陳 濤，張漫莉，李晶虹，吳程雨，趙輔昆，陳 瑋

（浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州310018）

響應(yīng)面法優(yōu)化重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)纖維素酶EGA的研究

陳 濤，張漫莉，李晶虹，吳程雨，趙輔昆，陳 瑋

（浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州310018）

通過響應(yīng)面優(yōu)化法（response surface methodology，RSM）對分泌表達纖維素酶FGA重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。利用Plackett-Burman實驗設(shè)計對淀粉、酵母粉、蛋白胨等8個因素對枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶FGA的顯著影響與否進行評估分析，篩選得到淀粉、酵母粉和MgSO4·7H2O為3個顯著影響的因素，再利用Box-Behnken實驗設(shè)計對這3個因素進行進一步優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基的配比為淀粉21 g/L，酵母粉11.26 g/L，蛋白胨25 g/L，MgSO4·7H2O 1.52 g/L，KH2PO40.395 g/L，NaCl 3.25 g/L，CaCl20.1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/ L。在最優(yōu)條件下，利用小型發(fā)酵罐對重組菌進行擴大培養(yǎng)，其最高酶活力達到1 264 U/L。

纖維素酶FGA；枯草芽孢桿菌；響應(yīng)面優(yōu)化；發(fā)酵

0 引 言

纖維素是由β-1′4-糖苷鍵連接的多聚葡萄糖，廣泛地分布于自然界中，如秸稈稻草、木材及各類廢棄紙張等都是纖維素的豐富來源。同時，纖維素又是自然界中分布最為廣泛的可再生資源，通過光合作用每年可產(chǎn)生超過100億t纖維素物質(zhì)貯存于植物干物質(zhì)內(nèi)。然而，這巨大的資源寶庫還未被有效開發(fā)與利用。通過生物降解的方法能有效地將纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化成簡單糖，進而再發(fā)酵生產(chǎn)醇類物質(zhì)，可作為一種潔凈的可再生資源［1-4］。

纖維素的生物降解體系包含了各種組分的纖維素酶（cellulase）［5-6］，其中最主要的為內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶（endo-1，4-β-glucanase，F(xiàn)C3.2.l.4）、外切β-1，4-葡聚糖酶（exo-1，4-β-D-glucannase，F(xiàn)C3.2.1.91）和β-1，4-糖苷酶（β-1，4-glucosidase，F(xiàn)C3.2.1.21）。通過各種酶的協(xié)同作用可將纖維素酶徹底降解成單糖。因此，纖維素酶的獲取是有效利用纖維素的關(guān)鍵之一。

纖維素酶FGA是由福壽螺胃液中分離出的共生菌株BaciLLus sp.Strain AC-1所產(chǎn)的一種纖維素內(nèi)切酶。該酶具有較好的熱穩(wěn)定性且在酸性條件下相對穩(wěn)定，有較好的工業(yè)應(yīng)用前景［7］。在前期工作中，利用了枯草芽孢桿菌［8］對其進行了重組表達，在此基礎(chǔ)上，本文利用相應(yīng)面法［9-10］對已構(gòu)建的重組菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行了進一步優(yōu)化，并進行了小規(guī)模發(fā)酵放大實驗，為大規(guī)模生產(chǎn)纖維素酶FGA提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

重組枯草芽孢桿菌p AUsp-ega/WB700，由本實驗室構(gòu)建保存。

1.1.2 試劑

酵母粉、蛋白胨購自O(shè)XOID公司，羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購自Sigma公司，其余試劑均為國產(chǎn)試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L。

枯草芽孢桿菌基礎(chǔ)表達培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/ L，酵母粉10 g/L，可溶性淀粉20 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl20.1 g/L，NaCl 5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)操作

將低溫保存的p AUsp-ega/WB700甘油菌在的LB培養(yǎng)基固體平板上進行劃板培養(yǎng)12 h。挑取單個菌落接種至含3 m L的LB培養(yǎng)基的試管中，在37℃，200 r/min搖床中培養(yǎng)8～12 h，以1∶100的比例轉(zhuǎn)接至含50 m L LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于37℃，200 r/min搖床培養(yǎng)搖床培養(yǎng)24 h。收集發(fā)酵液于4℃，5 000 r/min離心5 min收集上清液，測定纖維素FGA酶活力。為保持菌株質(zhì)粒穩(wěn)定性，各級培養(yǎng)基中均含有終濃度為50μg/m L硫酸卡納霉素（Kanamycin）。

1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)操作

將篩選出的p AUsp-ega/WB700單克隆菌株先接種至含的3 mL的LB試管中，在37℃，200 r/min的搖床培養(yǎng)8～12 h；再按1∶100的比例接種至含50 mL LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，在37℃，200 r/min培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)接至含5 L優(yōu)化培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度為37℃，p H為7.0，轉(zhuǎn)速800 r/min，通氣量為10 L/min的穩(wěn)定條件進行發(fā)酵培養(yǎng)，并間隔一定時間提取適量發(fā)酵液，離心取上清液測定酶活力。

