彭琳秀 謝彤 單進軍

摘?要?以異煙肼（INH，100 mg/（kg·d，ig））和RIF（RIF，100 mg/（kg·d，ig））為模型藥物，連續(xù)灌胃14天誘導建立抗結(jié)核藥大鼠腎損傷模型，以組織病理學、血清生化指標（尿素氮、肌酐）為考察對象，觀察抗結(jié)核藥物引起的腎損傷嚴重程度; 采用基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學技術(shù)結(jié)合偏最小二乘法-判別分析等多維、單維統(tǒng)計方法探討INH聯(lián)用RIF對大鼠腎組織中內(nèi)源性小分子化合物的代謝影響。采用對抗結(jié)核藥物引起的組織細胞損傷具有保護作用的谷胱甘肽（GSH，250 mg/（kg·d，iv）對大鼠進行干預治療，從代謝調(diào)控的角度闡明GSH發(fā)揮保腎的作用機制。組織病理學及血清生化結(jié)果顯示，大鼠給予INH和RIF后，血清中尿素氮和肌酐水平顯著升高（p<0.05），腎小管上皮中度空泡變性，提示腎組織出現(xiàn)損傷。代謝組學數(shù)據(jù)提示，結(jié)核藥物聯(lián)用導致了大鼠腎組織中酪氨酸、脯氨酸、尿苷、棕櫚油酸等31個內(nèi)源性物質(zhì)代謝紊亂; 主要導致了大鼠脂肪酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝異常。GSH能降低大鼠血清中尿素氮的水平（p<0.05），減輕大鼠腎小球系膜的增生情況; GSH能夠通過調(diào)控腎組織中棕櫚油酸、4-羥基丁酸、瓜氨酸、葡糖酸內(nèi)酯、胍基乙酸和哌啶酸的代謝水平有效改善抗結(jié)核藥物引起的大鼠腎組織損傷。

關(guān)鍵詞?抗結(jié)核藥; 腎損傷; 谷胱甘肽; 代謝組學; 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

1?引 言

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的一種慢性傳染病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的《全球結(jié)核病報告》，2016年全球約有1040萬新發(fā)結(jié)核病病例，130萬人死于該病[1]。異煙肼（Isoniazid，INH）[2]和利福平（Rifampicin，RIF）[3]均是WHO推薦的一線抗結(jié)核藥物，常聯(lián)合使用，用于治療結(jié)核病。然而，臨床研究發(fā)現(xiàn)，INH和RIF聯(lián)合使用可導致患者出現(xiàn)藥物性肝損傷癥狀[4，5]。INH的毒性代謝產(chǎn)物肼會引起不可逆的肝細胞損傷和炎癥[6]; RIF能夠使肝臟出現(xiàn)壞死斑點，甚至出現(xiàn)彌漫性的壞死帶，肝臟細胞伴有脂肪變性現(xiàn)象[7]。有文獻報道，使用INH和RIF會造成腎組織損傷[8，9]，但其致?lián)p機制未見報道。

代謝組學通過研究生物體對病理生理刺激或基因修飾產(chǎn)生的代謝物的質(zhì)和量的動態(tài)變化表征機體受影響程度[10～12]，其作為評價藥物安全性的有效手段在毒理學研究中得到廣泛應用。Zhao等[13]基于非靶標代謝組學研究發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)代謝紊亂是馬兜鈴酸引發(fā)機體腎毒性的重要代謝特征; Xia等[14]對小鼠腎組織中內(nèi)源性代謝物進行檢測，揭示了順鉑誘導腎臟損傷與干擾脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝有關(guān); 此外，某些中藥藥對的配伍減毒機制也在代謝層面得到了科學論證[15]。采用代謝組學技術(shù)進行藥物腎毒性監(jiān)控，有助于尋找特異性的毒性生物標志物、確定藥物的毒性機制，對指導臨床用藥意義重大。然而，目前未見采用代謝組學技術(shù)研究聯(lián)合使用INH和RIF致腎損傷的機制的報道。

