白志坤 張逸濤 李社紅 羅紅霞

摘?要?在聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的輔助下，將化學(xué)氣相沉積（CVD）得到的石墨烯從銅基底轉(zhuǎn)移到聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）基底上，制備了柔性石墨烯平面電極（GPE）。通過電化學(xué)沉積在GPE表面修飾L-精氨酸（L-Arg），得到聚L-Arg修飾的柔性石墨烯平面電極（P（L-Arg）/GPE）。用掃描電子顯微鏡（SEM）、能譜法（EDS）和拉曼光譜對此電極進行了表征。用循環(huán)伏安法（CV）和微分脈沖伏安法（DPV）研究了P（L-Arg）/GPE對黃嘌呤（XA）的電化學(xué)傳感作用。在尿酸（UA）和次黃嘌呤（HX）存在下，P（L-Arg）/GPE傳感器不僅實現(xiàn)了對XA的選擇性測定，而且還成功實現(xiàn)了XA、UA和HX的同時測定，3個氧化峰的峰-峰電位差分別為420和384 mV。XA在0.5～8 μmol/L和8～140 μmol/L濃度范圍內(nèi)，響應(yīng)電流與XA濃度分段呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.08 μmol/L（S/N = 3）。此傳感器具有穩(wěn)定性好、重復(fù)性強、響應(yīng)時間短、制作成本低、抗干擾能力強等優(yōu)點，并成功應(yīng)用于人血清中XA測定。

關(guān)鍵詞?石墨烯平面電極; 電化學(xué)傳感; L-精氨酸; 黃嘌呤; 尿酸; 次黃嘌呤

1?引 言

黃嘌呤（XA）是一種嘌呤堿，廣泛分布在人體和其它生物的器官和體液中，常用作溫和的興奮劑和支氣管擴張劑，特別用于治療哮喘癥狀。同時，XA也是嘌呤代謝的產(chǎn)物，在黃嘌呤氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化為尿酸（UA）。UA是嘌呤在人體中代謝的最終產(chǎn)物。在正常情況下，體內(nèi)UA的產(chǎn)生和排泄處于相對平衡的狀態(tài)。體內(nèi)UA產(chǎn)生過多或排泄機制失衡容易導(dǎo)致體內(nèi)UA滯留，使人體體液變成酸性，影響人體細胞的正常功能。次黃嘌呤（HX）廣泛存在于人體血液、肝臟和尿液中，是嘌呤核苷酸分解代謝的中間產(chǎn)物，也是檢測心臟代謝是否異常的重要生化指標之一。在臨床診斷中，體液中UA、XA和HX的濃度與多種疾病有關(guān)，包括黃嘌呤尿癥、痛風、高尿酸血癥、腎衰竭和某些先天性代謝疾病[1，2]。準確檢測UA、XA和HX對人體代謝系統(tǒng)的穩(wěn)定性和相關(guān)疾病的早期臨床診斷具有重要意義。但是，3種嘌呤衍生物通常在人體中同時存在，且涉及HX→XA，XA→UA及其它復(fù)雜的轉(zhuǎn)化途徑[3]。因此，選擇性測定嘌呤代謝中間體XA和同時測定UA、XA和HX在臨床檢測中具有重要意義。

目前，檢測XA的方法有毛細管電泳法（CE）[4]、氣相色譜法[5]、液相色譜法（HPLC）[6]、分光光度法[7]、化學(xué)發(fā)光法[8]和酶法[9]等。這些方法通常操作復(fù)雜，設(shè)備和材料昂貴，樣品制備嚴格且耗時較長[10，11]。此外，黃嘌呤氧化酶（XOD）生物傳感器重復(fù)性和穩(wěn)定性低，固定流程復(fù)雜，容易受溫度和pH值的影響[12～14]。因此，開發(fā)低成本、高靈敏度和快速響應(yīng)的非酶電化學(xué)傳感器十分必要。

