劉莉，邵宇權(quán)，張寶榮，蔣萍萍，都愛(ài)蓮,4，管敏鑫

1. 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)研究所，杭州 310058；

2. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，杭州 310016；

3. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，杭州 310009；

4. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200336

6個(gè)線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征(MELAS)家系先證者線粒體基因全序列比較分析

劉莉1，邵宇權(quán)2，張寶榮3，蔣萍萍1，都愛(ài)蓮3,4，管敏鑫1

1. 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)研究所，杭州 310058；

2. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，杭州 310016；

3. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，杭州 310009；

4. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200336

線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征(Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes, MELAS)是一種異質(zhì)性很強(qiáng)的遺傳代謝性疾病，而位于tRNALeu(UUR)基因的A3243G突變是該疾病最常見(jiàn)的致病位點(diǎn)。文章對(duì)6個(gè)漢族MELAS家系的先證者進(jìn)行了臨床病理、分子遺傳學(xué)特征分析，探討了線粒體基因多態(tài)性對(duì)MELAS病人表型可能產(chǎn)生的影響。線粒體基因檢測(cè)結(jié)果顯示，4例先證者為A3243G陽(yáng)性，其異質(zhì)性比例介于29%～59%之間，臨床癥狀的嚴(yán)重性和異質(zhì)性程度大致呈正相關(guān)；2例MELAS/Leigh疊加綜合征先證者為A3243G陰性，復(fù)發(fā)次數(shù)和嚴(yán)重程度重于其他4例先證者，其中1例先證者的血液和肌肉組織中發(fā)現(xiàn)ND5基因T13094C突變，該位點(diǎn)已報(bào)道與MELAS/Leigh疊加綜合征、小腦共濟(jì)失調(diào)相關(guān)。另外，線粒體基因全序列測(cè)序結(jié)果顯示：除主要致病突變外，還存在多個(gè)與耳聾、癲癇、糖尿病、心肌病、Leigh綜合征相關(guān)的線粒體基因多態(tài)位點(diǎn)，臨床癥狀嚴(yán)重的患者其多態(tài)位點(diǎn)也更多。這表明MELAS綜合征的復(fù)雜表型不僅受致病突變位點(diǎn)的直接影響，也可能受到其他與疾病相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)的修飾作用。

線粒體基因；線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征；多態(tài)性；表型

線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征(Mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-1ike episodes, MELAS, OMIM:540000)是一種臨床和基因型高度異質(zhì)性的線粒體病，常累及多個(gè)器官，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌和心肌等高需能部位最為常見(jiàn)[1]。迄今為止，已報(bào)道與MELAS相關(guān)的突變位點(diǎn)多達(dá)40個(gè)以上(http://www.mitomap. org )，其中位于tRNALeu(UUR)基因的A3243G位點(diǎn)約占 80%[2]。然而 A3243G突變存在很大的臨床異質(zhì)性，使得攜帶同一個(gè)突變的個(gè)體呈現(xiàn)不同類型、不同程度的臨床表型，有些甚至終身不發(fā)病。導(dǎo)致這種臨床異質(zhì)性的原因除了突變比例和組織分布的不同外，目前已報(bào)道有40余個(gè)mtDNA多態(tài)性位點(diǎn)也與MELAS表型有關(guān)[3]，并且也有MELAS患者未攜帶A3243G的報(bào)道[4]。本文對(duì)6個(gè)MELAS家系的先證者進(jìn)行了臨床病理分析，并進(jìn)行mtDNA全序列分析，探討基因突變異質(zhì)性及mtDNA多態(tài)性對(duì)患者表型的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

6例臨床診斷為MELAS的先證者(所屬家系分別為HM1、HM2、HM3、HM4、HM5和HM6)和12例先證者家系母系成員(圖 1)皆來(lái)自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，研究?jī)?nèi)容和方法經(jīng)浙江大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署了知情同意書。所有先證者均進(jìn)行血乳酸、神經(jīng)電生理、頭顱MRI和肌肉活檢病理等檢測(cè)。對(duì)家系成員的個(gè)人資料、親屬關(guān)系、家族史進(jìn)行了詳細(xì)的調(diào)查，并進(jìn)行體格檢查，以確定是否具有相關(guān)的臨床表現(xiàn)。

