唐銘擎 毛旭華 龔易昕悅 青琳森 謝靜

摘?要?C反應球蛋白（CRP）作為一種重要的急性炎癥與感染性疾病相關生物標志物， 臨床上常被用于多種疾病的評估與病情監(jiān)測。目前， CRP的臨床檢測方法主要有免疫比濁法、酶聯(lián)免疫吸附比色法和側(cè)向流免疫層析法等。近年來， 隨著分析理論和材料學研究的發(fā)展， 生物傳感技術、微流控技術等新的分析方法與技術不斷涌現(xiàn)。本文綜述了CRP的分析方法的開發(fā)與應用情況， 重點評述了近五年的最新進展， 展望了新型CRP檢測方法的研究方向， 以期為開發(fā)高靈敏度、高特異性、更能滿足臨床需求的CRP分析方法提供參考。

關鍵詞?C反應球蛋白; 診斷; 免疫測定; 生物傳感器; 微流控技術; 即時檢測; 評述

1?引 言

C反應球蛋白（C-reactive protein， CRP）是由5個相同亞基以非共價形式結(jié)合而成的五聚體， 是肝細胞合成的急性期蛋白之一[1]。人體CRP水平在機體受到感染或損傷時急劇上升， 因此CRP可作為炎癥指標， 輔助診斷炎癥相關性疾病[2]。CRP分析方法改進研究也一直是檢驗醫(yī)學和生物分析化學領域的熱點研究問題。目前， CRP檢測以免疫分析為主， 其中應用最廣泛的有濁度分析法、酶聯(lián)免疫吸附法和側(cè)向流免疫層析法等[3]。隨著分析理論和材料學研究的發(fā)展， 多種學科交叉融合， 逐漸涌現(xiàn)出一些新穎的CRP檢測技術， 如生物傳感技術、微流控技術和質(zhì)譜法等。這些新檢測技術的出現(xiàn)， 滿足了臨床CRP檢測對高靈敏度、寬檢測范圍、即時檢測與多重生物標志物檢測的新需求， 為未來進一步改進CRP分析法提供了新思路。

2?CRP臨床監(jiān)測意義

CRP是人體急性時相蛋白（APP）中最靈敏的反應指標， 在正常人體內(nèi)含量低， 通常低于10 μg/mL[4]。當機體受到感染或組織損傷時， 血內(nèi)CRP水平可在48 h內(nèi)迅速上升1000倍[2]。因此CRP可作為明確炎癥指標， 輔助診斷新生兒敗血癥[5]、膿毒血癥[6]、代謝疾病[7～9]、蕁麻疹[10]、抑郁[11]、腫瘤（除白血病外）[12]等炎癥相關性疾病的診療工作; 或用于判斷呼吸道感染來源， 避免抗生素的濫用[13， 14]。

手術后患者易感染并發(fā)癥， 影響血內(nèi)CRP濃度下調(diào)恢復[2]。因此， 常需連續(xù)監(jiān)測患者CRP水平， 用于判斷患者手術后是否感染并發(fā)癥[15～18]。研究發(fā)現(xiàn)， CRP能上調(diào)血管損傷因子和多種炎癥因子水平， 參與早期冠心病與粥動脈樣硬化形成機制[19]。近年的研究也證明， CRP濃度上調(diào)可用于預測多種心血管疾病發(fā)病率[20～23]。

Ansar等[2]詳細綜述了血漿CRP濃度與多種疾病發(fā)病進程和預后的相關性， 充分體現(xiàn)了CRP分析的臨床應用價值。

3?CRP分析方法概述

CRP作為存在于血液中的微量蛋白， 受基質(zhì)干擾大， 通過免疫分析可實現(xiàn)其特異性檢測[24]。在識別分子（主要包括CRP特異性抗體、核酸適配體、磷酸酰膽堿、磷酸乙醇胺等）上修飾不同的示蹤材料， 當識別分子與樣品中CRP的特異性結(jié)合后， 示蹤材料聚集產(chǎn)生檢測信號， 再直接或聯(lián)用其它檢測技術讀取檢測信號， 實現(xiàn)對樣品中CRP的定性或定量分析。本節(jié)簡要概述了現(xiàn)有CRP分析方法及其分析特點（表1）。