1.2.3 纖維素酶FGA酶活力測定

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）檢測法［11］：先將羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶于20 mM的p H 6.5的磷酸鈉緩沖液中，配成1%（w/v）的溶液；取180μL 1%的CMC-Na于65℃條件下預(yù)熱5 min；加入20 μL纖維素酶FGA酶液，在65℃進行酶活反應(yīng)10 min；然后加入500μL DNS試劑煮沸5 min終止反應(yīng)；迅速冷卻并加入500μL dd H2O；利用分光光度計檢測520 nm吸光值。以滅活的酶液進行空白對照。

酶活力定義：在羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）檢測法中定義一個酶活力單位為1 min水解產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量。

1.2.4 Plackett-Burman實驗

根據(jù)前期單因素實驗結(jié)果對包含空白在內(nèi)的共9個因素分別選取高水平（用“1”表示）和低水平（用“-1”表示）進行的Plackett-Burman實驗設(shè)計，各因素值見表1。

表1 PIackett-Burman實驗設(shè)計

1.2.5 Box-Behnken實驗

在Plackett-Burman實驗設(shè)計的基礎(chǔ)上，對其中顯著影響產(chǎn)酶活力的因素重新編號，分別選取3個水平（高水平用“1”表示，中水平用“0”表示，低水平用“-1”表示）進行Box-Behnken實驗設(shè)計分析，詳細取值見表2。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計

2 結(jié) 果

2.1 Plackett-Burman實驗設(shè)計結(jié)果

按表1的取值進行Plackett-Burman實驗結(jié)果見表3。

表3 PIackett-Burman實驗結(jié)果

表3的結(jié)果通過Design Fxpert 7.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。當P值小于0.05時，該因素為顯著影響因素，由分析結(jié)果可知，A、B、H為3個顯著影響因素。R2（調(diào)整）為96.21%，表示此模型可以解釋96.21%的以上實驗結(jié)果，且可靠。

2.2 Box-Behnken實驗設(shè)計結(jié)果

Box-Behnken實驗數(shù)據(jù)結(jié)合軟件分析的結(jié)果見表4和表5，所選取的3個因素中各因素的交互作用見圖1-3圖。

等高線圖越接近橢圓，說明這兩個因素之間的交互作用顯著，反之，若等高線圖接近圓形則說明這兩個因素之間的交互作用不顯著。由圖1-圖3的響應(yīng)面和等高線圖可以直觀地反映出各因素之間的交互作用，其中，淀粉和酵母粉之間的交互作用最顯著。而圖1-圖3的響應(yīng)面立體顯示的頂點即為產(chǎn)酶量的最大值，該頂點的坐標值則為對應(yīng)最大產(chǎn)酶時各因素的取值，分別是A=0.2，B=0.08，C= 0.03，對應(yīng)濃度為可溶性淀粉21 g/L，酵母粉11.26 g/L，MgSO4·7H2O 1.52 g/L，獲得最優(yōu)產(chǎn)產(chǎn)酶量為1 052 U/L。

表4 Box-Behnken實驗數(shù)據(jù)

表5 Box-Behnken實驗數(shù)據(jù)軟件分析結(jié)果

圖1 淀粉和酵母粉影響產(chǎn)酶量的響應(yīng)和等高線

圖2 淀粉和MgSO4·7H2O影響產(chǎn)酶量的響應(yīng)和等高線

圖3 酵母粉和MgSO4·7H2O影響產(chǎn)酶量的響應(yīng)和等高線

2.3 發(fā)酵實驗

在響應(yīng)面優(yōu)化的基礎(chǔ)上采用小型發(fā)酵罐對重組菌進行擴大培養(yǎng)?？刂茰囟葹?7℃、利用稀HCl和NaOH控制發(fā)酵過程p H為7，恒定轉(zhuǎn)速為800 r/ min，通氣量為10 L/min。取不同時間點檢測發(fā)酵液菌體密度和上清酶活力其結(jié)果如圖4示。

圖4 發(fā)酵時間與菌體生長密度和纖維素酶FGA產(chǎn)酶活力的關(guān)系曲線

菌體的生長在8 h內(nèi)呈現(xiàn)對數(shù)增長的趨勢，同時纖維素酶活力快速增長；發(fā)酵至8 h時達到最大產(chǎn)酶量1 264 U/L。之后，菌體生長逐漸進入平臺期，發(fā)酵體系中蛋白水解酶的逐漸積累，纖維素酶FGA被降解，酶活力持續(xù)降低。