1.2 方法

1.2.1 腦部影像學(xué)檢查及肌肉病理學(xué)檢測(cè)

對(duì)6例先證者在發(fā)病的急性期進(jìn)行頭顱MRI檢查，包括T1加權(quán)、T2加權(quán)、擴(kuò)散加權(quán)成像(DWI)，其中 3例做了磁共振波譜分析(MRS)。肌肉病理：肌肉活檢標(biāo)本冰凍切片常規(guī)進(jìn)行蘇木精-伊紅、改良Gomori三色、琥珀酸脫氫酶(SDH)及細(xì)胞色素c氧化酶(COX)染色等系列酶組織化學(xué)染色和透射電鏡檢測(cè)。

1.2.2 mtDNA基因檢測(cè)與分析

抽取家系每個(gè)成員的外周血3 mL，苯酚-氯仿抽提法分離外周血全基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆茫x取正常人DNA作為對(duì)照組。PCR擴(kuò)增先證者家系若干母系成員及對(duì)照組的線粒體tRNALeu(UUR)基因，正向引物5′-TCAACAATAGGGTTTACGAC-3′ (mtDNA-2966-2985)，反向引物5′-AGGAATGCCATTGCGATTAG-3′(mtDNA3346-3365)，擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶ApaⅠ消化，3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。野生型為 400 bp單一條帶，突變型的 400 bp將被切成281 bp和119 bp兩個(gè)片段。為進(jìn)一步驗(yàn)證A3243G異質(zhì)性程度與 MELAS臨床表型及嚴(yán)重程度的相關(guān)性，采用焦磷酸測(cè)序法(BGI華大基因)精確測(cè)定A/G的突變比例。

圖1 6例MELAS先證者家系圖A：HM1家系圖；B：HM2家系圖；C：HM3家系圖；D：HM4家系圖；E：HM5家系圖；F：HM6家系圖。表示耳聾患者；表示糖尿病患者；表示MELAS患者；表示正常人群，箭頭表示先證者；表示流產(chǎn)。

線粒體基因全序列測(cè)定：使用24對(duì)具有部分片段重疊的引物[5]，對(duì)先證者線粒體基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序，應(yīng)用 SeqManII序列比對(duì)軟件與修正后的人類線粒體標(biāo)準(zhǔn)序列[6]進(jìn)行比對(duì)拼接，峰圖查看分析軟件為Chromas軟件。為比較rRNA和編碼區(qū)位點(diǎn)在進(jìn)化上的保守性，查找人(NC_011137)、牛(HM045018.1)、鼠(NC_006914.1)、爪蟾(NC_ 001573.1)等 4個(gè)物種的 DNA及蛋白序列，采用BioEdit軟件進(jìn)行保守性分析。為探究多態(tài)性位點(diǎn)相關(guān)表型對(duì) MELAS癥狀的修飾作用，根據(jù)線粒體全基因組測(cè)序情況采用Mitotool軟件測(cè)定6例先證者的單倍型，并收集已報(bào)道的與線粒體病表型相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)，比較 6例先證者多態(tài)性位點(diǎn)與表型的相關(guān)性。

對(duì)于血液中突變檢測(cè)為陰性的患者，提取其肌肉組織DNA進(jìn)行Sanger測(cè)序，以確認(rèn)A3243G位點(diǎn)或其他可疑位點(diǎn)的致病性突變。

1.2.3 核基因POLG1和SURF1突變檢測(cè)