3.1?經(jīng)典分析方法及其改進

經(jīng)典的CRP分析方法有免疫比濁法（Immunoturbidimetry， ITM）、酶聯(lián)免疫吸附測定法（Ezyme linked immunosorbent assay， ELISA）和側(cè)向流免疫層析法（Lateral flow assay， LFA）等。

特異性抗體與靶標抗原結(jié)合會形成不溶性免疫復合物， ITM法利用此時體系產(chǎn)生的濁度變化完成樣品的定性和定量分析。ITM法一般聯(lián)用比濁計讀取濁度信號， 具備方便快捷、檢測范圍寬等優(yōu)點， 是目前臨床工作中最常用的CRP檢測方法之一。ITM法的主要缺陷在于檢測靈敏度低， 為此， 研究者不斷地進行了多種方案改進。例如， Yang等[25]將光射流激光技術引入免疫比濁測試， 能有效放大濁度檢測信號， 從而增加檢測靈敏度。

ELISA法是通過酶標抗體特異性捕獲靶標抗原， 然后利用抗體上的標記酶催化底物顯色， 實現(xiàn)樣品比色分析。酶標儀配合商業(yè)化的ELISA試劑盒是臨床實驗室CRP測定的主要選擇。雖然ELISA法已廣泛應用于臨床樣品檢測， 但仍具有操作步驟繁瑣、耗時長等缺點， Kim等[26]用毛細管取代傳統(tǒng)微孔板作為固相載體， 無需繁瑣的試劑添加與洗滌工藝， 即可在30 s內(nèi)得到顯色結(jié)果。

LFA法基于層析原理， 使含有CRP的樣品液在纖維素膜毛細力作用下能快速與檢測線和質(zhì)控線上包埋的標記抗體特異性結(jié)合， 隨后通過檢測示蹤材料的聚集產(chǎn)生響應信號， 完成樣品液檢測。LFA分析時間短、操作簡便易行， 但經(jīng)典LFA檢測方法檢測范圍狹窄， 一般只能滿足定性檢測要求。為增加檢測靈敏度、實現(xiàn)定量檢測， 研究者通過替換檢測性能更強的示蹤材料[27～30]、去除抗體比例不合適而導致假陰性的鉤狀效應（Hook effect）[31，32]等方式， 獲得了更寬的檢測范圍與更低的檢出限。

3.2?生物傳感器（Biosensor）

生物傳感器技術是一種將樣品中CRP濃度轉(zhuǎn)化為物理化學信號（如電信號、光信號等）的分析技術， 主要利用識別分子捕獲CRP， 理化換能器（如場效應管、壓電晶體等）轉(zhuǎn)化或放大濃度信號， 實現(xiàn)CRP定量分析。生物傳感器技術形式多變， 現(xiàn)已成為建立新型CRP檢測方案的主要研究方向之一， 根據(jù)檢測原理可將其分為電化學生物傳感器、光學生物傳感器和其它形式的生物傳感器等。

電化學生物傳感器（圖1A）通過感受檢測體系中電信號變化實現(xiàn)樣品分析。根據(jù)響應信號的不同分為安培型和阻抗型兩類。安培型傳感器主要觀測恒定電壓下工作電極的電流變化實現(xiàn)樣品分析[33]， 阻抗型傳感器則是通過檢測電極表面粘附材料的電容、電荷轉(zhuǎn)移電阻或電容變化實現(xiàn)樣品分析[34]。相較于安培型傳感器， 阻抗型傳感器是在小幅正弦電壓下進行檢測， 對樣品蛋白與抗體影響小， 可實現(xiàn)無損檢測， 且無需標記， 簡單實用。

光學生物傳感器通過感受檢測體系中單束或多束光的光學信號變化實現(xiàn)樣品分析。目前， CRP光學生物傳感器按檢測信號不同可分為五類， 分別為基于評估體系顏色變化的比色型傳感器[36， 37]、基于評估體系發(fā)光信號強度的發(fā)光型傳感器[38， 39]、基于評估體系反射率變化的反射光譜型傳感器[40]、基于評估透射率變化的透射光譜型傳感器[41]和基于評估拉曼散射信號變化的表面增強拉曼光譜型（Surface-enhanced Raman spectroscopy， SERS）傳感器[35]。其中， SERS是化學和生物醫(yī)學分析中最為敏感的技術之一（圖1B）。將貴金屬作為傳感器基底， 通過SERS技術放大拉曼信號， 增強檢測信號強度， 檢出限可降低至5 fg/mL[42]。

