石 峻周冰之宋 珈王 俊

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科 杭州 310005 2浙江中醫(yī)藥大學(xué)

燈盞花素對糖基化終產(chǎn)物條件下縫隙連接蛋白的影響及相關(guān)機(jī)制研究

石 峻1周冰之1宋 珈1王 俊2

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科 杭州 310005 2浙江中醫(yī)藥大學(xué)

目的 觀察燈盞花素對糖基化終產(chǎn)物（AGEs）條件下心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白Cx43（Cx43）的影響及相關(guān)機(jī)制。方法 取出生3天SD乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，用AGEs處理心肌細(xì)胞，相同條件下牛血清白蛋白（BSA）處理為對照，Western blot檢測不同條件下Cx43表達(dá)量、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（p-ERK）蛋白表達(dá)。結(jié)果 AGEs處理心肌細(xì)胞后，Cx43表達(dá)量下降（P＜0.05），絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路ERK磷酸化水平升高（P＜0.05），燈盞花素能夠抑制AGEs誘導(dǎo)的Cx43表達(dá)量下降（P＜0.05），同時(shí)能夠抑制ERK磷酸化水平。結(jié)論 燈盞花素對AGEs誘導(dǎo)縫隙連接蛋白43表達(dá)下調(diào)有干預(yù)作用，這可能與燈盞花素抑制ERK信號通路激活相關(guān)。

大鼠；燈盞花素；糖基化終產(chǎn)物；縫隙連接蛋白43；心肌細(xì)胞

心肌細(xì)胞之間電信號有序傳導(dǎo)依賴于細(xì)胞之間的縫隙連接（gap junction，GJ），而縫隙連接主要由縫隙連接蛋白（connexin，Cx）構(gòu)成。迄今在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)的有20種，其中Cx43是心肌細(xì)胞中最主要的縫隙連接蛋白[1]。糖尿病環(huán)境下Cx43表達(dá)異常會導(dǎo)致心肌細(xì)胞之間電偶聯(lián)的紊亂及心律失常。糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）在糖尿病心血管并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用。AGEs能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)量下降，這可能與糖尿病患者心律失常發(fā)病率相關(guān)[2]。燈盞花素是從中藥燈盞細(xì)辛中提取出的活性成分[3]，具有擴(kuò)血管、抗血栓及缺血再灌注損傷作用[4]，但其對AGEs誘導(dǎo)心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)量下降有無保護(hù)作用，目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究觀察燈盞花素對糖基化終產(chǎn)物（AGEs）條件下心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白43的影響及相關(guān)機(jī)制，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動 物 清潔級健康3天齡Sprague-Dawley大鼠25只，隨機(jī)分為5組，各5只，體質(zhì)量（270±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供。動物合格證號：00594110。

1.2 藥物及試劑 低糖DMEM培養(yǎng)基購自杭州吉諾生物有限公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；燈盞花素購自上海融禾生物工程有限公司，ERK，p-ERK多克隆抗體購自Cell Signaling公司；Cx43，cardiac aactin單克隆抗體，小牛血清白蛋白（BSA），MAPK激酶MEK1和MEK2的高效選擇性抑制劑（PD98059），5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu），D-葡萄糖均購于Sigma公司，II型膠原酶購自美國Gibco公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 選取3天齡SD大鼠，每只大鼠分別取出心臟，取心尖前1/3部分，剪成1mm3左右細(xì)小顆粒，用0.05%mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）反復(fù)清洗；用含0.125%胰酶和0.1%II型膠原酶混合消化酶反復(fù)消化，每次5min，吸取上清液后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中和，直到心肌組織消化完全；離心后加入紅細(xì)胞裂解液，再次離心后接種于培養(yǎng)皿中，置于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h，通過差速貼壁將心肌細(xì)胞懸液接種于新的培養(yǎng)皿中，以移除成纖維細(xì)胞。24h后加入0.01mmol/L 5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu），抑制成纖維細(xì)胞生長，48h后換液備用。光鏡下可見成片搏動心肌細(xì)胞。

2.2 AGEs制備 參照文獻(xiàn)[5]方法，0.5g BSA，3.0g D-葡萄糖，溶于10mL 0.5mol/L PBS（pH7.4）中，通過0.22μm濾膜過濾除菌，37℃恒溫培養(yǎng)箱避光孵育16周。相同條件下不含D-葡萄糖的PBS孵化BSA作為對照，測定內(nèi)毒素含量并確保＜2.5U/mL。

2.3 標(biāo)本分組 用制備好的濃度為 100μg/mL AGEs處理上述5組心肌細(xì)胞懸液，觀察1h內(nèi)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)心肌細(xì)胞MAPK信號通路中ERK磷酸化水平變化。其中1組加入40mg/L燈盞花素液作為觀察組，其余4組（各5份）心肌細(xì)胞懸液分別為空白對照組、BSA組、AGEs（48h）組及AGEs（72h）組。

2.4 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 收集心肌細(xì)胞后，用含磷酸酶抑制劑，混合蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解30min，13 000g，4℃離心10min，吸取上清，BCA法蛋白定量。每組取30～60μg蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉TBS-T封閉1h，加入相應(yīng)一抗（Cx43，ERK，p-ERK）4℃孵化過夜。TBS-T洗10min×3次，加入含辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，洗膜，ECL法顯色，采用LAS-4000-mini化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描和灰度分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 AGEs對心肌細(xì)胞MAPK信號通路ERK磷酸化水平的影響 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)72h，予100μg/mL AGEs處理，在不同時(shí)間點(diǎn)（0，15，30，60min）收取細(xì)胞，Western blot檢測ERK磷酸化水平。結(jié)果顯示，AGEs能夠誘導(dǎo)ERK磷酸化水平升高，在15～30min達(dá)峰（n=3，P＜0.05，vs對照組），然后下降。見圖1。