本研究以“INH+RIF”為模型藥物，建立了抗結(jié)核藥大鼠腎損傷模型，同時采用對機體急性腎損傷具有保護作用的谷胱甘肽[16，17]進行干預治療，基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）的代謝組學技術(shù)，研究大鼠在使用抗結(jié)核藥物后腎組織中內(nèi)源性代謝物的變化特征，結(jié)合組織病理學檢查及生化指標分析，揭示INH和RIF聯(lián)用致大鼠腎損傷機制以及評價谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的治療效果。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Trace1310-TSQ8000Evo三重四極桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Savant SPD1010 真空離心濃縮儀（美國Thermo Scientific公司）; Allegra64R高速冷凍離心機（美國Beckman公司）; Vortex-Genie 2渦旋振蕩器（美國Scientific industries公司）; CPA225D型電子天平（德國Sartorius公司）; THZ-C恒溫振蕩儀（太倉市強樂實驗設備有限公司）。

異煙肼片（批號：1612051）和利福平膠囊（批號：1710011）（沈陽紅旗制藥有限公司）; 注射用還原型GSH（批號：0811020，重慶藥友制藥有限公司提供）。羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，批號：20161015，成都市科龍化工試劑廠）; 甲氧基胺鹽酸鹽（98%）、吡啶（99.8%）、N-O-雙（三甲硅基）三氟乙酰胺（BSTFA，98.5%）、 1，2-13C肉豆蔻酸（99%）均購于美國Sigma-Aldrich公司; 甲醇購于美國Merck公司; 實驗用水為超純水。

2.2?實驗方法

2.2.1?藥物配制?取適量異煙肼片研磨成細粉，用0.5% CMC-Na溶液溶解，配制成5 mg/mL的INH混懸液; 取適量利福平膠囊內(nèi)容物，加0.5% CMC-Na溶液溶解，配制成5 mg/mL的RIF混懸液。

2.2.2?動物模型制備及給藥方案?28只SPF級雄性Wistar大鼠（180～220 g），購于北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2015-0007，實驗遵循南京中醫(yī)藥大學實驗動物飼養(yǎng)原則。實驗前，大鼠置于相對溫度為（22±2）℃、相對濕度為45%～60%、12 h晝夜循環(huán)的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)5天，自由飲食，飲水。

將28只Wistar大鼠隨機分為空白對照組（Control，n=10）、模型組（Model，n=10）和GSH干預組（GSH，n=8）。模型組和GSH干預組大鼠于第1天同時分別灌胃給予INH（100 mg/（kg·d））、RIF（100 mg/（kg·d），每天一次，連續(xù)灌胃14天，用于制備大鼠腎損傷模型。空白對照組灌胃給予等體積0.5% CMC-Na溶液（10 mL/（kg·d））作為空白對照。同時，從造模第1天起至第14天，GSH干預組大鼠尾靜脈注射還原型GSH（250 mg/（kg·d））; 空白對照組和模型組尾靜脈注射等體積生理鹽水。

2.2.3?樣本收集及前處理?末次給藥2 h后，采集大鼠腹主動脈血液，血液樣本在室溫靜置1 h后分離血清，用于測定尿素氮和肌酐的水平。取大鼠同一部位的腎臟組織固定于福爾馬林中，進行HE染色，分析組織病變情況。同時，采集大鼠腎組織樣本，立即置于液氮中淬滅，再置于80℃保存，用于代謝組學分析。

稱取20 mg腎組織，加入0.2 mL水研磨，取50 μL勻漿液置于含有10 μL 1，2-13C 肉豆蔻酸內(nèi)標溶液的1.5 mL EP管中，加入200 μL甲醇，渦旋混勻后離心，取100 μL上清液置于另一個干凈EP管中，并放置于離心濃縮儀中揮干。向揮干后的樣本中加入30 μL 10 mg/mL甲氧胺吡啶溶液，渦旋5 min后置于恒溫振蕩儀中振蕩1.5 h，加入30 μL BSTFA（含1% TMS），混勻，振蕩0.5 h。衍生化后的樣本在4℃以18000 r/min離心10 min，吸取上清液，進樣分析。