除了上述研究較多的電化學與光學傳感器外， 還有基于光熱效應[43]、光磁效應[44]、巨磁阻抗效應[45]、壓電效應[46]等原理研發(fā)的新型CRP生物傳感器， 以及聯(lián)用SERS檢測技術與圖像編譯分析技術的復合式納米成像傳感器等[47，48]。

3.3?微流控技術（Microfluidics）

微流控技術是指利用微機電系統(tǒng)， 將樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成于微米級的芯片上， 能自動完成免疫分析全過程的分析檢測技術。相較于經(jīng)典分析方法， 微流控技術不僅對樣品需求量小（僅幾微升）、操作便捷快速， 還能實現(xiàn)多種生物標志物的同時分析， 是目前臨床體外分析技術的主要研究熱點。最常見的微流控檢測模式， 以Sinha等[49]建立的場效應晶體管微流控技術為代表。在檢測芯片上集合多個檢測腔室（圖2A）， 每個腔室獨自完成不同生物標志物的全分析處理過程（圖2B）， 具備拓展成為多重指標分析方法的潛力。Chu等[50]用鋁鎵氮/鎵氮作為微流控芯片基底材料， 能屏蔽生物樣品中的高電解質(zhì)影響， 可直接測定人血清中CRP水平。

3.4?質(zhì)譜法（Mass spectrometry， MS）

質(zhì)譜具備高度靈敏的檢測性能， 能識別分子間微小差異， 實現(xiàn)多種生物標志物的同時檢測。例如， Gao等[51]將磁珠與抗體偶聯(lián)使蛋白能快速從樣品液中分離， 以氨基酸標記的重組靶蛋白為內(nèi)標， 基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜直接分析蛋白質(zhì)含量， 可同時測定包括CRP在內(nèi)的4種生物標志物。Ko等[52]結(jié)合免疫分析原理， 以不同金屬摻雜的納米顆粒為示蹤材料，

以電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測信號， 可間接實現(xiàn)多種生物標志物的同時測定（圖3）。

上述CRP分析方法的特點見表1。總體而言， ITM法檢測范圍寬， 囊括多種病癥， 對應CRP臨床檢測范圍， 適用于臨床患者血樣的快速定性檢測。ELISA法靈敏性好且易判讀， 配合使用酶標儀， 可用于臨床實驗室中CRP的精密測定。LFA法制備成本低， 但檢測范圍窄， 可用于CRP的定性分析。質(zhì)譜法檢測精密度高， 可實現(xiàn)多重檢測模式， 但檢測設備對人員素質(zhì)要求高， 不易普及。

基于生物傳感器與微流控技術的CRP免疫檢測方法形式多變， 且操作簡單， 能兼顧臨床對CRP快速檢測需要與高靈敏檢測需求。其中， 生物傳感器檢測靈敏度最高， 檢出限可低至5 fg/L[35]， 較適合用于超敏CRP（Hypersensitive C-reactive protein， hs-CRP）的臨床分析方法的研發(fā)。 微流控技術能自動化實現(xiàn)全分析檢測過程， 通過簡單設備即可精密讀取檢測結(jié)果， 適用于CRP現(xiàn)場快速檢測平臺的開發(fā)。

4?CRP分析方法發(fā)展趨勢

4.1?提高檢測靈敏度

血漿中僅含有微量CRP， 且血漿中蛋白組成復雜， 除CRP外的無關蛋白（如白蛋白、γ球蛋白等）有可能黏附在檢測基底表面， 影響檢測基線穩(wěn)定度。受此影響， 如果CRP分析方法檢出限過高， 易造成結(jié)果失真， 甚至出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象， 影響臨床判斷的正確性。因此， 需提高CRP檢測靈敏度， 確保CRP含量的準確分析。