石墨烯是由sp2雜化的碳原子組成的單原子厚度的二維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的碳納米材料，已廣泛用于基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中，例如超級電容器、電池和燃料電池等[15，16]。由于石墨烯具有大的比表面積、高的導(dǎo)電性、化學(xué)惰性、良好的透明性和機械性能，在電化學(xué)傳感器領(lǐng)域引起了越來越多的關(guān)注[17]。石墨烯可以通過多種技術(shù)制備，如化學(xué)氣相沉積（CVD）法[18]、外延生長法[19]、機械剝離法[20]和氧化還原法[21]等。石墨烯膜修飾電極通常由滴涂石墨烯的均勻分散液或還原氧化石墨烯（GO）制得，但通過這兩種方法制備的石墨烯薄膜容易導(dǎo)致石墨烯在電極表面發(fā)生團聚且產(chǎn)生較多缺陷，因而無法精確控制修飾電極的薄膜厚度，電極的導(dǎo)電性和重現(xiàn)性不佳[22～24]。

CVD石墨烯因其具有結(jié)構(gòu)缺陷少、層數(shù)可控、電化學(xué)性能好等優(yōu)勢，非常適用于電化學(xué)傳感等的研究，其邊緣和基面都具有出色的電催化活性[25]。在本研究組之前的工作中，將 CVD 石墨烯的邊緣制備成納米電極，研究了其對UA、抗壞血酸（AA）和腎上腺素（EP）等生物分子的電催化作用[26]。在此基礎(chǔ)上，將金屬Cu納米顆粒電沉積在上述石墨烯納米電極表面，制備了靈敏的非酶葡萄糖傳感器[27]。另一方面，將Cu基底上的 CVD 石墨烯轉(zhuǎn)移到柔性的聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）表面，得到GPE。然后在 GPE 上修飾鐵氰化鈷納米顆粒，作為過氧化氫傳感器[28]; 修飾L-半胱氨酸，作為多巴胺（DA）和AA傳感器[22]; 修飾金鉑雙納米粒子和L-半胱氨酸，作為EP傳感器[16]。

L-精氨酸（L-Arg）是維持嬰幼兒生長發(fā)育的必需氨基酸，是鳥氨酸循環(huán)的中間代謝物，能促使氨轉(zhuǎn)變成為尿素，從而降低血氨含量。L-Arg也是精子蛋白的主要成分，有促進精子生成，提供精子運動能量的作用。此外，靜注精氨酸，能刺激垂體釋放生長激素，可用于垂體功能試驗。由L-Arg氧化形成的α-氨基自由基可以連接在電極表面上，進而形成P（L-Arg）聚合物薄膜，用于電化學(xué)檢測。Wang等[29]構(gòu)建了基于P（L-Arg）修飾的玻碳電極，實現(xiàn)了DA和EP的同時檢測; Cao等[30]制備了基于金納米顆粒/ P（L-Arg）/多壁碳納米管復(fù)合膜修飾的玻碳電極，構(gòu)建了酪蛋白電化學(xué)免疫傳感器。在本工作中，將L-Arg通過電化學(xué)方法沉積在GPE表面，構(gòu)建了柔性聚（L-Arg）/GPE（P（L-Arg）/GPE）。由于CVD石墨烯和L-Arg的協(xié)同作用，P（L-Arg）/GPE傳感器具有優(yōu)越的電催化活性，不僅可以獨立檢測XA，還可以同時檢測XA、UA和HX。圖1是P（L-Arg）/GPE的制備和檢測示意圖。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

CHI660D型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司），電化學(xué)測定采用三電極系統(tǒng)： 工作電極為GPE和P（L-Arg）/GPE，參比電極為Ag/AgCl電極，對電極為鉑絲電極; Sartorius PB-10 pH計（德國 Sartorius公司）; 7401F掃描電子顯微鏡（SEM）和能譜儀（EDS）一體機（日本JEOL公司）; Lab Ram HR Evolution拉曼（Raman）光譜儀 （日本HORIBA公司）。

Cu基底的少層CVD石墨烯（深圳六碳科技有限公司）; 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA，Aladdin公司）; PET（厚度為 250 mm，深圳市極致薄膜科技有限公司）; 葡萄糖、NaCl、KCl、檸檬酸鹽、AA（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）; L-Arg、L-半胱氨酸、L-甘氨酸、L-蘇氨酸、硫脲（美國BIO BASIC公司）; XA、UA、HX（美國Sigma-Aldrich 公司）; 人血清（中國人民大學(xué)校醫(yī)院）。支持電解質(zhì)為0.1 mol/L PBS緩沖溶液（KH2PO4-Na2HPO4）。所用試劑均為分析純; 實驗用水為超純水（Millipore公司超純水儀制備）。

