黃 蓉 汪 清 韋思明 潘杭麗 浙江醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系 杭州 310053

姜黃素對(duì)大鼠睪丸缺血再灌注損傷的干預(yù)作用

黃 蓉 汪 清 韋思明 潘杭麗 浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系 杭州 310053

目的 觀察姜黃素對(duì)大鼠睪丸缺血再灌注損傷的影響。方法 將60只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、缺血再灌注組和治療組，每組20只。對(duì)照組大鼠施行左側(cè)睪丸假手術(shù)。缺血再灌注組大鼠在左側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)720度2h后復(fù)位。治療組大鼠接受與缺血再灌注組相同的外科手術(shù)，并于睪丸復(fù)位時(shí)給予姜黃素（200mg/kg）尾靜脈注射。復(fù)位后4h，每組一半的大鼠行睪丸切除術(shù)，測(cè)定黃嘌呤氧化酶活性、丙二醛水平和血紅素加氧酶-1蛋白表達(dá)水平。復(fù)位后3個(gè)月，剩余大鼠行睪丸切除術(shù)，分析睪丸生精功能。結(jié)果 單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位引起同側(cè)睪丸黃嘌呤氧化酶活性、丙二醛水平和血紅素加氧酶-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），睪丸生精功能明顯下降（P＜0.05）。姜黃素干預(yù)后，同側(cè)睪丸黃嘌呤氧化酶活性和丙二醛水平顯著下降（P＜0.05），血紅素加氧酶-1蛋白表達(dá)水平明顯提高（P＜0.05），睪丸生精功能明顯改善（P＜0.05）。結(jié)論 姜黃素通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶活性、提高血紅素加氧酶-1蛋白表達(dá)水平，減少活性氧含量，從而保護(hù)睪丸生精功能。

大鼠；睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位；缺血再灌注損傷；姜黃素

圖1 三組大鼠睪丸的血紅素加氧酶-1的Western blot代表性結(jié)果。1L和1R表示對(duì)照組左側(cè)（即同側(cè)）和右側(cè)（即對(duì)側(cè)）睪丸；2L和2R表示缺血再灌注組同側(cè)和對(duì)側(cè)睪丸；3L和3R表示治療組同側(cè)和對(duì)側(cè)睪丸。

圖2 睪丸組織學(xué)。A（HE ×100）：對(duì)照組雙側(cè)睪丸及缺血再灌注組和治療組的對(duì)側(cè)睪丸均顯示了正常的曲細(xì)精管直徑、生精細(xì)胞層數(shù)和精子發(fā)生。B（HE ×100）：缺血再灌注組同側(cè)睪丸顯示了曲細(xì)精管萎縮、生精細(xì)胞層數(shù)減少，精子發(fā)生停止。C（HE ×50）：治療組同側(cè)睪丸顯示多數(shù)曲細(xì)精管正常，僅少數(shù)曲細(xì)精管異常（箭頭所指處）。

睪丸扭轉(zhuǎn)又稱精索扭轉(zhuǎn)，是指精索沿其縱軸旋轉(zhuǎn)，精索內(nèi)血管受壓阻塞，導(dǎo)致睪丸缺血甚至壞死。復(fù)位是治療睪丸扭轉(zhuǎn)的現(xiàn)有方法，可以恢復(fù)血供，避免睪丸缺血壞死。睪丸復(fù)位后即使存活，但隨后出現(xiàn)睪丸生精功能損傷。睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后的損傷是一個(gè)缺血再灌注損傷，目前缺乏相應(yīng)的臨床治療。本研究建立大鼠睪丸缺血再灌注損傷模型，探討姜黃素對(duì)睪丸缺血再灌注損傷的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250～300g，由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 藥物及試劑 姜黃素、β-肌動(dòng)蛋白抗體和黃嘌呤來(lái)源于Sigma公司。丙二醛試劑盒系南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。血紅素加氧酶-1抗體購(gòu)于Stressgen公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠睪丸缺血再灌注損傷模型建立及治療 用隨機(jī)數(shù)余數(shù)分組法將60只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、缺血再灌注組和治療組，每組20只。用氯胺酮（50mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉后，施行以下手術(shù)。對(duì)照組：通過(guò)左側(cè)髂腹股溝切口暴露左側(cè)睪丸，用11/0縫線穿過(guò)睪丸白膜，放睪丸入陰囊內(nèi)，關(guān)閉切口。缺血再灌注組：通過(guò)同樣的切口暴露左側(cè)睪丸，將睪丸繞精索逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)720度，在睪丸白膜與陰囊肉膜之間用11/0縫線縫合固定，保持睪丸缺血狀態(tài)。2h后，拆除縫線，將睪丸繞精索順時(shí)針旋轉(zhuǎn)720度，恢復(fù)血供，睪丸仍然存活，關(guān)閉切口。治療組：施行與缺血再灌注組一樣的外科手術(shù)，但在睪丸復(fù)位時(shí)，從尾靜脈注入姜黃素（200mg/kg）。復(fù)位后4h，每組取10只大鼠行雙側(cè)睪丸切除術(shù)，測(cè)定睪丸中黃嘌呤氧化酶活性、丙二醛水平和血紅素加氧酶-1蛋白表達(dá)水平。復(fù)位后3個(gè)月，每組剩余10只大鼠行雙側(cè)睪丸切除術(shù)，分析睪丸生精功能。