3 結(jié) 論

纖維素酶作為一種高效的生物催化劑，其應(yīng)用主要集中在飲料業(yè)，發(fā)酵、釀造工業(yè)，飼料工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)中，除此之外，纖維素酶在糖化發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的領(lǐng)域也有重要的應(yīng)用。本文通過響應(yīng)面優(yōu)化法對重組枯草芽孢桿菌pAUsp-ega/WB700產(chǎn)纖維素酶FGA進行發(fā)酵培養(yǎng)基配比進行優(yōu)化，通過Plackett-Burman實驗設(shè)計，從各培養(yǎng)基組分中篩選出著影響因素為淀粉、酵母粉和MgSO4·7H2O。并對這3個因素進一步使用Box-Behnken實驗設(shè)計方案，結(jié)合軟件分析，確定搖瓶培養(yǎng)的最優(yōu)產(chǎn)酶時各因素的取值分別為淀粉21 g/L，酵母粉11.26 g/L，蛋白胨25 g/L，MgSO4·7H2O 1.52 g/L，KH2PO40.395 g/L，NaCl 3.25 g/L，CaCl20.1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L。在此基礎(chǔ)上，采取發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)，相比普通的搖瓶實驗只能控制體系的溫度和轉(zhuǎn)速，發(fā)酵實驗過程中還可以精準的控制體系的p H、溶氧量和營養(yǎng)成份，發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶FGA的最高酶活力可達1264 U/L，相比原始菌種的產(chǎn)酶活力提高了6倍［12］，對提高纖維素酶表達量，廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。

參考文獻：

［1］Zhu W，Wang H，Lu Y，et al.Functional characteristics and diversity of a novel lignocelluloses degrading composite microbial system with high xylanase activity［J］.Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，20（2）：254-264.

［2］Fukuoka A，Dhepe P L.Catalytic conversion of cellulose into sugar alcohols［J］.Angewandte Chemie International Fdition，2006，45（31）：5161-5163.

［3］Taherzadeh M J，Karimi K.Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production：a review［J］.International Journal of Molecular Sciences，2008，9（9）：1621-1651.

［4］Alvira P，Tomás-PejóF，Ballesteros M，et al.Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis：a review［J］. Bioresource Technology，2010，101（13）：4851-4861.

［5］Zhang Y H P，Lynd L R.Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose：Noncomplexed cellulase systems［J］.Biotechnology and Bioengineering，2004，88（7）：797-824.

［6］Fveleigh D F，Mandels M，Andreotti R，et al.Measurement of saccharifying cellulase［J］.Biotechnology for Biofuels，2009，2（1）：1-8.

［7］Irshad M N，Anwar Z，But H I，et al.The industrial applicability of purified cellulase complex indigenously produced by trichoderma viride through solid-state bioprocessing of agro-industrial and municipal paper wastes［J］.BioResources，2012，8（1）：145-157.

［8］李 明，雙 寶，李海濤，等.枯草芽孢桿菌的研究與應(yīng)用［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，40（9）：111-114.

［9］Ba D，Boyacl I·H.Modeling and optimization i：usability of response surface methodology［J］.Journal of Food Fngineering，2007，78（3）：836-845.

［10］Trupkin S，Levin L，F(xiàn)orchiassin F，et al.Optimization of a culture medium for ligninolytic enzyme production and synthetic dye decolorization using response surface methodology［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2003，30（12）：682-690.

［11］張漫莉，耿新偉，王夢婷，等.纖維素酶FGA基因在枯草芽孢桿菌中的表達及其產(chǎn)物性質(zhì)研究［J］.浙江理工大學(xué)學(xué)報，2013，30（3）：389-393.

［12］Li Y H，Ding M，Wang J，et al.A novel thermoacidophilic endoglucanase，ba-ega，from a new cellulose-degrading bacterium，baciLLus sp.Ac-1［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2006，70（4）：430-436.

Research on CeIIuIase EGA Production through Optimization and Recombination of BaciIIus SubtiIis Based on Response Surface MethodoIogy

CHEN Tao，ZHANG Man-Li，LI Jing-hong，WU Cheng-yu，ZHAO Fu-kun，CHEN Wei
（School of Life Science，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

Response Surface Methodology was used to optimize the fermentation conditions for secretory expression cellulose FGA and recombination of bacillus subtilis.Plackett-Burman experimental design was adopted to evaluate and analyze obvious effects of 8 factors（including starch，yeast powder and peptone）on producing cellulase FGA by bacillus subtilis.3 factors with obvious effects were screened out：starch，yeast powder and MgSO4·7H2O.Then，Box-Behnken experimental design was used to further optimize the 3 factors.Finally，the ratio of optimal culture medium was confirmed as follows：starch 21 g/ L，culture medium11.26 g/L，peptone 25 g/L，MgSO4·7H2O 1.52 g/L，KH2PO40.395 g/L，NaCl 3.25 g/L，CaCl20.1 g/L and FeSO4·7H2O 0.005 g/L.Under the optimal conditions，a small fermentation tank was used to enlarge cultivation of recombinant bacteria.The highest enzyme activity reached 1 264 U/L.

cellulase FGA；bacillus subtilis；response surface methodology；fermentation

Q786

A

（責任編輯：許惠兒）

1673-3851（2014）04-0451-05

2013-12-27

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新項目（2013R406021）

陳 濤（1988-），男，浙江湖州人，碩士研究生，主要從事分子生物學(xué)和微生物發(fā)酵的研究。

陳 瑋，電子郵箱：cw@zstu.edu.cn