2.2?實驗方法

2.2.1?轉(zhuǎn)移CVD石墨烯?如圖2所示，通過高分子支撐法將Cu基底上的少層CVD石墨烯轉(zhuǎn)移到柔性PET基底上[31，32]。具體步驟如下：將1%（w/w）PMMA的苯甲醚溶液涂在Cu基底CVD石墨烯上，在120℃下干燥5 min; 將PMMA/石墨烯/Cu浸入1 mol/L FeCl3和0.1 mol/L HCl 混合溶液刻蝕掉Cu基底; 將PMMA/石墨烯膜用水洗滌3次，除去過量的Fe3+，并將其轉(zhuǎn)移到PET基底上，在室溫下干燥24 h，確保石墨烯完全粘附到PET基底上。將上述薄片浸入丙酮中24 h，除去多余的PMMA，取出后晾干，備用。

2.2.2?GPE和P（L-Arg）/GPE的制備?用絕緣膠帶隔離出0.09 cm2的電極作為有效工作區(qū)域，頂部用銅導(dǎo)電膠包裹，制得GPE。將GPE浸入含有2.5 mmol/L L-Arg的溶液中[29]，并在2.2～2.0 V的電位范圍內(nèi)掃循環(huán)描15圈，即得到P（L-Arg）/GPE，取出，用水沖洗電極表面，放置備用。

3?結(jié)果與討論

3.1?GPE和P（L-Arg）/GPE的表征

石墨烯在Cu和PET基底上的SEM圖如圖3A和圖3B所示，石墨烯在轉(zhuǎn)移前后都具有良好的完整性和連續(xù)性，表明石墨烯成功地轉(zhuǎn)移到PET基底上。經(jīng)過電化學(xué)沉積后，L-Arg以棒狀形式存在于GPE上（圖3C和3D）。

圖4A是P（L-Arg）/GPE的EDS譜，插圖是GPE的EDS譜。由圖4A可見，P（L-Arg）/GPE主要由C、N和O元素組成，而GPE僅由C和O元素組成，表明L-Arg成功修飾在GPE上。圖4B～4D分別為C、N和O元素的映射圖像，與EDS的結(jié)果一致。

采用拉曼光譜表征Cu（a）和PET（b）基底上的CVD石墨烯（圖5A）。拉曼光譜中可觀察到，在Cu上的石墨烯的3個特征峰：1345 cm1的 D峰，1582 cm1的G峰，2695 cm1的2D峰。其中，D峰可作為評估石墨烯缺陷強度的參數(shù)[33]，其峰值越小，代表石墨烯的缺陷越少;而2D和G峰的強度比說明了所用的CVD石墨烯為少層石墨烯[34]。相比于Cu基底，PET上石墨烯的拉曼光譜與之相似，表明在轉(zhuǎn)移過程中CVD石墨烯的結(jié)構(gòu)未被破壞。

電化學(xué)阻抗譜（EIS）是表征電極界面特性的有效方法，EIS譜圖中，在高頻區(qū)的半圓形部分的直徑對應(yīng)于電子傳遞電阻（Rct）的大小[35，36]，而Rct的數(shù)值代表了電極界面電子轉(zhuǎn)移的快慢。圖5B是在含有5 mmol/L [Fe（CN）6]3/4和0.1 mol/L KCl混合溶液中得到的GPE和P（L-Arg）/GPE的EIS圖譜，GPE和P（L-Arg）/GPE的Rct約為91和22 kΩ。這是因為L-Arg修飾在GPE表面后，由于靜電吸附作用，使得[Fe（CN）6]3/4吸附到了電極表面，促進了界面處的電荷轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致Rct值明顯下降。