2.2 黃嘌呤氧化酶活性和丙二醛水平測(cè)定 以黃嘌呤為底物，采用分光光度法測(cè)定睪丸組織黃嘌呤氧化酶活性。采用硫代巴比妥酸法測(cè)定睪丸組織丙二醛水平。

2.3 血紅素加氧酶-1蛋白表達(dá)水平測(cè)定 采用Western blot法檢測(cè)睪丸組織血紅素加氧酶-1蛋白表達(dá)水平。血紅素加氧酶-1與內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白的條帶密度比值代表血紅素加氧酶-1蛋白表達(dá)水平。

2.4 睪丸生精功能評(píng)估 切下睪丸做成石蠟切片，蘇木蘇-伊紅染色。顯微鏡下觀察睪丸曲細(xì)精管，測(cè)量曲細(xì)精管直徑，并行Johnsen評(píng)分。

3 結(jié)果

3.1 丙二醛水平和黃嘌呤氧化酶活性 與對(duì)照組比較，缺血再灌注組同側(cè)睪丸（即左側(cè)睪丸，也就是缺血再灌注睪丸）組織丙二醛水平和黃嘌呤氧化酶活性顯著升高（P＜0.05）；治療組同側(cè)睪丸組織的上述兩個(gè)指標(biāo)明顯低于缺血再灌注組同側(cè)睪丸（P＜0.05）；三組對(duì)側(cè)睪丸（即右側(cè)睪丸）之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 三組大鼠睪丸丙二醛水平和黃嘌呤氧化酶活性比較（±s）

表1 三組大鼠睪丸丙二醛水平和黃嘌呤氧化酶活性比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與同組對(duì)側(cè)睪丸比較，△P＜0.05；與缺血再灌注組同側(cè)睪丸比較，▲P＜0.05

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3.2 血紅素加氧酶-1蛋白表達(dá)水平 缺血再灌注組同側(cè)睪丸血紅素加氧酶-1表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；治療組同側(cè)睪丸的表達(dá)水平顯著高于缺血再灌注組同側(cè)睪丸（P＜0.05）；三組對(duì)側(cè)睪丸之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1（插頁(yè)），表2。

表2 三組大鼠睪丸血紅素加氧酶-1蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 三組大鼠睪丸血紅素加氧酶-1蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與同組對(duì)側(cè)睪丸比較，△P＜0.05；與缺血再灌注組同側(cè)睪丸比較，▲P＜0.05

組別對(duì)照組缺血再灌注組治療組n/只10 10 10同側(cè)睪丸1.16±0.25 5.28±0.41*△9.20±0.45▲△*對(duì)側(cè)睪丸1.08±0.23 1.11±0.21 1.13±0.26

3.3 睪丸生精功能 與對(duì)照組比較，缺血再灌注組同側(cè)睪丸的曲細(xì)精管直徑和Johnsen評(píng)分明顯降低（P＜0.05）；治療組同側(cè)睪丸的上述指標(biāo)顯著高于缺血再灌注組同側(cè)睪丸（P＜0.05）；三組對(duì)側(cè)睪丸曲細(xì)精管直徑和Johnsen評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3和圖2（插頁(yè)）。