POLG1和SURF1基因是與MELAS和Leigh綜合征相關(guān)的常見(jiàn)核基因[7,8]。本研究擴(kuò)增了兩例A3243G為陰性的 MELAS/Leigh疊加綜合征患者POLG1基因位于exon2的CAG重復(fù)序列，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行直接測(cè)序；并對(duì)exon7、exon13、exon16、exon21區(qū)域進(jìn)行了點(diǎn)突變檢測(cè)。對(duì)SURF1基因進(jìn)行了全基因測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 MELAS家系臨床資料評(píng)析

6例MELAS家系先證者臨床資料顯示(表1)，先證者始發(fā)病年齡從13歲～36歲不等，臨床表現(xiàn)均有反復(fù)的抽搐、腦卒中樣發(fā)作和高乳酸血癥等MELAS綜合征典型癥狀；身材矮小、耳聾、認(rèn)知退行、運(yùn)動(dòng)不耐受等常見(jiàn)伴發(fā)癥狀；本研究提示呼吸衰竭、消化道功能障礙、皮膚黑等癥狀也應(yīng)值得關(guān)注。6例先證者影像學(xué)(圖2A)均有典型的顳/頂枕大片異常信號(hào)，符合MELAS表現(xiàn)，3例先證者M(jìn)RS有典型的乳酸波。2例(HM3和HM5)同時(shí)有中腦小腦異常信號(hào)，符合MELAS/Leigh重疊綜合征表現(xiàn)，這2例先證者的復(fù)發(fā)次數(shù)明顯多于其他4位先證者，其中HM3于發(fā)病后20個(gè)月死亡。肌肉活檢(圖2B)結(jié)果顯示除HM5外，其他5例先證者肌肉中均見(jiàn)到破碎紅纖維(Ragged red fibers, RRF)、線粒體數(shù)目和形態(tài)異常。血液乳酸含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，6例先證者中HM3的LAC含量最高(18 mmol/L)，HM6的LAC含量最低(3.1 mmol/L)，均高于正常人群(正常人＜2 mmol/L)。

表1 6例MELAS家系先證者臨床資料

圖2 先證者的頭顱MRI和肌肉病理結(jié)果(以HM5-Ⅱ-2和HM6-Ⅱ-1為例)A：先證者HM5-Ⅱ-2的頭顱MRI圖像(a：T2相右側(cè)顳枕葉大片狀異常信號(hào)；b：DWI示右側(cè)顳枕葉大片狀異常信號(hào)彌散障礙；c：雙側(cè)中腦異常信號(hào)；d：MRS見(jiàn)1.33 ppm處巨大的乳酸波)；B：先證者HM6-Ⅱ-1肌肉病理結(jié)果(a：HE染色示肌纖維大小不等，核內(nèi)移；b：Gomori染色見(jiàn)破碎紅纖維；c：SDH染色見(jiàn)周邊強(qiáng)陽(yáng)性纖維；d：電鏡下見(jiàn)結(jié)晶樣包涵體)。

結(jié)合6例先證者的家系圖(圖1)，家族史中耳聾、糖尿病、流產(chǎn)史為常見(jiàn)的異常，其中HM1的母親有偏頭痛、糖尿病、流產(chǎn)史和卒中樣發(fā)作 1次，為臨床發(fā)病者；胞弟有生長(zhǎng)發(fā)育遲滯，父親有糖尿病，為高度異常家族史。HM2母親、姨媽和其3個(gè)子女患有糖尿病。HM3無(wú)異常家族史，HM4母親有流產(chǎn)史，HM5和HM6母親均有耳聾表現(xiàn)。

2.2 線粒體基因組突變分析

2.2.1 A3243G突變位點(diǎn)檢測(cè)及異質(zhì)性分析

圖3 A3243G突變檢測(cè)和異質(zhì)性分析A：A3243G位點(diǎn)Sanger測(cè)序結(jié)果；B：ApaⅠ酶切6例MELAS先證者A3243G電泳檢測(cè)結(jié)果；C：4例A3243G陽(yáng)性先證者焦磷酸測(cè)序異質(zhì)性檢測(cè)結(jié)果。