實驗過程中，為評估實驗操作誤差及儀器系統(tǒng)穩(wěn)定性，通過將各樣本腎組織勻漿液等量混合，制備質(zhì)量控制樣本（QC），同其它實驗樣本平行操作，進行樣本前處理。

2.2.4?GC-MS分析條件?色譜柱： TG-5MS毛細管色譜柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm，Thermo公司）; 載氣： 高純氦氣（純度>99.999 %）; 氣流速度： 1.2 mL/min; 進樣量： 1 μL; 分流比： 20∶1; 升溫程序： 0～1 min，60℃; 1～14 min，60～320℃; 14～19 min，320℃。質(zhì)譜電離方式： 電子電離源（EI）; 電離能量： 70 eV; 傳輸線溫度： 250℃; 離子源溫度： 280℃; 采用全掃描，掃描范圍： 50～500 m/z。采用GC-MS分析樣本前先進5針QC以平衡系統(tǒng)，之后每進10針實驗樣本后進1針QC樣本，以監(jiān)控及考察儀器穩(wěn)定性。此外，進樣前后采用GC-MS分析飽和脂肪酸甲酯混合標準品溶液（C8，C9，C10～C30的偶數(shù)碳鏈），計算保留指數(shù)，輔助代謝物定性分析。

2.2.5?數(shù)據(jù)處理?原始GC-MS文件，經(jīng)Abf Converter轉(zhuǎn)換格式后，導入MS-DIAL數(shù)據(jù)處理軟件進行數(shù)據(jù)預處理，處理過程包括峰提取、物質(zhì)鑒定、峰對齊等。提取得到的色譜峰根據(jù)保留指數(shù)和碎片離子峰與FiehnLib數(shù)據(jù)庫[18]進行代謝物匹配，相似度>80%的代謝物將和NIST庫進行碎片離子峰匹配，以驗證代謝物鑒定的準確性。最終得到包含樣本名稱、代謝物信息（包含代謝物名稱、保留時間及質(zhì)荷比信息）及峰高值的三維矩陣數(shù)據(jù)集。矩陣數(shù)據(jù)經(jīng)Loess和Pareto scaling歸一化后采用MetaboAnalyst 4.0在線網(wǎng)站進行偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）及正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）。經(jīng)Loess校準后的數(shù)據(jù)采用基于One-way ANOVA的非參數(shù)檢驗，即Kruskal-Wallis 檢驗進行多組間及兩兩組間差異性比較。模型組與空白對照組及GSH干預組分別比較，當代謝物滿足組間兩兩比較Fold change>1.2或<0.83且p<0.05時，提示此物質(zhì)為組間差異性代謝物。

3?結(jié)果與討論

3.1?組織病理學及生化指標分析

腎組織HE染色結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)明顯的腎損傷，其腎小管上皮中度空泡變性，部分大鼠腎小球系膜出現(xiàn)輕度增生，但未見壞死或萎縮。與模型組比較，采用GSH干預的大鼠腎組織炎癥癥狀減輕（圖1A～1C）。為研究INH和RIF聯(lián)用致大鼠腎損傷情況及評價GSH的治療作用，分析比較了各組大鼠血清肌酐（CREA）和尿素氮（BUN）的差異。與空白對照組相比，模型組大鼠血清中CREA和BUN的含量顯著升高。CREA是肌肉在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，主要由腎小球濾過排出體外，當腎功能不全時，CREA在體內(nèi)蓄積成為對人體有害的毒素。BUN是血漿中除蛋白質(zhì)以外的一種含氮化合物，能經(jīng)腎小球濾過排出體外，BUN的異常升高提示腎小球濾過功能受損。上述研究結(jié)果均提示，大鼠給予INH和RIF后出現(xiàn)了嚴重的腎臟損傷，GSH能夠通過調(diào)節(jié)大鼠血清中BUN水平而發(fā)揮療效。

