行DHAV檢測(cè), 揭示了四川省DHAV的流行主要以DHAV-C為主, 同時(shí)首次發(fā)現(xiàn)了四川省出現(xiàn)了DHAV-A和DHAV-C混合感染的現(xiàn)象, 說明混合感染已經(jīng)在我省開始出現(xiàn), 并可能出現(xiàn)蔓延.這對(duì)我省養(yǎng)鴨區(qū)鴨病毒性肝炎的防控具有重要的意義.

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Diagnosis of simultaneously infection of duck hepatitis A virus genotype A and duck hepatitis A virus genotype C in duckling

MA Jing,TANG Cheng,YUE Hua
(College of Life Science & Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

Duck virus hepatitis (DHV) is a fatal and rapidly spreading disease in young duckling.The major pathologic change in infected ducklings is hepatitis.Case of simultaneous infection of DHAV-A and DHAV-C outbreak in ducklings were reported.Twenty to twenty five day old ducklings showed about 25 to 30% morbidity and 20 to 30% mortality.The dying ducklings showed neurological symptoms and the liver of died ducklings swelling and hemorrhagic focus.The fragments of DHAV-A and DHAV-C were specific amplified by duplex RT-PCR.This is the first report on the presence of simultaneous infection of these two hepatitis virus in the ducklings in Sichuan province.In addition, the epidemiological survey of duck hepatitis A virus was investigated covering Sichuan duck concentration areas between 2009 and 2012 .120 duck hepatitis A viral hepatitis were collected from 312 clinical samples, and DHAV-C positive rate of 75%, DHAV-A was only 25%.The results illustrated the dominant pathogen was DHAV-C in Sichuan province.The presence of simultaneous infection of these two hepatitis virus were first reported in the ducklings in Sichuan province in 2013.Therefore, close attention should be paid to how to take effective measures to deal with the harm.

duck hepatitis A virus genotype A; genotype C; simultaneous infection; epidemiological investigation

S852.65

A

1003-4271(2014)02-0192-05

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.02.06

2013-11-01

岳華(1963-), 女, 教授, E-mail:yhua900@163.com.

“十二五”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA101304)