對(duì)6例先證者的tRNALeu(UUR)基因進(jìn)行了Sanger測(cè)序。結(jié)果顯示，4例先證者存在A3243G異質(zhì)性突變且雜合峰高不同(圖3A)。進(jìn)一步對(duì)A3243G陽(yáng)性先證者12位母系成員的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用ApaⅠ酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)只有HM1的母親(HM1-Ⅱ-4)和胞弟(HM1-Ⅲ-1)以及HM6的母親(HM6-Ⅰ-1)存在A3243G異質(zhì)性突變(圖3B)，而HM2家系的母系成員Ⅱ-5、Ⅲ-10、Ⅲ-12、Ⅳ-2和HM4家系的母系成員Ⅰ-2、Ⅱ-3、Ⅲ-4 中未檢測(cè)到A3243G突變(數(shù)據(jù)未顯示)。酶切結(jié)果顯示(圖3B)：HM1和HM6先證者281 bp突變條帶亮度明顯高于HM2和HM4先證者。HM1和HM6先證者281 bp 條帶亮度也高于其家系成員HM1-Ⅱ-4、HM1-Ⅲ-1和HM6-Ⅰ-1。為驗(yàn)證異質(zhì)性存在的差異，對(duì) A3243G陽(yáng)性突變的先證者進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，結(jié)果顯示異質(zhì)性程度與酶切結(jié)果一致(圖3C)：HM1和HM6的異質(zhì)性比例較高(圖3C)，達(dá)到53%和59%；而HM2和HM4的異質(zhì)性分別為29%和30%。

2.2.2 A3243G陰性患者的突變位點(diǎn)分析

先證者HM3和HM5未檢測(cè)到A3243G位點(diǎn)突變，也未發(fā)現(xiàn)與 MELAS相關(guān)的 C3256T、T3271C和T3291C等典型位點(diǎn)突變。但在HM3-Ⅱ-1血液中發(fā)現(xiàn)了T13094C突變，進(jìn)一步檢測(cè)其肌肉發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變?cè)诩∪庵械谋壤咏?00%(圖4)。對(duì)HM3的2位母系成員(Ⅰ-1、Ⅱ-3)的檢測(cè)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)T13094C突變。已有報(bào)道T13094C突變可以導(dǎo)致MELAS/Leigh疊加綜合征[9,10]。在 HM5患者中檢測(cè)到 ND4基因A11084G同質(zhì)性突變，該突變同時(shí)又是線粒體單體型A15a的多態(tài)位點(diǎn)，尚未見(jiàn)單獨(dú)致病的報(bào)道。同時(shí)，本研究分析了HM3和HM5患者mtDNA中多態(tài)性位點(diǎn)。如表2所示，HM3和HM5中共有24個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與線粒體疾病相關(guān)，其中HM3患者中有16個(gè)位點(diǎn)與MELAS相關(guān)，HM5中有10個(gè)位點(diǎn)與MELAS相關(guān)，同時(shí)與MELAS和Leigh綜合征相關(guān)的位點(diǎn)有9個(gè)：D-Loop區(qū)A73G和A263G；12S rRNA A750G；16S rRNA A2706G；ATP6 A8701G；ND4 G11719A；ND5 C12705T和T13094C；Cytb A15326G。

圖4 HM3肌肉組織T13094C突變位點(diǎn)檢測(cè)