4 討論

睪丸缺血時(shí)，由于鈣離子內(nèi)流引起細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高，導(dǎo)致黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶。此外，缺血時(shí)ATP降解為次黃嘌呤。再灌注時(shí)，大量氧隨血液進(jìn)入缺血組織，黃嘌呤氧化酶將次黃嘌呤和氧轉(zhuǎn)化為超氧陰離子、過(guò)氧化氫等活性氧?；钚匝醢胨テ诙蹋茈y直接定量。丙二醛是活性氧引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的穩(wěn)定末端產(chǎn)物，通常作為活性氧的間接指標(biāo)[1]。本研究顯示，與對(duì)照組比較，缺血再灌注組缺血再灌注損傷睪丸的黃嘌呤氧化酶活性和丙二醛水平明顯升高（P＜0.05），這表明睪丸缺血再灌注后，黃嘌呤氧化酶活性顯著升高，引起活性氧大量產(chǎn)生?；钚匝跬ㄟ^(guò)氧化細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白和DNA等途徑導(dǎo)致組織損傷[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注組同側(cè)睪丸丙二醛水平明顯升高，睪丸生精功能顯著下降（P＜0.05），提示活性氧的大量產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷睪丸生精功能。

表3 三組大鼠睪丸曲細(xì)精管直徑和Johnsen評(píng)分比較（±s）

表3 三組大鼠睪丸曲細(xì)精管直徑和Johnsen評(píng)分比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與同組對(duì)側(cè)睪丸比較，△P＜0.05；與缺血再灌注組同側(cè)睪丸比較，▲P＜0.05

組別對(duì)照組缺血再灌注組治療組n/只10 10 10曲細(xì)精管直徑/μm Johnsen評(píng)分/分同側(cè)睪丸255.06±16.25 190.82±20.36*△229.17±24.20▲△對(duì)側(cè)睪丸251.67±13.28 253.96±13.73 254.31±15.04同側(cè)睪丸9.28±0.49 3.64±0.89*△7.86±0.94▲△對(duì)側(cè)睪丸9.35±0.51 9.30±0.57 9.42±0.53

姜黃素是從植物姜黃的根莖中提取的主要成份，具有抗氧化、抗炎等功效[3-4]。已有研究報(bào)道，姜黃素能降低活性氧含量，減輕心、肺、腎的缺血再灌注損傷[3]。本研究顯示，姜黃素治療顯著降低缺血再灌注損傷睪丸黃嘌呤氧化酶活性和丙二醛水平，提高睪丸生精功能，表明姜黃素可通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶活性減少活性氧產(chǎn)生，從而保護(hù)睪丸生精功能。姜黃素已應(yīng)用于臨床治療骨關(guān)節(jié)炎，取得良好效果，未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的副作用[4]。因此，臨床上可將姜黃素用于睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后治療。

血紅素加氧酶-1能將血紅素降解為鐵、一氧化碳和膽綠素，后者能被膽綠素還原酶轉(zhuǎn)化為膽紅素。膽綠素和膽紅素都擁有抗氧化的特性。研究表明，姜黃素能誘導(dǎo)腎上皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的血紅素加氧酶-1表達(dá)上調(diào)，減輕活性氧引起的損傷[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠缺血再灌注損傷睪丸丙二醛水平和血紅素加氧酶-1蛋白表達(dá)水平明顯增高（P＜0.05），提示睪丸缺血再灌注后，活性氧的大量產(chǎn)生誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1表達(dá)上調(diào)。與缺血再灌注組同側(cè)睪丸比較，姜黃素干預(yù)后血紅素加氧酶-1蛋白表達(dá)水平顯著提高，丙二醛水平降低，提高睪丸生精功能。表明姜黃素通過(guò)誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1表達(dá)上調(diào)，降低活性氧水平，從而保護(hù)睪丸生精功能。因此，誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1表達(dá)上調(diào)可能是姜黃素減輕睪丸缺血再灌注損傷重要機(jī)制之一。