3.2?腎組織非靶標代謝輪廓分析

GC-MS技術(shù)常用于分析揮發(fā)性化合物，多數(shù)難揮發(fā)性的化合物通過衍生化處理也可被檢測到。從大鼠腎組織中鑒定得到包含氨基酸、脂肪酸和嘌呤等121個小分子化合物，大鼠腎組織樣本總離子流圖及部分代謝物碎片峰與NIST庫對比圖見圖2。將得到的矩陣數(shù)據(jù)經(jīng)Loess歸一化后繪制實驗樣本與QC樣本的PCA得分圖（圖3A），藍色點表示QC樣本，QC樣本聚集于95%的置信區(qū)間; 同時計算各代謝物在QC樣本中的峰高的RSD值，多數(shù)物質(zhì)在QC樣本中的變異度小于20%（圖3B），表明實驗操作及儀器穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。采用PLS-DA分析大鼠給予INH和RIF后腎組織內(nèi)的代謝物的變化趨勢（圖4A），PLS-DA圖中每個點代表一個樣本，樣本間距離越小表示其代謝狀態(tài)越相似。對模型進行置換檢驗，判斷模型是否過擬合，結(jié)果顯示p<0.05（圖4B），表明模型穩(wěn)定可靠。直觀地分析PLS-DA圖可知，空白對照組與模型組及GSH干預組均區(qū)分比較明顯，GSH干預組的樣本在圖上更接近于空白對照組，GSH具有調(diào)節(jié)代謝輪廓向空白對照組逆轉(zhuǎn)的趨勢，說明GSH干預后能促進差異性小分子代謝物向正常水平回調(diào)。對3組大鼠代謝輪廓兩兩進行OPLS-DA分析，GSH組與模型組亦區(qū)分較好，GSH的使用顯著調(diào)控了藥物性腎損傷大鼠體內(nèi)的小分子內(nèi)源性物質(zhì)。

模式判別分析結(jié)果表明，INH和RIF聯(lián)用對大鼠腎組織代謝產(chǎn)生了顯著影響，結(jié)合生化指標分析結(jié)果，推測抗結(jié)核藥物導致了大鼠腎組織功能受損，影響了機體代謝。GSH對腎組織中內(nèi)源性代謝物有顯著的調(diào)控作用，但是，對產(chǎn)生影響的內(nèi)源性代謝物進行篩選則需要以組別為單變量進行統(tǒng)計分析。

3.3?差異性代謝物及代謝通路分析

將空白對照組、GSH干預組分別與模型組兩兩比較進行統(tǒng)計分析，以p<0.05及Fold change>1.2或<0.83為篩選標準，篩選得到由于藥物性腎損傷或GSH干預產(chǎn)生的差異性代謝物?？菇Y(jié)核藥物導致了大鼠腎組織中31種內(nèi)源性代謝物發(fā)生變化，GSH對其中12種代謝物有調(diào)控作用。

將篩選得到的差異性代謝物進行富集分析，繪制INH和RIF聯(lián)用對機體造成干擾的代謝通路（見圖5），每種代謝物旁的表格標注了該代謝物在各組間的變化趨勢，以棕櫚油酸為例，與空白對照組相比，模型組腎組織中的棕櫚油酸顯著上調(diào)，GSH作用后，腎組織中棕櫚油酸的代謝水平下調(diào)。結(jié)合表1可知，抗結(jié)核藥物的聯(lián)用主要導致了機體內(nèi)精氨酸和脯氨酸代謝、脂肪酸合成異常。

由圖5和表1可知，從腎組織中篩選出多種飽和及不飽和脂肪酸（油酸、亞油酸、棕櫚油酸和花生酸等），與抗結(jié)核藥物的使用有關(guān)，說明腎組織合成脂肪酸的功能受損。多烯不飽和脂肪酸會與自由基反應，造成脂質(zhì)過氧化[19]，抗結(jié)核藥物聯(lián)用造成多種不飽和脂肪酸代謝水平升高，提示脂質(zhì)過氧化的形成。研究表明，當組織受到毒性損害時，可誘導生成大量自由基，引起過氧化損傷，加快GSH消耗或使其合成受到抑制，因此，外源性補充還原型GSH可有效彌補機體GSH代謝不足[20]。