2.2.3 mtDNA多態(tài)位點(diǎn)與臨床癥狀比較分析

6例先證者共檢測(cè)到已報(bào)道的多態(tài)性位點(diǎn)如下：D-loop區(qū)有13個(gè)；12S rRNA有6個(gè)；16S rRNA有3個(gè)；tRNALeu(UUR)基因有1個(gè)；在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域存在10個(gè)已知的同義突變和22個(gè)已知的錯(cuò)義突變。這些錯(cuò)義突變包括：位于ND1的C3497T(A64V)、C3571T(L89F)、G4048A(D248N)、ND2 A4824G (T119A)、C5178A(L237M)；CO2的A8108G(I175V)；ATP8的C8414T(L17F)、A8459G(N32D)； ATP6的G8584A(A20T)、T8618C(I31T)、A8701G(T59A)、C8794T(H90Y)、A8860G(T112A)；ND3的A10398G (T114A)；ND4的A11084G(T109A)、G11969A(A404T)；ND5的T13094C(V253A)；ND6的T14318C(N119S)、C14340T(V112M)；Cyt b的C14766T(T7I)、T14979C (I78T)和A15326G(T194A)。這些突變的意義有待進(jìn)一步研究。根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)的單倍體型分析，6例先證者的線粒體單倍體分別是：C5a1(HM1)、D4a (HM2和HM6)、M11(HM3)、B4c1(HM4)和A15a(HM5)。

MELAS患者往往是多器官受累，本研究對(duì)先證者線粒體基因組全序分析顯示：無(wú)論是3243A＞G突變陽(yáng)性還是陰性患者，均存在多個(gè)與表型相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)。這些突變位點(diǎn)大多與 MELAS、LHON、糖尿病、耳聾、偏頭痛、心臟病、癲癇等癥狀相關(guān)。如D-Loop區(qū)域中，T146C與耳聾、LHON、線粒體肌病相關(guān)[12]，C16278T與LHON、耳聾、代謝綜合征、線粒體腦肌病相關(guān)[12]；位于16S rRNA的G3010A和D-Loop的T16519C可促進(jìn)伴隨偏頭痛的周期性嘔吐綜合征的發(fā)生；位于ND1區(qū)域的C3497T和位于ND4區(qū)域G11914A均與LHON表型相關(guān)。多態(tài)性位點(diǎn)T1095C、A8108G、T9950C、C14340T不僅與HM3先證者單倍體型位點(diǎn)組成相關(guān)，也與耳聾、LHON表型相關(guān)；同義突變位點(diǎn) A750G、A1438G和A4769G與癲癇相關(guān)；同義突變位點(diǎn)G11719A和C12705T還與呼吸功能衰竭相關(guān)[3]。

表2 2例A3243G突變陰性患者中與疾病相關(guān)的線粒體基因多態(tài)性位點(diǎn)

2.3 核基因POLG1和SURF1突變檢測(cè)結(jié)果

對(duì)HM3-Ⅱ-1和HM5-Ⅱ-3患者的POLG1基因進(jìn)行外顯子2、7、13、16和21的PCR擴(kuò)增，未找到與MELAS相關(guān)的典型突變位點(diǎn)，對(duì)SURF1基因測(cè)序分析比對(duì)也未發(fā)現(xiàn)致病性突變位點(diǎn)(exon1和2)。

3 討 論

線粒體疾病是由于基因突變引起的、線粒體氧化磷酸化功能異常為特征的、多系統(tǒng)受累的疾病，無(wú)論是基因型還是臨床表型均具有高度異質(zhì)性。本研究探討了6個(gè)MELAS家系先證者的臨床表現(xiàn)和分子遺傳學(xué)特征。家系中的先證者均表現(xiàn)出典型的MELAS臨床癥狀，如頭暈嘔吐、精神異常、癲癇發(fā)作、認(rèn)知退化、消瘦、身材矮小等；除 HM3和HM4家系成員無(wú)臨床表現(xiàn)外，其他家系中的母系成員表現(xiàn)出了糖尿病、耳聾等癥狀，其中HM1先證者的母親現(xiàn)在也是 MELAS患者。對(duì)先證者母系成員進(jìn)行A3243G突變檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HM1家系的Ⅱ-4、Ⅲ-1和HM6家系中的Ⅰ-1攜帶該突變，而HM2家系母系成員Ⅱ-5、Ⅲ-10、Ⅲ-12、Ⅳ-2和HM4家系的母系成員(Ⅰ-2、Ⅱ-3、Ⅲ-4) 中未檢測(cè)到A3243G突變，這與國(guó)外報(bào)道的母系遺傳方式[13]不相符。這一方面與突變比例低、檢測(cè)靈敏度的限制有關(guān)，另一方面提示 A3243G也存在新生突變，即在卵細(xì)胞生成或者受精時(shí)期的自發(fā)突變[14]。

