肖麗容，陳大年，閆乃紅

四川大學華西醫(yī)院眼科/眼科學研究室，成都 610041

活體電轉(zhuǎn)化技術在新生小鼠視網(wǎng)膜中的應用

肖麗容，陳大年，閆乃紅

四川大學華西醫(yī)院眼科/眼科學研究室，成都 610041

活體電轉(zhuǎn)化技術是在高電壓的脈沖作用下，瞬態(tài)增加細胞膜的滲透性從而將外源基因高效導入細胞的方法。與病毒載體等其他方法相比，活體電轉(zhuǎn)化技術具有安全、高效、快速、穩(wěn)定及應用范圍廣等優(yōu)點，近年來在很多組織和器官中得到廣泛使用，包括在眼科研究領域。文章介紹了活體電轉(zhuǎn)化技術在新生小鼠視網(wǎng)膜中的應用，通過新生小鼠視網(wǎng)膜下注射的方法，經(jīng)幾次高電壓的脈沖，將高濃度的綠色熒光蛋白表達質(zhì)粒導入新生小鼠視網(wǎng)膜細胞內(nèi)。通過冰凍切片觀察綠色熒光蛋白在視網(wǎng)膜中的表達。結果表明綠色熒光蛋白在視網(wǎng)膜外核層高表達，證實了活體電轉(zhuǎn)化技術可以將外源基因高效、快捷的導入視網(wǎng)膜，從而為研究視網(wǎng)膜發(fā)育及功能提供一種有效的手段。

活體電轉(zhuǎn)化；新生小鼠；視網(wǎng)膜；冰凍切片

近年來，隨著基因測序及芯片分析等方法的發(fā)展，大量可能與哺乳動物視網(wǎng)膜發(fā)育及疾病相關的基因被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在比以往更需要一種快速、簡便的方法去分析基因的功能[1～3]。在活體動物中，基因功能的研究主要通過轉(zhuǎn)基因或基因敲除來實現(xiàn)，而轉(zhuǎn)基因和基因敲除是一項費時、費力且花費巨大的工作[4,5]，利用病毒載體來攜帶目的基因?qū)霗C體雖然省時省力，但存在免疫原性低、潛在毒性、靶向特異性差等缺點[6,7]。為了克服這些問題，近年來一種新的導入外源基因的技術——活體電轉(zhuǎn)化技術快速發(fā)展并被廣泛應用?；铙w電轉(zhuǎn)化技術是利用高脈沖瞬時改變細胞膜通透性，在膜上出現(xiàn)有利DNA等物質(zhì)快速進入細胞的孔道，從而實現(xiàn)基因?qū)氲募夹g[8]。目前，活體電轉(zhuǎn)化技術已應用于鼠、雞、牛蛙、豬、狗、羊、兔、恒河猴等動物[9]，成功轉(zhuǎn)染了腫瘤、皮膚、腦、肌肉、睪丸、脊柱、腎、肺、肝及眼等部位[10～19]。

2004年，Matsuda和 Cepko[20]將電轉(zhuǎn)化方法應用于嚙齒動物(Sprague-Dawley大鼠和 Swiss-Webster小鼠)視網(wǎng)膜功能的研究，在體外用高電壓脈沖，將DNA有效地轉(zhuǎn)染入視網(wǎng)膜內(nèi)，發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)可以表達至少50 d。2011年，Melo1和 Blackshaw[21]進一步利用活體電轉(zhuǎn)化技術，在新生小鼠視網(wǎng)膜中進行了嘗試，詳細地描述了新生小鼠視網(wǎng)膜下注射及電轉(zhuǎn)化的步驟。2013年，Venkatesh等[22]針對活體電轉(zhuǎn)化技術在小鼠視網(wǎng)膜中使用的注意事項等進行討論，提出電轉(zhuǎn)化參數(shù)、DNA濃度及視網(wǎng)膜下注射的位置等是影響電轉(zhuǎn)化效率的關鍵，并且電轉(zhuǎn)化小鼠視網(wǎng)膜的理想時間是出生后24 h內(nèi)，而電轉(zhuǎn)化產(chǎn)后3 d基本上不會轉(zhuǎn)染任何細胞。2014年，研究者們利用活體電轉(zhuǎn)化技術將不同的基因?qū)胄∈笠暰W(wǎng)膜，對視網(wǎng)膜不同類型細胞的功能進行研究[23,24]。

綜上所述，活體電轉(zhuǎn)化是研究小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育、疾病及功能的強有力技術，但目前還沒有見到活體電轉(zhuǎn)化技術在新生小鼠視網(wǎng)膜中應用的中文報道。本文利用活體電轉(zhuǎn)化技術成功將GFP表達質(zhì)粒導入新生小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)，并在電轉(zhuǎn)化后3 d和28 d觀察熒光蛋白的表達，為后續(xù)導入目的基因并研究基因的功能提供了可靠的技術支撐。

