王小強(qiáng), 王 超, 潘美紅, 陳 韓

(中國石油大學(xué)生物工程與技術(shù)中心蛋白質(zhì)分子工程實驗室,山東青島 266580)

在生命體系中,氧化反應(yīng)通過金屬蛋白酶(如過氧化物酶)的催化作用來實現(xiàn)[1],該反應(yīng)在常壓、室溫和水相中進(jìn)行,并且大多數(shù)情況下催化活性位點(diǎn)為環(huán)境友好的鐵元素。大多數(shù)催化氧化反應(yīng)的金屬酶活性部位是一個較寬的疏水“口袋”,用于容納氯化血紅素輔酶和底物。氯化血紅素的化學(xué)結(jié)構(gòu)為鐵(Ⅲ)卟啉,本身不溶于酸性和中性水溶液,很容易聚集,同時在大多數(shù)的有機(jī)溶液中溶解性也很差。氯化血紅素可與各種氧供體化合物(如亞碘酰苯、過氧酸、過氧化氫、烷基氫過氧化物、次氯酸鈉、過硫酸氫鉀等)發(fā)生反應(yīng)生成Fe(Ⅴ)-O復(fù)合體以催化底物氧化[2]。由于過氧化氫是一種溶于水的環(huán)境友好型氧化劑,反應(yīng)副產(chǎn)物為水,所以體外模擬研究大多數(shù)都使用過氧化氫作為氧原子供體[3-5]。烷基糖苷由脂肪醇和葡萄糖合成,是一種性能較全面的新型非離子生物表面活性劑,具有起泡性好、溶解性強(qiáng)、耐強(qiáng)堿和電解質(zhì)、生物相容性好等特點(diǎn),是公認(rèn)的“綠色”功能性表面活性劑[6-8]。DDM膠束能夠很好地溶解和穩(wěn)定氯化血紅素,形成的復(fù)合體系具有類似過氧化酶的催化能力?；诜律瘜W(xué)與綠色化學(xué)的理念,筆者采用烷基糖苷類非離子表面活性劑十二烷基-β-D-麥芽糖苷(DDM),利用它在水溶液中形成穩(wěn)定、中心疏水的膠束結(jié)構(gòu),構(gòu)建其與氯化血紅素形成的復(fù)合膠團(tuán),考察該體系的催化氧化性能，并測定其相關(guān)反應(yīng)動力學(xué)常數(shù),探討反應(yīng)機(jī)制。

1 實 驗

1.1 試劑和儀器

試劑:氯化血紅素(hemin),Frontier Scientific生產(chǎn);十二烷基-β-D-麥芽糖苷(DDM),SIGMA生產(chǎn);過氧化氫(H2O2),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);酸性橙(Orange Ⅱ),北京百靈威科技有限公司生產(chǎn)。

儀器:動態(tài)光散射儀;紫外可見分光光度計,附恒溫水浴鍋;吸光度均用10mm 比色皿;HI8424便攜式防水pH酸度計(哈納沃德儀器(北京)有限公司);KQ-100KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 氯化血紅素母液的配置

含10% DDM的1 mmol/L氯化血紅素母液:用1 mL濃度為20 mmol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液溶解0.652 mg氯化血紅素和0.1 gDDM,超聲10 min混勻,使氯化血紅素更好的分散,并放于4 ℃冰箱中貯存,如圖1所示,用于后續(xù)實驗。實驗時將母液用不同pH值的10 mmol/LPBS緩沖液進(jìn)行稀釋,所得溶液pH值不會因氯化血紅素溶液中氫氧化鈉的存在而發(fā)生變化。不含DDM的氯化血紅素母液:直接用20 mmol/L氫氧化鈉溶液溶解0.652 mg氯化血紅素,實驗時再用PBS緩沖液進(jìn)行稀釋。

圖1 氯化血紅素-DDM復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和催化過程Fig.1 Structure of hemin-DDM complex and catalytic process

1.2.2 氯化血紅素-DDM復(fù)合體系表征

分別利用動態(tài)光散射儀和紫外可見分光光度計對氯化血紅素和氯化血紅素-DDM復(fù)合體系進(jìn)行分析與比較。利用動態(tài)光散射儀測定氯化血紅素與氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)的水力直徑分布,參數(shù)設(shè)定時將測定類型設(shè)為粒徑,分散劑選定為水,溫度設(shè)置為25 ℃,平衡時間為120 s,池子型號選用ZEN2112。首先測得含DDM的PBS緩沖液的水力直徑分布并作為空白對照,然后用PBS緩沖液(pH值為7)稀釋氯化血紅素和氯化血紅素-DDM復(fù)合體系至終濃度為150 μmol/L,再使用動態(tài)光散射儀表征和對比兩種溶液的水力直徑分布情況。