腎臟內(nèi)富含氨基酸分解代謝所需的酶，在氨基酸體內(nèi)平衡中起重要作用。組織中多個氨基酸水平發(fā)生變化，反映了蛋白質(zhì)代謝異常，表明腎功能受損。蛋氨酸，亦稱甲硫氨酸，是參與蛋白質(zhì)合成的必需氨基酸，甲硫氨酸缺乏會導致蛋白質(zhì)合成受阻。與空白對照組相比，模型組大鼠腎組織中的甲硫氨酸含量顯著上調(diào); 生物體處于氧化應激狀態(tài)下產(chǎn)生的活性氧能將甲硫氨酸殘留物氧化成甲硫氨酸亞砜，后者在甲硫氨酸還原酶作用下還原成甲硫氨酸，因此甲硫氨酸殘基可作為清除活性氧的抗氧化劑。GSH是甲硫氨酸的代謝產(chǎn)物，還原型GSH能促進體內(nèi)氧自由基清除，避免活性氧和氧自由基產(chǎn)生過氧化脂質(zhì)，導致組織過氧化損傷[19]。INH在體內(nèi)經(jīng)代謝產(chǎn)生的毒性產(chǎn)物肼易引發(fā)氧化應激，從而導致線粒體損傷。線粒體是機體進行氧化代謝的部位，是糖類、脂肪、氨基酸代謝釋放能量的場所[21]。本研究中，腎損傷大鼠腎組織中葡萄糖、乳酸、葡萄糖酸內(nèi)酯、磷酸的含量較空白對照組降低，表明葡萄糖等在INH和RIF聯(lián)用引起的腎損傷中作為能量物質(zhì)利用率增加。GSH作為一種重要的代謝調(diào)節(jié)物，能激活巰基酶、輔酶等多種酶，從而促進糖類、脂肪及蛋白質(zhì)代謝。本研究中，GSH主要調(diào)控了葡糖酸內(nèi)酯的代謝[22]。

精氨酸是尿素循環(huán)過程中的核心物質(zhì)，是合成一氧化氮（NO）的唯一底物，參與免疫和血管張力調(diào)節(jié)。在腎臟中，NO主要擴張入球小動脈，增加腎小球血流灌注。本研究中，精氨酸的多個下游代謝產(chǎn)物（瓜氨酸、脯氨酸、胍乙酸）出現(xiàn)代謝異常。近年的研究表明，精氨酸在機體代謝過程中發(fā)揮了重要作用，哺乳動物補充精氨酸有利于維持腸道微生態(tài)平衡，修復腸黏膜損傷[23]。精氨酸的合成基本發(fā)生在小腸上皮細胞，上皮細胞會吸收谷氨酰胺及谷氨酸代謝產(chǎn)生瓜氨酸，再在腎小管細胞協(xié)助下抽取出來轉(zhuǎn)化為精氨酸。 因此，腎臟受到損害時，精氨酸相關(guān)代謝物會受到干擾。胍乙酸由精氨酸在L-精氨酸-甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下合成，而胍乙酸可在胍基乙酸甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，結(jié)合甲硫氨酸提供的甲基而轉(zhuǎn)化成肌酸。腎臟中生成的胍乙酸和肌酸水平降低反映了腎臟損傷造成的腎臟合成功能降低[24]。由圖6可見，GSH顯著回調(diào)了精氨酸代謝通路中瓜氨酸和胍基乙酸的代謝水平。

4?結(jié) 論

通過組織病理學觀察和血清生化指標的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，INH和RIF聯(lián)用會造成大鼠腎組織嚴重損傷。采用基于GC-MS的非靶標代謝組學分析方法，從生物體代謝狀態(tài)的角度全面分析比較了藥物性腎損傷大鼠內(nèi)源性代謝物的擾動程度。INH聯(lián)用 RIF導致了大鼠腎組織中31種內(nèi)源性物質(zhì)的代謝水平發(fā)生變化，對腎組織代謝產(chǎn)生了較為顯著的影響，兼具抗氧化作用和解毒作用的GSH有效緩解了大鼠腎損傷的狀況，并通過調(diào)節(jié)腎組織中棕櫚油酸等物質(zhì)的代謝水平發(fā)揮療效。

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