1 對象和方法

1.1 實驗動物、材料、設備

成年ICR小鼠購自成都達碩生物科技有限公司，交配后繁殖得到新生小鼠(P0，出生后第0 d)。真核表達載體pEZ-M90(帶有GFP綠色熒光報告基因)購于美國Genecopoeia公司；Plasmid Maxi Kit購于美國Qiagen公司；2.5 μL進樣針及32G平末端針頭購于美國Hamilton公司，32G胰島素素注射針頭(#32017714)購自美國BD公司。包埋劑(Opti-mum cutting temperature compound, OCT)及冰凍切片包埋模具購自日本Tissue-Tek公司。電轉(zhuǎn)化儀(型號為 NEPA21，電極型號為CUY650P5)購自日本NEPA GENE公司。冰凍切片機(Leica CM 1850)及熒光顯微鏡(Leica DM3000)購于德國萊卡公司。常規(guī)試劑購于國產(chǎn)公司。

1.2 方法

1.2.1 高濃度質(zhì)粒提取

將真核表達載體pEZ-M90轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，氨芐青霉素培養(yǎng)基中 37℃過夜培養(yǎng)。挑取白色菌落，在5 mL LB/氨芐青霉素培養(yǎng)基中小量活化后，轉(zhuǎn)入50 mL LB/氨芐青霉素培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，6000 g、4℃條件下離心15 min收集菌液，按照Plasmid Maxi Kit操作說明提取質(zhì)粒，最后用無內(nèi)毒素的TE溶解DNA為1 μg/μL。加入1% blue dye到DNA溶液中使其終濃度為0.01%，作為注射時的指示劑。

1.2.2 視網(wǎng)膜下腔注射

新生小鼠(P0)置于冰上數(shù)分鐘使之麻醉，用70%酒精擦拭小鼠眼表，準確定位出兩眼瞼的結合處。用32G的尖銳針頭小心劃開兩眼瞼間的皮膚，暴露眼球(注意劃開面積與深度，避免劃傷周圍組織或內(nèi)部眼球)。用32G的尖銳針頭在角鞏膜緣穿刺并形成一個小口，用32G Hamilton平末端針頭的微量注射器吸取1 μL DNA溶液，將針頭45°角順著小口插入玻璃體腔，并穿透視網(wǎng)膜，直至遇到來自鞏膜的阻力停止(注意避免穿破晶狀體)，此時針頭已插入到視網(wǎng)膜下，緩慢推動注射器活塞將DNA溶液注射到視網(wǎng)膜下腔，可以觀察到藍色染料在視網(wǎng)膜下均勻擴散，表明已成功地將 DNA溶液注射到視網(wǎng)膜下。退出注射器后合眼并用浸潤PBS的棉球擦拭眼表皮膚。

1.2.3 活體電轉(zhuǎn)化

電轉(zhuǎn)化所用電極為10 mm直徑的鑷子狀電極。為提高皮膚與電極間傳導性將電極浸泡在 PBS中，用電極夾住小鼠頭部兩側(cè)，保證兩電極鑷子分別完全覆蓋左右眼睛，注射DNA的眼球用電極正極，另一側(cè)為負極。兩電極形成的電場應完全垂直于視網(wǎng)膜所注射的部位，才能保證有效電轉(zhuǎn)化。如若注射位置恰好在視網(wǎng)膜中央，兩電極與角膜保持水平，則可以得到最高的轉(zhuǎn)化效率。電轉(zhuǎn)化條件：5次脈沖，80 V，50 ms，每兩次脈沖間隔950 ms。電轉(zhuǎn)化后的小鼠在37℃下使其蘇醒，最后放回籠中與其母親共同飼養(yǎng)。

1.2.4 眼球的固定、包埋、切片及熒光觀察

電轉(zhuǎn)化3 d和28 d后處死小鼠，取出眼球，用針尖在角鞏膜緣處戳個小洞，注意不要擠壓眼球，然后用 4%多聚甲醛在 4℃固定過夜，取出眼球用PBS清洗3遍，于30%蔗糖脫水至眼球沉降管底。用OCT包埋眼球，然后用冰凍切片機切片，厚度為6 μm。將切片風干后用PBS洗滌3次，去除OCT，用含DAPI染料的封片劑封片，觀察熒光。

2 結 果

2.1 視網(wǎng)膜下腔注射

新生小鼠視網(wǎng)膜下注射 DNA溶液示意圖見圖1A，要注意注射針的角度和位置，確保將 DNA溶液注射在視網(wǎng)膜下中央位置，然后緩慢推注射針，使DNA溶液沿著視網(wǎng)膜下空隙均勻擴散。注射后小鼠眼球呈現(xiàn)均一的藍色(圖 1B)，說明視網(wǎng)膜下注射成功。成功的操作對眼球損傷很小，也不會影響視網(wǎng)膜的正常發(fā)育。

2.2 新生小鼠眼球活體電轉(zhuǎn)化

視網(wǎng)膜下注射DNA后，將電極夾夾住小鼠雙眼，要注意電極夾的位置和方向(圖2A)，而圖2B和2C不能將 DNA導入視網(wǎng)膜細胞。電流的方向、DNA注射的位置及確保電流穿過DNA注射的位置，是該實驗的關鍵。實驗完畢后，幾乎所有的動物都能健康存活。