3.2?沉積圈數(shù)的優(yōu)化

采用循環(huán)伏安法考察了不同沉積圈數(shù)的L-Arg對XA測定的影響。當沉積圈數(shù)在5～15范圍內(nèi)依次增加時，XA的氧化峰電流隨著沉積圈數(shù)的增加而增大。這可能是由于隨著沉積圈數(shù)的增加，沉積的L-Arg增多，催化活性位點增多。當沉積圈數(shù)為15時，P（L-Arg）/GPE對XA有最大的峰電流; 然而，當沉積圈數(shù)繼續(xù)增加到20時，XA的峰電流反而降低，可能是由于L-Arg在電極表面上的過量聚集，阻礙了電子傳遞。

3.3?XA在P（L-Arg）/GPE上的電化學(xué)響應(yīng)

采用循環(huán)伏安法進一步研究了XA在GPE和P（L-Arg）/GPE上的電化學(xué)響應(yīng)。圖6A為GPE和P（L-Arg）/GPE在不含XA和含有50 μmol/L XA的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中的循環(huán)伏安圖。修飾前后的電極在空白PBS緩沖溶液中均未顯示氧化還原峰（圖6A曲線a和b）; 當加入50 μmol/L XA后（圖6A曲線c和d），GPE上XA在0.94 V處出現(xiàn)氧化峰，而在P（L-Arg）/GPE上，XA的氧化峰電位正移至0.75 V，且峰電流明顯增加，表明修飾L-Arg后的GPE對XA有明顯的催化作用。由加入50 μmol/L UA、XA和HX的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中，P（L-Arg）/GPE（曲線b）和GPE（曲線a）的循環(huán)伏安曲線（圖6B）可知，采用P（L-Arg）/GPE，3種嘌呤衍生物的氧化峰成功分離，且UA-XA和XA-HX之間的峰-峰電位差分別為420和384 mV，表明UA、XA和HX在P（L-Arg）/GPE上可以實現(xiàn)分別和同時測定。

3.4?掃速的影響

考察了掃描速度對峰電流的影響。圖7A為P（L-Arg）/GPE在含有50 μmol/L XA的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中，掃描速率為25～275 mV/s條件下的循環(huán)伏安圖。XA的峰電流密度與掃描速度平方根呈線性關(guān)系（圖7B），線性方程為j （μA/cm2）=0.0767ν1/2（mV/s）1/2 + 0.0126 （R2=0.9944），說明XA在此電極上的氧化反應(yīng)是受擴散控制的過程。隨著掃速增加，XA的氧化電位正向移動。氧化峰電位Epa和掃速對數(shù)值（lgν）呈線性關(guān)系（圖7C），線性回歸方程為Epa （V）=0.6522 + 0.048lgv（R2=09964），斜率為2.303RT/αnF（其中，α和n分別代表電子轉(zhuǎn)移系數(shù)和轉(zhuǎn)移電子數(shù)），當不可逆反應(yīng)的α=0.5時，XA氧化反應(yīng)中的轉(zhuǎn)移電子數(shù)≈2.45，接近于兩電子的轉(zhuǎn)移過程[37]。

3.5?pH值的影響

緩沖溶液的pH值通常會對電極上分析物的響應(yīng)電流和電位產(chǎn)生影響。圖8A是P（L-Arg）/GPE在含有50 μmol/L XA的0.1 mol/L PBS中，不同pH值（3.0～8.0）下的循環(huán)伏安行為，在pH=5.0、 6.0和7.0時，峰電流密度相近，考慮到人體的生理pH值，后續(xù)實驗選擇pH 7.0（圖8B）。XA的Epa隨pH值增加而負移（圖8C），表明質(zhì)子直接參與了XA的電化學(xué)氧化過程，且Epa和pH值呈線性關(guān)系，線性方程為Epa（V）=0.0526 pH + 1.1497 （R2=0.9961），斜率接近理論值59.0 mV/pH，表明XA的氧化過程中涉及相等數(shù)量的電子和質(zhì)子。

在嘌呤代謝過程中，嘌呤氧化酶將HX轉(zhuǎn)化為XA，再XA轉(zhuǎn)化為UA，這兩個過程均為2電子2質(zhì)子的氧化過程。UA通常在2電子2質(zhì)子的氧化過程中生成尿酸亞胺化合物[38]。少量的HX在6電子6質(zhì)子的多步氧化過程中生成尿酸亞胺化合物，或在4電子4質(zhì)子的多步氧化過程中生成UA。少量的XA也可能對應(yīng)于4電子4質(zhì)子的多步氧化過程，生成尿酸亞胺化合物[39]。