為進(jìn)一步驗證氯化血紅素的分散情況,實驗用pH值為7.0的PBS緩沖液將氯化血紅素和氯化血紅素-DDM復(fù)合體系稀釋到濃度為25 μmol/L,然后通過測定其紫外可見吸收光譜進(jìn)行分散情況分析。同時,作為對照實驗,用氫氧化鈉溶液將氯化血紅素母液稀釋到25 μmol/L,并記錄氯化血紅素其其紫外可見吸收光譜。

1.2.3 催化動力學(xué)

在催化劑的作用下,酸性橙會被過氧化氫快速氧化降解(圖2)。氯化血紅素在不同的pH值和溫度下,將0.25 mmol/L的酸性橙溶液,6.85 mmol/L的H2O2溶液和不同濃度的氯化血紅素溶液以相同體積混合。酸性橙在紫外可見分光光度計上的特征吸收峰在509 nm處。催化反應(yīng)動力學(xué)實驗過程中,記錄酸性橙509 nm處吸光度隨時間的變化。分別配置pH值為5、6、7、8的PBS緩沖液,并用不同pH值的PBS緩沖液分別稀釋氯化血紅素母液,使其達(dá)到所需的濃度及pH值。溫度的控制則通過與分光光度計配套的循環(huán)恒溫水浴來實現(xiàn)。

圖2 酸性橙被過氧化氫氧化降解過程Fig.2 Degradation of Orange Ⅱ by H2O2 with hemin-DDM as a catalyst

研究氯化血紅素對底物的催化的動力學(xué)參數(shù)時,通過固定一個底物濃度和同時改變另一個底物濃度,測定酸性橙的降解過程,并根據(jù)Linerweaver-Burk模型擬合求得相應(yīng)參數(shù)。固定酸性橙濃度為0.25 mmol/L,設(shè)置過氧化氫濃度梯度(1、2、4、8、16 mmol/L),催化劑氯化血紅素濃度為150 μmol/L,測得反應(yīng)動力學(xué);同理,固定過氧化氫濃度為6.85 mmol/L,設(shè)置酸性橙濃度梯度(0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 mmol/L),催化劑氯化血紅素濃度為150 μmol/L,測得反應(yīng)動力學(xué)。

首先通過測定一系列不同溫度下酸性橙在509 nm處的吸光系數(shù)并取平均,獲得可靠的的摩爾吸光系數(shù)(ε509 nm)。反應(yīng)的初速度可通過以下方程求得:

Δc=Δfabs/(εb),v=Δc/Δt.

式中,fabs為吸收峰的強(qiáng)度;ε為摩爾吸光系數(shù);b為光程(光透過池子的厚度);c為底物濃度;t為時間;v為初速率。

米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(vmax)通過Linerweaver-Burk模型計算得到。Linerweaver-Burk模型是米氏方程通過取雙倒數(shù)所得。實驗得到的數(shù)據(jù)通過以下方程進(jìn)行分析:

式中,S為底物濃度。

測出不同底物濃度下的初速率,然后Km和vmax可以通過直線擬合v和S的倒數(shù)來獲得。

根據(jù)前期探索實驗,催化反應(yīng)均在60 min內(nèi)基本完成,通過以下方程求得不同條件下反應(yīng)60 min后的轉(zhuǎn)化率,并進(jìn)行比較分析:

y=(A0-A60)/A0.

式中,A0為0時刻酸性橙的吸光度;A60為反應(yīng)60 min后的吸光度。

2 結(jié)果分析

2.1 氯化血紅素-DDM復(fù)合體系表征

氯化血紅素非常難溶于酸性和中性介質(zhì)中,同時在大多數(shù)有機(jī)溶劑中的溶解性也很差。由于氯化血紅素有兩個羧基,在堿性溶液中通常會有相對好的溶解性。分別配置氯化血紅素的NaOH水溶液(氯化血紅素濃度為1 mmol/L)和含10%DDM的氯化血紅素的NaOH溶液(1 mmol/L),用PBS緩沖液(pH值為7)稀釋至氯化血紅素終濃度為150 μmol/L,使用動態(tài)光散射儀表征和對比了2種情況下,氯化血紅素的水力直徑分布情況,以反映DDM膠束對氯化血紅素的分散和穩(wěn)定能力。作為對照實驗,同時表征了10% DDM溶液的水力直徑分布。結(jié)果見圖3。

圖3 不同體系水力直徑分布Fig.3 Comparsion of different system hydrodynamic diameter distribution