tRNALeu(UUR)A3243G 突變的雜合度往往與表型相關(guān)，但也有研究報(bào)道血液中雜合度與疾病嚴(yán)重程度并無(wú)明確的相關(guān)性[15]。A3243G突變與tRNALeu(UUR)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、氨?；揎?、密碼子的識(shí)別等有關(guān)[11]。該突變影響tRNA的合成并導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄剪切的終止，進(jìn)一步使復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ功能缺陷，從而導(dǎo)致ATP合成受阻，器官供能不足，導(dǎo)致臨床癥狀的產(chǎn)生[16]。Lu等[17]研究提示當(dāng)細(xì)胞中A3243G的雜合度超過(guò)70%不會(huì)引起糖尿病，而會(huì)出現(xiàn)更嚴(yán)重的癥狀，如身材矮小、原發(fā)性心肌病等；而當(dāng)血液中雜合度在10%～30%時(shí)可能只引起糖尿病、耳聾等癥狀。本研究結(jié)果顯示(圖2A)，陽(yáng)性個(gè)體中HM1和HM6的雜合比例較高，HM2和HM4的雜合比例較低，除了HM4沒(méi)有糖尿病或耳聾，HM1和HM2均有糖尿病，HM6有耳聾癥狀。Qi等[18]在57例A3243G突變的中國(guó)線粒體腦肌病患者中發(fā)現(xiàn) A3243G異質(zhì)性與表型的嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)，但與發(fā)病年齡相關(guān)。Vivero等[19]則認(rèn)為 A3243G異質(zhì)性程度越高，耳聾表型就越嚴(yán)重，同時(shí)Ma等[20]在47例中國(guó)患者中探究到該異質(zhì)性突變與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究中HM1和HM6兩者異質(zhì)性程度最高，典型的MELAS臨床表現(xiàn)也較為嚴(yán)重，HM1的突變異質(zhì)性高于其母親Ⅱ-4，發(fā)病年齡也早于其母親；HM6的母親攜帶突變比例較低未發(fā)病，故本研究中的 4例 A3243G陽(yáng)性患者表型嚴(yán)重程度與該位點(diǎn)異質(zhì)性程度大致呈正相關(guān)。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)突變的異質(zhì)性程度越高，陽(yáng)性家族史越突出，如 HM1家族中檢出 2例A3243G突變者，其母親又是臨床發(fā)病者。

HM3和HM5雖然未檢測(cè)到A3243G突變，但都具有典型的反復(fù)中風(fēng)樣發(fā)作、高乳酸血癥、乳酸波等特征，MRI病變同時(shí)累及腦干和小腦符合MELAS/Leigh重疊綜合征的影像學(xué)表現(xiàn)。本研究在HM3患者血液中檢測(cè)到低比例的T13094C異質(zhì)性突變，但肌肉組織中突變比率接近100%，已有研究報(bào)道該突變可以導(dǎo)致MELAS/Leigh疊加綜合征、小腦性共濟(jì)失調(diào)等表型[9,10]，如此高的突變比例可以部分解釋HM3患者頻繁發(fā)作的代謝危象、日益惡化的腦功能乃至20個(gè)月內(nèi)死亡的病程。線粒體多態(tài)位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)該患者攜帶的多態(tài)性位點(diǎn)也最多，同時(shí)存在與耳聾、LHON、線粒體肌病、心肌病、頭痛嘔吐、呼吸衰竭和癲癇發(fā)作等臨床表現(xiàn)相關(guān)的多個(gè)突變位點(diǎn)，其中2個(gè)位點(diǎn)(A10398G和G11719A)曾報(bào)道與乳酸中毒相關(guān)[3]。6例先證者皆有癲癇發(fā)作，除主要突變外，本研究在 6例患者中同時(shí)檢測(cè)到了數(shù)個(gè)與癲癇相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)，如 A750G、A1438G和A4769G[3]。由此我們推測(cè)在MELAS綜合征中，臨床表型的異質(zhì)性不僅受致病突變位點(diǎn)的影響，也存在多態(tài)性位點(diǎn)的協(xié)同作用，從而使臨床癥狀更復(fù)雜。這些多態(tài)性位點(diǎn)的協(xié)同作用使特定患者成為MELAS以及其他表型的易感人群，同時(shí)單倍型的不同可能從一定程度上解釋不同家系之間表現(xiàn)出不同臨床表型這一現(xiàn)象。

