繆紅梅 章浙忠 駱 豐 王文文 浙江省中醫(yī)院檢驗科 杭州 310006

槲寄生內(nèi)生真菌發(fā)酵液抗腫瘤作用機制研究

繆紅梅 章浙忠 駱 豐 王文文 浙江省中醫(yī)院檢驗科 杭州 310006

目的 觀察槲寄生內(nèi)生真菌抗腫瘤活性菌株發(fā)酵液的抗腫瘤作用機制。方法 利用實時細胞分析系統(tǒng)（RT-CES）對該菌株發(fā)酵液作用于細胞群落的整體生物學功能進行實時檢測，構(gòu)建發(fā)酵液作用效果的“細胞指紋圖譜”，推斷發(fā)酵液可能的抗腫瘤作用機制；透射電鏡、DNA瓊脂糖凝膠電泳和流式細胞術(shù)檢測該菌株發(fā)酵液誘導的腫瘤細胞凋亡作用。結(jié)果 槲寄生內(nèi)生真菌發(fā)酵液具有誘導腫瘤細胞凋亡效應(yīng)。結(jié)論 發(fā)酵液的抗腫瘤作用機制可能通過抑制微管解聚使腫瘤細胞有絲分裂終止，促進腫瘤細胞凋亡，或通過誘導腫瘤細胞凋亡抑制其生長，從而導致細胞死亡。

內(nèi)生真菌；發(fā)酵液；抗腫瘤；細胞凋亡

惡性腫瘤是全球性的公共健康問題。21世紀初我國每年惡性腫瘤新發(fā)病例約為180～200萬，死亡140～150萬，為2010年我國城市居民死亡原因第1位，農(nóng)村居民死亡原因第2位[1]。惡性腫瘤對人類的威脅日益突出的今天，天然抗癌藥物的合成具有無法比擬的優(yōu)越性，是今后研究的重點方向。內(nèi)生菌長期與植物共生，通過真核細胞進行初步篩選，可能產(chǎn)生多種全新的生物活性物質(zhì)，如抗癌活性物質(zhì)。筆者利用實時細胞分析系統(tǒng)（RT-CES）對槲寄生內(nèi)生真菌抗腫瘤活性菌株發(fā)酵液的抗腫瘤機制進行初步研究，報道如下。

1 實驗材料

1.1 儀 器 超凈工作臺（型號：SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（型號：GNP-9160，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；細胞培養(yǎng)箱（型號：303309-1503，Thermo Electron Corporation）；高速離心機（Eppendorf）；流式細胞儀（Beckman，F(xiàn)rance）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（京市六一儀器廠DYY-6B型）；96X Device（ACEA BioSciences INC，San Diego，US）；透射電鏡（型號：H-7650，日本HITACHI公司）；LEICA超薄切片機（EM UC7）；ACEA RT-CESTM分析儀（ACEA BioSciences INC，San Diego，US）。

1.2 試 劑 PBS（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號100923）；培養(yǎng)基：DMEM/RPMI 1640+10%FBS+ 1%P/S（DMEM/RPMI 1640購自Hyclone，F(xiàn)BS購自GIBCO，Penicillin-Streptomycin購自Hyclone)；0.05%胰蛋白酶（購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；細胞凋亡DNA Ladder檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；DNA Ladder Marker（Takara寶生物工程有限公司）。

1.3 細 胞 細胞株A549：非小細胞肺癌細胞，購自美國模式菌種收集中心（ATCC）。

1.4 內(nèi)生真菌發(fā)酵液的制備 搖床發(fā)酵：50mL察式液體培養(yǎng)基裝于100mL錐形瓶中，取保種管中的菌株的菌絲接種于液體培養(yǎng)基中，27℃，125rpm搖床培養(yǎng)，第6天將發(fā)酵液-20℃保存?zhèn)溆?。凍?d以上解凍，將菌絲過濾，發(fā)酵液濃縮備用。

2 實驗方法

2.1 RT-CES檢測 從培養(yǎng)箱中取出細胞，用PBS液清洗2次，用0.05%胰蛋白酶溶液消化，加入培養(yǎng)基終止消化，將細胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000rpm離心5min，去除上清，加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，配制成適當濃度的細胞懸液。細胞生長18～22h后，待細胞信號值達到0.5～1.0時，將細胞置于無血清培養(yǎng)基中進行血清饑餓，2h后加入發(fā)酵液1μL，對照加去離子水10μL，每個樣品3個復孔，每隔15min檢查1次，連續(xù)72h觀察。

2.2 透射電鏡觀察發(fā)酵液處理的腫瘤細胞

2.2.1 固 定 取含10%BCS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HeLa細胞至對數(shù)期，24h后取菌株ⅠA-4-2最佳發(fā)酵時間、最佳劑量的發(fā)酵液加至細胞培養(yǎng)液中，待觀察至具有明顯使細胞變化時收集細胞，以正常腫瘤細胞作對照，兩個樣品在2.5%的戊二醛溶液中4℃條件下固定過夜。反復漂洗固定后，用乙醇溶液進行脫水處理。