在降低無關蛋白的非特異性吸附方面， Hwang等[55]將一種單晶金納米片作為SERS檢測基底， 利用其原子構成的平坦表面減少無關蛋白的非特異性吸附， 使檢測靈敏度提高至10?17 mol/L（圖4A）。

抗體作為識別分子， 其大分子位阻效應和不穩(wěn)定的理化性質(zhì)常影響檢測靈敏度。核酸適配體作為一種新型識別分子， 是很好的替代選擇。Wang等[56]以巰基化核酸適配體代替抗體作為識別分子， 降低了識別分子的空間位阻效應， 增強了理化穩(wěn)定性， 檢出限降低至1.7 pg/mL（圖4B）。本研究組[57]也利用核酸適配體作為識別分子， 建立了一種新穎的納米酶夾心式ELISA法， 檢出限可低至8 pg/mL。 O′Reilly等[39]采用小分子抗體作為識別分子， 減少了空間位阻與非特異性吸附， 檢出限為0.3 pg/mL。

此外， 增加檢測信號響應， 也可提高檢測靈敏度。如Kuo等[58]在電極邊緣添加鋸齒狀結(jié)構， 以提高電解質(zhì)電流強度， 檢測靈敏度比傳統(tǒng)電極提高了85.81%（圖4C）。Wang等[59]利用銀介質(zhì)對拉曼信號的增強作用， 在檢測基底表面鍍上一層銀， 放大檢測信號， 使CRP檢出限低至0.01 pg/mL（圖4D）。

4.2?擴寬檢測范圍

不同病癥對應CRP檢測范圍不同， 實際臨床檢測要求CRP分析法具有較寬的線性檢測范圍。LFA法和一些微流控技術檢測范圍較窄， 只能實現(xiàn)CRP的定性或半定量檢測， 無法滿足實際臨床檢測需要。為拓寬檢測范圍， 研究者進行了多種改進方法的研究。

采用檢測信號更強的示蹤材料， 可以拓寬檢測范圍。Hu等[27]制備了一種包含多個量子點的熒光納米球， 將其作為LFA的新示蹤材料， 利用其超強熒光信號使檢測范圍擴寬到0.178～11.4 nmol/L。

抗體比例不合適而導致假陰性的鉤狀效應， 被認為是導致免疫分析檢測范圍窄的重要原因。針對鉤狀效應對檢測范圍的限制， Oh等[31]在改進LFA檢測方法時， 改變樣品墊在試紙條上位置， 控制CRP與捕獲抗體和金標抗體間的結(jié)合順序， 減少非特異性結(jié)合產(chǎn)生的鉤狀效應， 將檢測范圍拓寬至0.119～100 μg/mL（圖5A）。Rey等[32]直接更換結(jié)果判讀指標， 以檢測線與質(zhì)控線檢測信號比值變化曲線為濃度判斷標準， 成功去除了鉤狀效應（圖5B）。

在一些分析方法中， 檢測基底無法固定識別分子或識別分子負載量過低， 導致檢測范圍窄。Lee等[60]利用具有高比表面積和豐富的活性官能團的氧化鈦納米纖維墊作為檢測基底， 提高了識別抗體的負載量， CRP動態(tài)檢測范圍跨越6個數(shù)量級。

4.3?即時檢測

即時檢測（Point of care testing， POCT）是指能在病床旁現(xiàn)場取樣， 并通過便攜式儀器與配套試劑進行快速分析的方法統(tǒng)稱。因不需要復雜樣品處理程序和大型儀器， POCT能大大節(jié)約檢測時間與成本[61]。作為重要的臨床生物標志物， CRP的POCT方法開發(fā)是臨床醫(yī)學和免疫分析領域極具前景的一個發(fā)展方向。