3.6?方法的分析性能

采用本方法檢測不同濃度的XA。如圖9A所示，XA的峰電流密度隨著濃度的增加而增大。在0.5～8.0 μmol/L和8.0～140.0 μmol/L范圍內(nèi)，XA峰電流密度與濃度分段呈線性關(guān)系（圖9B），線性方程分別為： j （μA/cm2）=0.0258C （μmol/L） + 0.0355 （R2=0.9948）和j （μA/cm2）=0.0139C （μmol/L） + 0.1611 （R2 = 0.9940）。檢出限為0.08 μmol/L（S/N=3）。與其它已報道的黃嘌呤傳感器的性能相比較，P（L-Arg）/GPE對XA檢測具有檢出限低、線性范圍較寬等優(yōu)點（表1）。

3.7?XA的選擇性檢測及其與UA和HX的同時檢測

在含有50 μmol/L UA和HX的溶液中，改變XA濃度（10、20、40、60、80、100 μmol/L）得到的微分脈沖伏安圖如圖10A所示，隨著XA濃度增加，其峰電流密度增大，而UA和HX的峰電流密度基本保持不變。在UA和HX存在下，XA峰電流密度與濃度呈良好的線性關(guān)系（圖10B），P（L-Arg）/GPE電極可以對XA進行選擇性檢測。

圖11A為P（L-Arg）/GPE在不同濃度UA、XA和HX的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中的電化學(xué)響應(yīng)。由圖11B～11D可見，UA、XA和HX的峰電流密度均隨著其濃度增加而線性增大，表明利用P（L-Arg）/GPE可同時檢測UA、XA和HX。

3.8?干擾實驗

在最佳實驗條件下，研究了P（L-Arg）/GPE作為XA傳感器的抗干擾能力。在含有20 μmol/L XA的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中，分別加入10 mmol/L NaCl、 KCl和葡萄糖（Glu）; 2 mmol/L AA、 L -半胱氨酸（L-Cys）、 L-甘氨酸（L-Gly）、 L-蘇氨酸（L -Thr）和檸檬酸鹽（Cit）;?1 mmol/L硫脲（Thi）。在XA和高濃度干擾物質(zhì)共存下，其峰電流密度基本保持不變（圖12），表明此傳感器對XA檢測具有良好的選擇性和抗干擾性。

3.9?電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

利用P（L-Arg）/GPE對 50 μmol/L XA連續(xù)循環(huán)伏安掃描 30圈后，發(fā)現(xiàn)此電極的電流響應(yīng)仍保持初始值的90%，表明其具有很好的重復(fù)性。在相同條件下制備了7根電極，分別對50 μmol/L XA進行檢測，響應(yīng)電流密度的相對標準偏差（RSD）約為4.3%，表明此傳感器具有良好的重現(xiàn)性。將此電極在室溫下保存30天后，電流仍維持在初始電流的89.9%，表明此電極具有良好的穩(wěn)定性。

3.10?實際樣品分析

采用本方法測定了實際血清樣品中的XA。用0.1 mol/L PBS將血清稀釋100 倍后，采用本方法進行檢測。結(jié)果如表2所示，加標回收率為98.4%～103.9%，表明P（L-Arg）/GPE可用于人體血清中XA的檢測。

4?結(jié) 論

將 CVD 石墨烯轉(zhuǎn)移到PET 基底上，制備了柔性CVD石墨烯平面電極（GPE），并通過連續(xù)CV掃描使L-Arg聚合在GPE的表面，得到聚L-Arg修飾的石墨烯平面電極P（L-Arg）/GPE。研究結(jié)果表明，P（L-Arg）/GPE在UA和HX共存下可實現(xiàn)XA的單獨測定和三者的同時測定，具有操作簡單、成本低、靈敏高度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好等優(yōu)點。此傳感器對XA的線性檢測范圍為0.5～140 μmol/L，檢出限為0.08 μmol/L（S/N=3）。此傳感器對常見的共存物具有較強的抗干擾性能，因此對XA的檢測具有較好的選擇性，并成功用于人血清中XA的檢測，有望在電化學(xué)生物傳感器領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[51]。

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