2.2.2 切片觀察 將進過滲透處理的樣品分裝到0.5mL的epprndorf管中包埋起來，70℃加熱過夜，即得到包埋好的樣品。樣品在LEICA超薄切片機切片，獲得50～70nm的切片，該切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色15min，即可在H-7650型透射電鏡（日本HITACHI公司）中觀察。

2.3 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡 含10% BCS的RPMI1640培養(yǎng)液20mL培養(yǎng)HepG-2細胞至對數(shù)期，37℃，5%CO2條件培養(yǎng)。24h后取菌株ⅠA-4-2最佳發(fā)酵時間、最佳劑量的發(fā)酵液加至細胞培養(yǎng)液中，劑量分別為10、50、100、200μL，作用時間分別為4h和20h。之后用凱基細胞凋亡DNA Ladder檢測試劑盒測定細胞凋亡。

2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 含10%BCS的RPMI 1640培養(yǎng)液20mL培養(yǎng)HepG-2細胞至對數(shù)期，37℃，5%CO2條件培養(yǎng)。24h后取菌株ⅠA-4-2最佳發(fā)酵時間、最佳劑量的發(fā)酵液加至細胞培養(yǎng)液中，劑量分別為50、200μL，作用時間分別為4h和20h。之后做流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

3 結(jié) 果

3.1 RT-CES對發(fā)酵液處理細胞檢測結(jié)果 通過發(fā)酵液對A549細胞株的細胞指紋圖譜構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)對細胞的細胞學圖譜呈濃度梯度依賴。其中發(fā)酵液對A549細胞具有明顯的瞬間正應(yīng)激作用（見圖1）。與已知作用機制小分子化合物進行圖譜匹配，發(fā)酵液A549細胞動力學模型與影響細胞周期的化合物圖譜具有相似性（見圖2）。

圖1 發(fā)酵液對A549細胞株的細胞指紋圖譜

圖2 已知作用機制的小分子化合物的功能標識圖譜

圖3 透射電鏡對細胞的觀察結(jié)果

圖4 凋亡細胞梯狀DNA條帶率

圖5 劑量50μL，作用時間4h

圖6 劑量200μL，作用時間4h

圖7 劑量50μL，作用時間20h

圖8 劑量200μL，作用時間20h

3.2 透射電鏡對調(diào)亡細胞觀察結(jié)果 通過透射電鏡可觀察到經(jīng)發(fā)酵液處理過的HepG-2細胞呈現(xiàn)早期凋亡特征：胞漿濃縮、成空泡狀，核皺縮及碎裂，見圖3（插頁）。

3.3 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測凋亡細胞結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳顯示，發(fā)酵液適宜濃度作用于HepG-2細胞20h，可見凋亡細胞典型的梯狀DNA條帶，見圖4（插頁）。

3.4 流式細胞術(shù)檢測凋亡細胞的結(jié)果 不同劑量的發(fā)酵液不同時間處理細胞后上機檢測，結(jié)果顯示，劑量50μg作用4h后，HepG-2細胞存活率為94.5%，低于空白的99.8%，劑量200μg作用4h后，HepG-2細胞存活率為83.8%，低于空白的87.9%，劑量50μg HepG-2細胞凋亡率優(yōu)于劑量200μg（P＜0.05）；劑量劑量50μg作用20h后，HepG-2細胞存活率為87.8%，低于空白的97.5%，劑量200μg作用20h后，HepG-2細胞存活率為51.2%，低于空白的90.9%；劑量200μg HepG-2細胞凋亡率明顯優(yōu)于50μg劑量（P＜0.05）。因此，推測細胞凋亡率與劑量和作用時間具有一定的量效時效關(guān)系，且隨發(fā)酵液濃度的增加，HepG-2細胞死亡或晚期凋亡率也逐漸增加。見圖5～8（插頁）。

4 討論

RT-CES系統(tǒng)能全面監(jiān)控細胞群落，其檢測結(jié)果被證明與其他傳統(tǒng)分析得到結(jié)果一致[1-3]。RT-CES動態(tài)監(jiān)測提供了許多在藥物活性作用下細胞變化過程的信息，目前實時細胞電子分析技術(shù)已廣泛并成功地運用于抗腫瘤藥物篩選和研制[1]、抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選和研究[2]、藥物毒理學分析[3]、G-蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)疾病藥物的篩選和研究等[4-6]。大量與醫(yī)學前沿相關(guān)的課題如器官移植、惡性腫瘤防治等也都需要在細胞水平上深入研究才能得到根本性的解決[7-8]。