便攜式檢測儀器的研發(fā)， 可降低檢測成本， 簡化操作步驟， 滿足基層醫(yī)療點CRP即時檢測需要。Vashist等[62]用手機讀取CRP ELISA比色結(jié)果， 底部白光投射使檢測液顏色分布更均勻， 智能手機攝像頭捕捉圖像后， 用手機自帶的色彩處理軟件定量描述圖像顏色， 實現(xiàn)比色信號的讀取（圖6A）。Dong等[63]同樣利用手機作為檢測儀器， 用其捕捉和分析納米金聚集產(chǎn)生的顏色信號， 實現(xiàn)CRP即時分析。Ji等[64]通過筆式壓力計檢測CRP， 以鉑納米粒子作為示蹤材料， 壓力計讀取鉑納米粒子催化過氧化氫產(chǎn)生的氧氣壓強， 實現(xiàn)CRP檢測（圖6B）。Lin等[65]用可直接讀數(shù)的家用血糖儀實現(xiàn)CRP檢測：CRP與功能化脂質(zhì)體結(jié)合， 釋放包埋其中的淀粉糖苷酶， 使其與Triton X-100直鏈淀粉反應產(chǎn)生葡萄糖， 血糖儀分析產(chǎn)生的葡糖糖濃度， 間接計算出CRP含量。

減少繁瑣的樣品預處理工序與多次洗滌添加過程， 也是POCT的重要研發(fā)策略。Joung等[66]利用不對稱聚砜膜對流體的延遲釋放作用， 研制出可自動化添加二次層析液的LFA檢測方案， 可大大精簡操作步驟， 滿足POCT檢測需求。在此基礎上， 該研究組利用水膨脹聚合物的吸水膨脹原理開發(fā)新型POCT-LFA檢測方案[67]， 可更精準控制兩次層析液添加間隔時間， 減少檢測方案批間差異性（圖6C）。Tsai等[68]在研發(fā)芯片上增加細胞過濾膜與過濾柱， 可快速去除血細胞和大分子量的無關蛋白， 使該微控流芯片可以不需復雜的樣品預處理過程， 即可進行全血檢測（圖6D）。

4.4?多重檢測

目前， 單一指標已經(jīng)無法完全滿足臨床精準診斷需求， CRP常與其它生物標志物聯(lián)用， 增加臨床診斷準確度。因此， 實現(xiàn)樣品的多指標同時檢測也是CRP分析的發(fā)展方向。

Qi等[69]在降鈣素原和CRP抗體上標記不同量子點， 并設置兩條不同的檢測線， 開發(fā)了可同時檢測降鈣素原和CRP的LFA（圖7A）。Lv等[70]在血清淀粉樣蛋白A抗體上標記紅色量子點、CRP抗體上標記綠色量子點， 實現(xiàn)雙蛋白的同時檢測（圖7B）。Sinha等[49]研制出一種場效應晶體管微流控芯片， 該芯片有多個檢測腔室， 能同時測定包括CRP在內(nèi)的4種生物標志物， 用于臨床心血管疾病發(fā)病風險的預測分析。Park等[71]研發(fā)的垂直流動檢測技術， 能控制液體流動順序， 避免測試液間互相干擾， 實現(xiàn)多種生物標志物檢測。

5?總結(jié)與展望

CRP作為炎癥與感染指標， 可用于多種疾病診斷治療， 具有重要的臨床應用價值。隨著材料科學的進步和檢測儀器的多樣化， 新的CRP分析方法不斷涌現(xiàn)， 大大提高了檢測靈敏度，大拓寬了檢測范圍， 滿足了POCT與多重檢測等臨床需求。未來的CRP分析方法研究將重點關注以下3個方面：（1）現(xiàn)今CRP檢測方法都是以點時間取樣為主， 不適合術后監(jiān)護等需要長期監(jiān)測CRP含量的臨床工作。因此， 開發(fā)一種可在體內(nèi)實時連續(xù)監(jiān)測CRP的系統(tǒng)可能是未來CRP分析方法的研究熱點; （2）生物樣品中的無關蛋白易與檢測基底或識別抗體產(chǎn)生非特異性吸附， 影響檢測結(jié)果準確性。為去除非特異性吸附干擾， 檢測前需要進行復雜的前處理工作， 不利于臨床CRP的快速檢測。因此， 建立一種能快速去除或削弱無關蛋白非特異性吸附的檢測技術， 有助于同時滿足臨床快速檢測和精準測定需求， 將是未來CRP檢測的研究重點; （3）CRP檢測的重要價值決定了其必將在基層醫(yī)療點被廣泛使用。研制低價便攜的檢測儀器， 降低檢測成本， 也是解決CRP分析法無法在資源稀缺地區(qū)普及的關鍵。臨床需求決定了CRP分析方法的未來研究方向， 也提示需要繼續(xù)深入改進CRP分析方法， 尤其需要分析化學、臨床醫(yī)學、材料學、納米科學、物理學等不同學科之間相互交叉、融合、滲透， 建立以“問題解決”研究為中心的研究方法， 以更好地滿足CRP臨床檢檢測需求。