單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位是否會(huì)引起對(duì)側(cè)睪丸損傷，目前仍有爭(zhēng)議。有學(xué)者認(rèn)為，單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位通過(guò)免疫等機(jī)制引起對(duì)側(cè)睪丸損傷[6]，也有學(xué)者持否定態(tài)度[7]。本研究中，單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位引起同側(cè)睪丸丙二醛水平、黃嘌呤氧化酶活性、血紅素加氧酶-1表達(dá)水平和睪丸生精功能發(fā)生顯著改變，然而對(duì)側(cè)睪丸未見(jiàn)任何改變。因此，我們認(rèn)為單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位不會(huì)導(dǎo)致對(duì)側(cè)睪丸損傷。

本研究結(jié)果證實(shí)，姜黃素通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶活性，提高血紅素加氧酶-1蛋白表達(dá)水平，降低活性氧含量，從而減輕睪丸缺血再灌注損傷。

［1］Bilommi R，Nawas BA，Kusmayadi DD，et al.The effects of glutathione on malondialdehyde expression and seminiferous tubule damage in experimental testicular torsion-detorsion in Wistar rats［J］.J Pediatr Urol，2013，9（6 Pt B）：1059-1063.

［2］Ozturk H，Ozturk H，Terzi EH，et al.Interleukin 10 reduces testicular damage in experimental testicular ischemia/reperfusion injury［J］.Urology，2014，83（2）：508.e1-6.

［3］Aydin MS，Caliskan A，Kocarslan A，et al.Intraperitoneal curcumin decreased lung,renal and heart injury in abdominal aorta ischemia/reperfusion model in rat［J］.Int J Surg，2014，12（6）：601-605.

［4］Henrotin Y，Gharbi M，Dierckxsens Y，et al.Decrease of a specific biomarker of collagen degradation in osteoarthritis，Coll2-1，by treatment with highly bioavailable curcumin during an exploratory clinical trial［J］.BMC Complement Altern Med，2014，14（1）：159.

［5］Son Y，Lee JH，Chung HT，et al.Therapeutic roles of heme oxygenase-1 in metabolic diseases：curcumin and resveratrol analogues as possible inducers of heme oxygenase-1［J］.Oxid Med Cell Longev，2013，2013：639541.

［6］Minutoli L，Antonuccio P，Squadrito F，et al.Effects of polydeoxyribonucleotide on the histological damage and the altered spermatogenesis induced by testicular ischaemia and reperfusion in rats［J］.Int J Androl，2012，35（2）：133-144.

［7］Cayan S，Saylam B，Tiftik N，et al.Rho-kinase levels in testicular ischemia-reperfusion injury and effects of its inhibitor，Y-27632，on oxidative stress，spermatogenesis，and apoptosis［J］.Urology，2014，83（3）：675.e13-18.

Effect of Curcumin on Testicular Ischemia-Reperfusion Injury of Rats

HUANG Rong,WANG Qing,WEISiming,PAN Hangli.Department of Clinical Medicine,Zhejiang Medical College,Hangzhou(310053),China

Objective To investigate the effect of curcumin on testicular ischemia-reperfusion injury（IRI）of rats.Methods Sixty adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups:control group,IRI group,and IRI+curcumin group of 20 rats in each group.Rats in control group underwent a sham operation on left testis.In IRI group,left testis was rotated 720°for 2h.Rats in IRI+curcumin group received the same surgical procedure as IRI group and intravenous administration of curcumin（200mg/kg）at testicular detorsion.Orchiectomy was performed on half of rats in each group at 4h after detorsion for measurement of the activity of xanthine oxidase, the level of malondialdehyde and heme oxygenase-1 protein.Orchiectomy was performed on the half of rats in each group at 3 months after detorsion to analyze testicular spermatogenesis.Results Unilateral testicular torsiondetorsion caused significant increase in xanthine oxidase activity,malondialdehyde level,and heme oxygenase-1 protein expression level,and significant decrease in testicular spermatogenesis in ipsilateral testes（all P＜0.05）.Rats treated with curcumin had significant decrease in xanthine oxidase activity and malondialdehyde level and significant increase in heme oxygenase-1 protein expression level and testicular spermatogenesis in ipsilateral testes（all P＜0.05）.Conclusion Curcumin protects testicular spermatogenesis by inhibiting xanthine oxidase activity and elevating heme oxygenase-1 protein expression level to reduce overgeneration of reactive oxygen species.

rats；testicular torsion-detorsion；ischemia-reperfusion injury；curcumin

2014-07-11

修回日期：2014-07-28

韋思明，Tel：15268133671；E-mail：wsm1971@hotmail.com