我們采用RT-CES系統(tǒng)對槲寄生內(nèi)生真菌發(fā)酵液對腫瘤細胞的作用進行了初步探討。與已知化合物功能圖譜比對分析，發(fā)現(xiàn)該發(fā)酵液與影響細胞周期的小分子化合物的功能圖譜相似，由此推斷發(fā)酵液的細胞水平生物學作用機制為影響Ca2+離子通道、細胞周期或細胞凋亡；與紫杉醇的功能圖譜的相似，進一步推斷發(fā)酵液的抗腫瘤作用機制是通過抑制微管解聚使腫瘤細胞有絲分裂終止促進腫瘤細胞凋亡，最后導致腫瘤細胞死亡。這個推斷與我們之后通過具體分析該發(fā)酵液的活性物質(zhì)是小分子類物質(zhì)是一致的。

腫瘤的發(fā)生不僅與細胞的異常增殖和分化有關(guān)，也與細胞凋亡的異常有關(guān)[9]。細胞凋亡是一種特殊的死亡方式，涉及一系列凋亡基因的激活、表達以及調(diào)控。生物學特征表現(xiàn)為一些形態(tài)學變化和生物化學變化[10]。本實驗采用電鏡技術(shù)對槲寄生發(fā)酵液作用HepG-2細胞進行凋亡形態(tài)學觀察，可見發(fā)酵液處理組細胞胞漿濃縮、核皺縮，有空泡化現(xiàn)象。通過瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色呈現(xiàn)為梯狀條帶（DNA Ladder），并據(jù)此判斷細胞凋亡產(chǎn)生。

Annexin V-FITC/PI雙染色法是目前檢測細胞凋亡和區(qū)分壞死細胞特異性的較好的方法[11]，能比PI染色法更靈敏的檢測到早期的凋亡細胞。Annexin V可與細胞凋亡早期的胞膜結(jié)合[12]。碘化丙啶（PI）能夠透過凋亡中晚期的細胞和死細胞細胞膜而使細胞核染紅。本研究表明，細胞凋亡率與劑量和作用時間具有一定的量效時效關(guān)系。同時我們發(fā)現(xiàn)隨濃度的增加，死亡或晚期凋亡率也逐漸增加，表明發(fā)酵液通過誘導HepG-2細胞凋亡抑制其生長，死亡也可能于此有關(guān)，其具體機制有待進一步研究。

我們利用實時細胞分析系統(tǒng)（RT-CES）對菌株ⅠA-4-2的發(fā)酵液作用于細胞群落的整體生物學功能（細胞增殖、凋亡、毒性和細胞周期等）進行實時檢測，從“細胞指紋圖譜”中我們可以發(fā)現(xiàn)菌株ⅠA-4-2發(fā)酵液可能能夠通過影響Ca2+離子通道、細胞周期及誘導細胞凋亡發(fā)揮藥效；此外，發(fā)酵液作用與陽性藥物紫杉醇的功能圖譜也明顯相似，進一步推斷該發(fā)酵液可能還能夠通過抑制微管解聚使腫瘤細胞有絲分裂終止從而促進腫瘤細胞凋亡。另外電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)發(fā)酵液處理后HepG-2細胞表現(xiàn)為核固縮、邊集呈現(xiàn)早期凋亡特征；DNA凝膠電泳呈現(xiàn)為典型的梯狀條帶（DNA Ladder）；因此，從多個角度確證發(fā)酵液具有誘導腫瘤細胞凋亡效應(yīng)。通過本研究，我們推斷發(fā)酵液的抗腫瘤作用機制是：通過抑制微管解聚使腫瘤細胞有絲分裂終止促進腫瘤細胞凋亡，最后導致腫瘤細胞死亡；通過誘導腫瘤細胞凋亡抑制其生長，從而導致細胞死亡。但其具體機制還有待于進一步研究。

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The Mechanism Underlying the Anti-tumor Effect of Mistletoe Endophytic Fungi Fermentation Broth

MIAOHongmei,ZHANG Zhezhong,LUO Feng,WANG Wenwen. Clinical Laboratory,Zhejiang Provincial Hospital of TCM,Hangzhou(310006),China

Objective To explore the underlying mechanism of the anti-tumor effect of mistletoe endophytic fungi fermentation broth.Methods The whole biological function of the fermentation broth acting on colonies of cells was detected with real-time cell analysis system（RT-CES）,and the"cell fingerprint"of the effect was structured in order to speculate the possible antitumor mechanism.At the same time,the inhibitory effect on tumor cells was observed by transmission electron microscopy,DNA agarose gel electrophoresis,and flow cytometry.Results Mistletoe endophytic fungi fermentation broth induced apoptosis of tumor cells.Conclusion The mechanism of anti-tumor effect of mistletoe endophytic fungi fermentation broth mechanism is by inhibiting microtubule depolymerization to stop the mitosis of tumor cells then promote apoptosis or by inducing apoptosis to inhibit the growth of the tumor cell,leading the tumor cell to death.

endophytic fungi；zymotic fluid；antitumor；apoptosis

2014-05-20

修回日期：2014-06-27

王文文，Tel:86-0571-86919357；E-mail：1987duckly@163.com