References

1?Thompson D， Pepys M B， Wood S P. Structure， 1999， 7（2）： 169-177

2?Ansar W， Ghosh S. Immunol. Res.， 2013， 56（1）： 131-142

3?Vashist S K， Venkatesh A G， Marion Schneider E， Beaudoin C， Luppa P B， Luong J H T. Biotechnol. Adv.， 2016， 34（3）： 272-290

4?Roy N， Ohtani K， Matsuda Y， Mori K， Hwang I， Suzuki Y， Inoue N， Wakamiya N. Biochim. Biophys. Acta， 2016， 1860（6）： 1118-1128

5?Perrone S， Lotti F， Longini M， Rossetti A， Bindi I， Bazzini F， Belvisi E， Sarnacchiaro P， Scapellato C， Buonocore G. Arch. Dis. Child. Fetal. Neonatal Ed.， 2018， 103（2）： F163-F166

6?Pierrakos C， Vincent J L. Critical Care， 2010， 14（1）： 1-18

7?Zoico E， Corzato F， Bambace C， Rossi A P， Micciolo R， Cinti S， Harris T B， Zamboni M. Arch. Gerontol. Geriatr.， 2013， 57（3）： 411-416

8?Bano G， Trevisan C， Carraro S， Solmi M， Luchini C， Stubbs B， Manzato E， Sergi G， Veronese N. Maturitas， 2017， 96： 10-15

9?Mc Causland F R， Claggett B， Burdmann E A， Eckardt K U， Kewalramani R， Levey A S， McMurray J J V， Parfrey P， Remuzzi G， Singh A K， Solomon S D， Toto R D， Pfeffer M A. Am. J. Kidney Dis.， 2016，?68（6）： 873-881

10?Kolkhir P， Altrichter S， Hawro T， Maurer M. Allergy，?2018， 73（4）： 940-948

11?Misiak B， Stanczykiewicz B， Kotowicz K， Rybakowski J K， Samochowiec J， Frydecka D. Schizophr. Res.， 2018， 192：16-29

12?Huang J， Baum Y， Alemozaffar M， Ogan K， Harris W， Kucuk O， Master V A. Mol. Aspects Med.， 2015， 45： 28-36

13?Clark T W， Medina M J， Batham S， Curran M D， Parmar S， Nicholson K G. Eur. Respir. J.， 2015， 45（1）： 76-86

14?Higdon M M， Le T， O′Brien K L， Murdoch D R， Prosperi C， Baggett H C， Brooks W A， Feikin D R， Hammitt L L， Howie S R C， Kotloff K L， Levine O S， Scott J A G， Thea D M， Awori J O， Baillie V L， Cascio S， Chuananon S， DeLuca A N， Driscoll A J， Ebruke B E， Endtz H P， Kaewpan A， Kahn G， Karani A， Karron R A， Moore D P， Park D E， Rahman M Z， Salaudeen R， Seidenberg P， Somwe S W， Sylla M， Tapia M D， Zeger S L， Deloria Knoll M， Madhi S A. Clin. Infect. Dis.， 2017， 64（suppl 3）： 378-386

15?Adamina M， Steffen T， Tarantino I， Beutner U， Schmied B M， Warschkow R. Br. J. Surg.， 2015， 102（6）： 590-598

16?Shishido Y， Fujitani K， Yamamoto K， Hirao M， Tsujinaka T， Sekimoto M. Gastric Cancer，?2016， 19（1）： 293-301

17?Reynolds I S， Boland M R， Reilly F， Deasy A， Majeed M H， Deasy J， Burke J P， McNamara D A. Colorectal Dis.， 2017， 19（9）： 812-818

18?Kassir R， Blanc P， Tibalbo L M B， Breton C， Lointier P. Surg. Endosc.， 2015， 29（6）： 1439-1444