除線粒體基因外，有1500個(gè)核基因參與維持線粒體的正常生理功能[21]。SURF1基因突變是導(dǎo)致Leigh綜合征的最常見(jiàn)基因，Cheldi等[7]認(rèn)為在未找到mtDNA突變的不典型的MELAS患者，POLG1基因可以作為新的篩查指標(biāo)，因此本研究對(duì) 2例MELAS/Leigh疊加綜合征患者進(jìn)行了 SURF1和POLG1基因檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)致病突變，但仍不能排除其他核基因參與致病的可能。值得一提的是：4例A3243G突變的患者經(jīng)輔酶Q10、維生素B2、左卡尼汀治療后，長(zhǎng)時(shí)間處于穩(wěn)定狀態(tài)，而 2例A3243G突變陰性的MELAS/Leigh疊加綜合征的患者，在同等藥物干預(yù)下仍不斷復(fù)發(fā)和進(jìn)展，其中HM3于發(fā)病20個(gè)月內(nèi)死亡，為線粒體腦肌病中急進(jìn)類型，其發(fā)病機(jī)制很值得進(jìn)一步探討。

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(責(zé)任編委: 吳志英)

Mitochondrial genome analysis in the probands of six Chinese families with MELAS

Li Liu1, Yuquan Shao2, Baorong Zhang3, Pingping Jiang1, Ailian Du3,4, Minxin Guan1

1. Institute of Genetics, College of Life Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China;
2. Department of Neurology, Sir Run Run Shao Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310016, China;
3. Department of Neurology, The Second Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310009, China;
4. Tongren Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200336, China

Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes (MELAS) is a geneticallyheterogeneous disorder. The most prevalent mitochondrial DNA (mtDNA) mutation associated with MELAS is the m.3243A＞G transition in the mitochondrial tRNALeu(UUR)gene. Here, we report the clinical, genetic and molecular characterization of six probands from Han Chinese families with MELAS. Four of six probands carried the heteroplasmic m.3243A＞G mutation. The levels of mutation load ranged from 29% to 59%, which were correlated with the severity of the clinical phenotypes. Two probands with MELAS/Leigh overlap were 3243 A＞G negative, whose severity and relapse were greater than the other 4 probands. One proband with MELAS/Leigh harbored the known ND5 m.13094T＞C mutation, which is related to MELAS/Leigh overlap and cerebella ataxia. Sequence analysis of entire mtDNA showed the distinct sets of variants including some variants that may be associated with diabetes, hearing loss, seizures, cardiomyopathy, and Leigh syndrome. Our data suggested that the phenotype and severity of MELAS mainly depend on the mutation load, and some variants may partially contribute to the phenotype and diversity. Our finding also highlighted the complexity of the relationship between genotype and phenotype in MELAS.

mitochondrial DNA; MELAS; polymorphism; phenotype

2014-04-04;

2014-06-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81200967)資助

劉莉，碩士研究生，專業(yè)方向：遺傳學(xué)。E-mail: 21207041@zju.edu.cn

都愛(ài)蓮，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：線粒體腦肌病的基礎(chǔ)和臨床研究。E-mail: lotusdu@126.com

10.3724/SP.J.1005.2014.1159

時(shí)間: 2014-9-19 01:37:00 PM

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140919.1337.002.html