圖3(a)為10%DDM溶液的水力直徑分布情況,圖3(b)為在表面活性劑DDM存在情況下,將氯化血紅素-DDM用PBS緩沖液(pH值為7)稀釋后的水力直徑分布結(jié)果;圖3(c)為在沒有表面活性劑存在的情況下,將氯化血紅素母液用PBS緩沖液(pH值為7)稀釋后的水力直徑分布結(jié)果。動態(tài)光散射儀結(jié)果顯示,DDM膠束的平均水力直徑約為5.1 nm,氯化血紅素-DDM復(fù)合體的平均水力直徑約為5.5 nm,而氯化血紅素的平均水力直徑約為7.3 nm。這表明DDM膠束對氯化血紅素有很好的分散和穩(wěn)定效果,并形成復(fù)合膠團(tuán),而且插入氯化血紅素后對DDM膠束的尺寸影響不大。

為進(jìn)一步驗證氯化血紅素在DDM膠束中有很好的分散性,采用紫外可見分光光譜進(jìn)行比較分析。圖4為25 μmol/L氯化血紅素的氫氧化鈉溶液、氯化血紅素和氯化血紅素-DDM在PBS緩沖液(pH 值為7)中的紫外可見光譜。可以看出,25 μmol/L氯化血紅素在氫氧化鈉溶液中有一個390 nm的特征峰和一個360 nm的肩峰;而25 μmol/L氯化血紅素溶于PBS緩沖液中有一個370 nm的特征峰,表明同時有氯化血紅素二聚體(通過μ-氧橋鍵連接)和單體氯化血紅素氫氧化物存在。μ-氧化二聚體對氯化血紅素在水溶液中的影響非常大,并進(jìn)一步影響氯化血紅素的催化活性[9-10]。氯化血紅素-DDM溶液在404 nm處有吸收峰,為氯化血紅素單體的特征峰,同時伴有一個365 nm的肩峰。這表明DDM形成的膠束將氯化血紅素包裹在里面,同時由于疏水相互作用力,氯化血紅素在DDM中多以單體的形式存在。由此看出:無表面活性劑存在下氯化血紅素多以二聚體的形式存在于水溶液中;在氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)中氯化血紅素多以單體形式存在并伴有少量的氯化血紅素二聚體[11]。

圖4 體系的紫外可見吸收光譜Fig.4 UV-vis spectra of systems

2.2 氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)氧化性能表征

氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)的活性通過酸性橙和過氧化氫作為底物進(jìn)行評估。酸性橙有最簡單的偶氮染料結(jié)構(gòu),并被用來作為一種模式染料用來檢測生物和化學(xué)處理[12]。在過氧化氫酶作為催化劑的條件下,偶氮結(jié)構(gòu)能被過氧化氫破壞[13]。酸性橙降解引起的吸光度降低通過紫外可見分光光度計在509 nm處被檢測。圖5(a)為紫外可見光譜隨反應(yīng)的變化。在過氧化氫、酸性橙和氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)共存時,在509 nm處的吸收光譜降低,該現(xiàn)象表明酸性橙的氧化;而在無氧化劑存在下,以PBS緩沖液代替過氧化氫溶液進(jìn)行體系混合,發(fā)現(xiàn)氯化血紅素的吸收則不會影響酸性橙509 nm處的吸收。

圖5 血紅素的催化活性與溫度、pH值和血紅素濃度的關(guān)系Fig.5 Relations of catalytic activity of temperature, pH value and hemin concentration

2.2.1 催化反應(yīng)初速率

酶的活性依賴于底物和反應(yīng)條件。因此,氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)的催化活性可能依賴于pH值,溫度,氯化血紅素濃度和底物濃度。首先通過不同溫度下酸性橙的摩爾吸光系數(shù),求得酸性橙的平均摩爾吸光系數(shù)為16.3 L/(mmol·cm)(表1),通過其特征性吸收峰的強(qiáng)度變化可以換算成底物濃度的變化,并進(jìn)一步求得催化反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。催化反應(yīng)活性通過2個參數(shù)確定:初速率(v)和1 h內(nèi)的轉(zhuǎn)化率(y)。由圖5(b)～(d)看出:當(dāng)溫度在50 ℃及以下,氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)的催化氧化速率要高于氯化血紅素;當(dāng)pH值小于8,氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)的催化氧化速率均高于氯化血紅素;催化氧化速率依賴于催化劑的濃度,濃度越高,催化氧化速率越快;在150 μmol/L及其以下的濃度時,氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)均比氯化血紅素的催化氧化速率快。

表1 不同溫度下酸性橙的摩爾吸光系數(shù)Table 1 Molar absorption coefficient of Orange Ⅱ in different temperature