19?Ridker P M. Circ. Res.， 2016， 118（1）： 145-156

20?Avan A， Sany S B T， Ghayour-Mobarhan M， Rahimi H R， Tajfard M， Ferns G. J. Cell. Physiol.， 2018， 233（11）： 8508-8525

21?Bielas H， Meister-Langraf R E， Schmid J P， Barth J， Znoj H， Schnyder U， Princip M， von Kanel R. Eur. J. Prev. Cardiol.， 2018， 25（3）： 298-305

22?Kunutsor S K， Seidu S， Blom A W， Khunti K， Laukkanen J A. Eur. J. Epidemiol.， 2017， 32（8）： 657-667

23?Kwon C H， Kang J G， Lee H J， Kim N H， Sung J W， Cheong E， Sung K C. Europace， 2017， 19（10）： 1643-1649

24?Chandra P， Suman P， Airon H， Mukherjee M， Kumar P. World J. Methodol.， 2014， 4（1）： 1-5

25?Yang X， Shu W X， Wang Y Q， Gong Y， Gong C Y， Chen Q S， Tan X T， Peng G D， Fan X D， Rao Y J. Biosens. Bioelectron.， 2019， 131： 60-66

26?Kim W J， Cho H Y， Jeong B， Byun S， Huh J， Kim Y J. Sensors， 2017， 18（1）： 55-66

27?Hu J， Zhang Z L， Wen C Y， Tang M， Wu L L， Liu C， Zhu L， Pang D W. Anal. Chem.， 2016， 88（12）： 6577-6584

28?Wu R L， Zhou S， Chen T， Li J J， Shen H B， Chai Y J， Li L S. Anal. Chim. Acta， 2018， 1008： 1-7

29?Swanson C， D′Andrea A. Chem. Commun.， 2013， 59（4）： 641-648

30?Park K M， Chung D J， Choi M， Kang T， Jeong J. Nano Converg.， 2019， 6（1）： 35-40

31?Oh J， Joung H A， Han H S， Kim J K， Kim M G. Theranostics， 2018， 8（12）： 3189-3197

32?Rey E G， O′Dell D， Mehta S， Erickson D. Anal. Chem.， 2017， 89（9）： 5095-5100

33?Letchumanan I， Arshad M K M， Balakrishnan S R， Gopinath S C B. Biosens. Bioelectron.， 2019， 130： 40-47

34?Zhang X， Hu R， Zhang K， Bai R， Li D， Yang Y. Methods-UK， 2016， 8（32）： 6202-6207

35?Vance S A， Sandros M G. Sci. Rep.， 2014，?4： 5129

36?Yu R J， Ma W， Liu X Y， Jin H Y， Han H X， Wang H Y， Tian H， Long Y T. J. Nanobiotecg.， 2016， 6（10）： 1732-1739

37?Zhang L L， Tong S， Zhou J， Bao G. Theranostics， 2016， 6（9）： 1353-1361

38?Reghuram S， Arivarasan A， Kalpana R， Jayavel R. J. Exp. Nanosci.， 2015， 10（10）： 787-802

39?O′Reilly E J， Conroy P J， Hearty S， Keyes T E， O′Kennedy R， Forster R J， Dennany L. RSC Adv.， 2015， 5（83）： 67874-67877

40?Koukouvinos G， Petrou P， Misiakos K， Drygiannakis D， Raptis I， Stefanitsis G， Martini S， Nikita D， Goustouridis D， Moser I， Jobst G， Kakabakos S. Biosens. Bioelectron.， 2016， 84： 89-96

41?Zubiate P， Zamarreno C R， Sanchez P， Matias I R， Arregui F J. Biosens. Bioelectron.， 2017， 93： 176-181

42?Iwasaki Y， Kimura T， Orisaka M， Kawasaki H， Goda T， Yusa S. Chem. Commun.， 2014， 50（42）： 5656-5658

43?Lee S H， Choi S， Kwon K， Bae N-H， Kwak B S， Cho W C， Lee S J， Junga H I. Sens. Actuators B， 2017， 246： 471-476

44?Fock J， Parmvi M， Stromberg M， Svedlindh P， Donolato M， Hansen M F. Biosens. Bioelectron.， 2017， 88： 94-100