圖1 AGEs對心肌細(xì)胞MAPK信號通路ERK磷酸化水平的影響注：與對照組比較，*P＜0.05

3.2 AGEs誘導(dǎo)下各組Cx43及GAPDH表達(dá) 用100μg/mL AGEs處理心肌細(xì)胞，與空白對照組及BSA組（100μg/mL）比較，AGEs組Cx43表達(dá)受到明顯抑制，并有一定的時(shí)間依賴性（P＜0.05）。但AGEs+燈盞花素組（在AGEs孵育時(shí)加入40mg/L燈盞花素）與AGEs（72h）組比較，AGEs+燈盞花素組Cx43表達(dá)量有所恢復(fù)（P＜0.05），這表明燈盞花素能顯著抑制AGEs誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)量下降。見圖2。

4 討論

圖2 各組對AGEs誘導(dǎo)Cx43（KD）及GAPDH（KD）表達(dá)的影響注：與對照組、BSA組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與AGEs（72h）組比較，#P＜0.05

縫隙連接是普遍存在的一種細(xì)胞連接方式，主要通過縫隙連接蛋白介導(dǎo)。人縫隙連接蛋白基因家族有21個成員，其中，心肌細(xì)胞中表達(dá)最高的為Cx43。研究[6]表明，糖尿病尤其糖尿病心肌病易導(dǎo)致量下降，但與燈盞花素共孵育能夠?qū)勾俗饔?，同時(shí)燈盞花素能夠抑制AGEs誘導(dǎo)的ERK信號通路激活。因此，我們認(rèn)為燈盞花素可能通過抑制ERK磷酸化從而抑制AGEs誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)量下降，但對心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白Cx43分布有無影響尚需進(jìn)一步研究，該研究結(jié)果還需動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。心律失常，持續(xù)性室顫發(fā)病率偏高，心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)減少，細(xì)胞間電信號傳導(dǎo)偶聯(lián)紊亂，且易出現(xiàn)低血鉀，從而導(dǎo)致室顫發(fā)生率升高。通過對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，造模3周后，糖尿病大鼠1～2周后Cx43表達(dá)無變化[7]，3周后Cx43表達(dá)下降，而12周后表達(dá)增加[8]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不統(tǒng)一表明糖尿病是一個復(fù)雜的病理生理過程，在疾病的不同階段有多種病理因素參與其中，且STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型為1型糖尿病模型，并非臨床常見的2型糖尿病模型。

糖基化終產(chǎn)物（AGEs）是糖尿病狀態(tài)下多種蛋白質(zhì)等大分子通過非酶糖基化反應(yīng)所形成的終產(chǎn)物。AGEs能夠與其受體RAGE結(jié)合或通過非受體途徑介導(dǎo)一系列糖尿病心血管并發(fā)癥。研究[9]發(fā)現(xiàn)，AGEs能夠誘導(dǎo)肝癌SKHeP 1細(xì)胞縫隙連接蛋白Cx32、Cx43表達(dá)量下降，這可能是通過MAPK信號通路中的ERK和JNK信號通路完成。但AGEs對心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白相關(guān)研究偏少。本研究發(fā)現(xiàn)，AGEs能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)量下降，同時(shí)AGEs能夠誘導(dǎo)ERK信號通路激活，而使用ERK信號通路能夠抑制AGEs誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)量下降。這說明AGEs可能通過ERK信號通路抑制心肌細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)。

燈盞花素廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的輔助治療。本研究發(fā)現(xiàn)，AGEs能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)

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Effect of Breviscapine on Reduced Connexin 43 Expression by Advanced Glycation End Products in Ratsand the Related Mechanism

SHI Jun1,ZHOU Bingzhi1,SONG Jia1,WANG Jun2. 1.Department of Emergency, the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2.Zhejiang Chinese Medical University.

Objective To investigate the effect of breviscapine on connexin 43（Cx43）expression reduced by advanced glycation end products（AGEs）in rat cardiomyocytes.Methods Cardiomyocytes were obtained from 3-day-old Sprague-Dawley rats and cultured.The cultured cardiomyocytes were treated with AGEs or BSA as controls.The expression of Cx43,extracellular signal regulated kinase（ERK）,and phosphorylated-ERK（p-ERK）was measured by western blot.Results After cardiomyocytes treated with AGEs,the level of protein Cx43 was downregulated（P＜0.05）,but the expression of ERK and p-ERK was increased（P＜0.05）.The expression of Cx43 was increased when cardiomyocytes were co-incubated with breviscapine in AGEs-treated group.Pretreatment with breviscapine suppressed AGE-induced ERK phosphorylation.Conclusion Breviscapine can inhibit AGEs-induced low expression of Cx43 in rat cardiomyocytes,which may relate to the breviscapine-suppressed AGE-induced ERK phosphorylation.

rats；breviscapine；advanced glycation end products；connexin 43；cardiomyocytes

2014-04-25

修回日期：2014-09-03

周冰之，Tel：13575737751；E-mail：zhoubz@163.com