2.2.2 轉(zhuǎn)化率

圖6表明:氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)和氯化血紅素的轉(zhuǎn)化率都隨溫度的增加而增加,氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)對溫度的敏感性更大一些,而氯化血紅素的敏感性相對較小一些;氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)和氯化血紅素對pH值都有一定的敏感性,并且氯化血紅素敏感性更大一些;在pH值為8時,氯化血紅素的轉(zhuǎn)化率超過氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)的轉(zhuǎn)化率,這是由于氯化血紅素在堿性條件下更容易溶解,不易形成二聚體,氯化血紅素單體能更好的穩(wěn)定住,從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率的提高;氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)與氯化血紅素對濃度的敏感性較小,在較低濃度與較高濃度的時候,氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)與氯化血紅素的轉(zhuǎn)化率都出現(xiàn)了無規(guī)律的增大和降低現(xiàn)象,可能的原因是氯化血紅素在濃度過低或者過高的時候不穩(wěn)定,易發(fā)生其他反應(yīng)。整體來講,氯化血紅素催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化效率很低,推測原因如下:①氯化血紅素在催化氧化過程中出現(xiàn)自氧化現(xiàn)象,從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率的降低;②氯化血紅素-DDM在催化過程中與底物不能很好地結(jié)合,并且生成的產(chǎn)物不易擴(kuò)散出膠束,最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率低。由此可知,氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)的催化活性受溫度的影響比氯化血紅素大,受pH值和濃度的影響與氯化血紅素相差不大,這表現(xiàn)出氯化血紅素-DDM對環(huán)境條件的變化能有更好的抵抗性。

圖6 氯化血紅素和氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)催化酸性橙氧化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率Fig.6 Conversions of degradation reaction catalyzed by hemin and hemin-DDM micelle

2.2.3 米氏常數(shù)及最大反應(yīng)速率測定

考察底物對氯化血紅素和氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)的催化性能的影響。通過改變實驗中酸性橙和過氧化氫的濃度,確定過氧化物類似酶氯化血紅素和氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)的催化反應(yīng)動力學(xué)參數(shù),結(jié)果見圖7。由圖7可求得Km和vmax(表2)。

圖7 氯化血紅素和氯化血紅素-DDM催化反應(yīng)的Km和vmaxFig.7 Measurement of Km and vmax of reactions catalyzed by hemin and hemin-DDM

催化體系底物Km/(mmol·L-1)vmax/(10-4mmol·L-1·min-1)氯化血紅素OrangeⅡH2O20.22.85.45.3氯化血紅素-DDMOrangeⅡH2O20.14.66.09.2

催化體系與底物之間Km越小,兩者之間的吸附力就越強(qiáng),進(jìn)而表明催化劑有更高的催化效率。從表2看出,氯化血紅素以酸性橙為底物的Km值比氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)的值大一些,而以過氧化氫為底物的Km要小。原因是酸性橙具有苯環(huán)結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了其具有一定的疏水性,使其能很好地進(jìn)入到DDM膠團(tuán)中與氯化血紅素進(jìn)行反應(yīng),所以氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)以酸性橙為底物的Km值較小,酸性橙與氯化血紅素的結(jié)合力較強(qiáng);而過氧化氫是易溶于水的液體,親水性很強(qiáng),導(dǎo)致其不容易進(jìn)入到DDM疏水腔體里面,進(jìn)而影響氯化血紅素與過氧化氫的結(jié)合與反應(yīng),因此氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)以過氧化氫為底物時的Km值較大,過氧化氫與氯化血紅素的結(jié)合力較弱。而以最大反應(yīng)速率作為比較來看,氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)以酸性橙作為底物時的最大反應(yīng)速率稍大于氯化血紅素的最大反應(yīng)速率,而以過氧化氫為底物時的最大反應(yīng)速率就遠(yuǎn)大于氯化血紅素的最大反應(yīng)速率。綜上所述,氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)跟底物有較好的結(jié)合力,并且催化效率高。

3 結(jié) 論

(1)在表面活性劑DDM存在的條件下,DDM所形成的兩性膠束能夠很好地包裹住氯化血紅素,使氯化血紅素與DDM膠束能夠形成氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán),進(jìn)而對氯化血紅素起到很好的分散性和溶解性的效果,氯化血紅素顆粒分散比較好,單體存在比較均勻分散,能更好更穩(wěn)定的儲存。

(2)氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)與氯化血紅素純?nèi)芤合啾鹊膬?yōu)勢在于氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)更加穩(wěn)定,氯化血紅素處于膠束的疏水腔中不易形成二聚體,更易于儲存。

(3)氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)在對溫度和濃度的敏感性較大,對pH值的敏感性較小,這有利于氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)在各種環(huán)境中發(fā)揮催化氧化反應(yīng)。

(4)氯化血紅素-DDM復(fù)合膠團(tuán)跟底物有很好的結(jié)合力,并且催化效率高。

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