45?Yang Z， Liu Y， Lei C， Sun X C， Zhou Y. Microchim. Acta， 2015， 182（15-16）： 2411-2417

46?Zhang Y， Rojas O J. Biomacromolecules， 2017， 18（2）： 526-534

47?Ouyang M， Di Carlo D. Biosens. Bioelectron.， 2019， 132： 162-170

48?Belushkin A， Yesilkoy F， Altug H. ACS Nano， 2018， 12（5）： 4453-4461

49?Sinha A， Tai T Y， Li K H， Gopinathan P， Chung Y D， Sarangadharan I， Ma H P， Huang P C， Shiesh S C， Wang Y L， Lee G B. Biosens. Bioelectron.， 2019， 129： 155-163

50?Chu C H， Sarangadharan I， Regmi A， Chen Y W， Hsu C P， Chang W H， Lee G Y， Chyi J I， Chen C C， Shiesh S C， Lee G B， Wang Y L. Sci. Rep.， 2017， 7： 5256

51?Gao J， Meyer K， Borucki K， Ueland P M. Anal. Chem.， 2018， 90（5）： 3366-3373

52?Ko J A， Lim H B. Anal. Chim. Acta， 2016， 938： 1-6

53?Tugirimana P L， Drieghe S A， Alsaadi H， Delanghe J R. Clin. Chem. Lab. Med.， 2014， 52（6）： 861-867

54?Vashist S K， Czilwik G， van Oordt T， von Stetten F， Zengerle R， Marion Schneider E， Luong J H T. Anal. Biochem.， 2014， 456： 32-37

55?Hwang A， Kim E， Moon J， Lee H， Lee M， Jeong J， Lim E K， Jung J， Kang T， Kim B. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2019， 11（21）： 18960-18967

56?Wang J C， Guo J J， Zhang J J， Zhang W J， Zhang Y Z. Biosens. Bioelectron.， 2017， 95： 100-105

57?Xie J， Tang M Q， Chen J， Zhu Y H， Lei C B， He H W， Xu X H. Talanta， 2020，?217： 121-127

58?Kuo Y C， Lee C K， Lin C T. Biosens. Bioelectron.， 2018， 103： 130-137

59?Wang S F， Luo J J， He Y， Chai Y Q， Yuan R， Yang X. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2018， 10（39）： 33707-33712

60?Lee W S， Sunkara V， Han J R， Park Y S， Cho Y K. Lab Chip， 2015， 15（2）： 478-485

61?Wang T T， Lio C K， Huang H， Wang R Y， Zhou H， Luo P， Qing L S. Talanta， 2020， 206： 120211

62?Vashist S K， van Oordt T， Schneider E M， Zengerle R， von Stetten F， Luong J H T. Biosens. Bioelectron.， 2015， 67： 248-255

63?Dong M L， Wu J D， Ma Z M， Peretz-Soroka H， Zhang M， Komenda P， Tangri N， Liu Y， Rigatto C， Lin F. Sensors， 2017， 17（4）： 684

64?Ji T H， Liu D， Liu F， Li J X， Ruan Q Y， Song Y L， TIian T， Zhu Z， Zhou L J， Lin H， Yang C Y， Wang D. Chem. Commun.， 2016， 52（54）： 8452-8454

65?Lin B Q， Liu D， Yan J M， Qiao Z， Zhong Y X， Yan J W， Zhu Z， Ji T H， Yang C Y J. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2016， 8（11）： 6890-6897

66?Joung H A， Oh Y K， Kim M G. Biosens. Bioelectron.， 2014， 53： 330-335

67?Kim K， Joung H A， Han G R， Kim M G. Biosens. Bioelectron.， 2016， 85： 422-428

68?Tsai M Z， Hsiung C T， Chen Y， Huang C S， Hsu H Y， Hsieh P Y. Analyst， 2018， 143（2）： 503-510

69?Qi X P， Huang Y Y， Lin Z S， Xu L， Yu H. Nanoscale Res. Lett.， 2016， 11： 1-8

70?Lv Y B， Wang F F， Li N， Wu R L， Li J J， Shen H B， Li L S， Guo F. Sens. Actuators B， 2019， 301： 118-127

71?Park J， Park J K. Sens. Actuators B，?2017， 246： 1049-1055