圖1 小鼠視網(wǎng)膜下注射DNA溶液A：圖解視網(wǎng)膜下注射的正確操作，其中R代表視網(wǎng)膜，V代表玻璃體，L代表晶狀體。將DNA液體注射到玻璃體腔、眼球外及晶狀體內(nèi)都是錯誤的操作；B：新生小鼠(P0 d)注射DNA溶液后的眼球，可見藍色染料均勻分布在眼球內(nèi)。

圖2 活體電轉(zhuǎn)化電極位置對電轉(zhuǎn)化的影響A：圖解視網(wǎng)膜下注射后電轉(zhuǎn)化的正確操作，DNA分布在視網(wǎng)膜中部，并且電極板的方位貼于雙眼角膜中央；B：視網(wǎng)膜下液體分布在視網(wǎng)膜一邊，電流雖然穿過眼球，但是沒有穿過注射部位，將導致轉(zhuǎn)化失敗；C：視網(wǎng)膜下液體分布在視網(wǎng)膜一邊，電流也沒有穿過注射部位，將導致轉(zhuǎn)化失敗。

2.3 綠色熒光蛋白在視網(wǎng)膜中的表達

本實驗使用真核表達載體pEZ-M90為CMV啟動子，電轉(zhuǎn)化后3 d，可在視網(wǎng)膜中觀測到GFP熒光的表達(圖3A)。出生后3 d的小鼠視網(wǎng)膜沒有發(fā)育完全，視網(wǎng)膜只有2層結構，為成神經(jīng)細胞層(Neuroblastic layer, NBL)和神經(jīng)節(jié)細胞層(Ganglion cell layer, GCL)，GFP主要分布在外成神經(jīng)細胞層。電轉(zhuǎn)化28 d后，GFP仍然表達較強，視網(wǎng)膜已經(jīng)完全分化，GFP主要在視網(wǎng)膜外核層(Outer nuclear layer, ONL)中表達，而內(nèi)核層(Inner nuclear layer, INL)被轉(zhuǎn)化的細胞較少。

圖3 電轉(zhuǎn)化后3 d及28 d視網(wǎng)膜中GFP的表達A：新生小鼠視網(wǎng)膜電轉(zhuǎn)化后3 d的熒光表達圖，GFP綠色熒光主要在視網(wǎng)膜NBL中；B：新生小鼠視網(wǎng)膜電轉(zhuǎn)化后28 d的熒光表達圖，GFP綠色熒光主要在ONL中表達，而INL熒光較少。

3 討 論

本文介紹了一種高效、快速將外源基因?qū)胄律∈笠暰W(wǎng)膜的方法，該活體電轉(zhuǎn)化與其他基因?qū)敕椒ㄏ啾龋哂泻芏酂o法比擬的優(yōu)點[20]。第一，理論上任何組織和器官都可以作為活體電轉(zhuǎn)化的靶器官；第二，電轉(zhuǎn)化技術操作簡單、快速和安全，且DNA制備容易。第三，當DNA注射方式準確時，DNA轉(zhuǎn)導效率非常高；第四，電轉(zhuǎn)化技術對于導入的外源基因片段大小沒有限制，優(yōu)于病毒載體；第五，可以同時導入多個基因表達質(zhì)?；騭hRNA進入視網(wǎng)膜細胞。有研究表明，多個轉(zhuǎn)錄因子的結合，而不是單一的轉(zhuǎn)錄因子導入視網(wǎng)膜，對研究不同類型的視網(wǎng)膜細胞很重要[25,26]。另外，該技術可以用來研究多重復雜基因的相互作用。

由于電轉(zhuǎn)化技術具有上述優(yōu)點，此項技術已廣泛應用于多個物種的不同組織[9,27,28]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，此技術也已成功應用于不同物種包括鳥類和嚙齒動物。早期神經(jīng)發(fā)育的研究對象通常是胚胎，目前研究表明，在出生后或成年動物的大腦仍然有很高效率[12]。由于眼睛處于淺表，易于觀察和定位，是電轉(zhuǎn)化技術最好的靶器官。電轉(zhuǎn)化技術除了在視網(wǎng)膜中廣泛應用之外，還廣泛應用于角膜、玻璃體、晶狀體、睫狀肌等組織中[19,29～31]。Chen等[30]將表達GFP和雞neurofibromatosis 2( cNf2)質(zhì)粒注入雞胚晶狀體，用電轉(zhuǎn)化技術將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入晶狀體上皮細胞，轉(zhuǎn)染4 h后可明顯觀察到GFP表達，表明在活體雞胚中用電轉(zhuǎn)化技術可有效轉(zhuǎn)導目的基因于晶狀體上皮細胞。Bloquel等[31]利用電轉(zhuǎn)化技術將腫瘤壞死因子受體基因(Tumor necrosis factor receptor, TNFR)導入大鼠睫狀肌，有助房水高蛋白質(zhì)分泌，明顯抑制葡萄膜炎。

通過活體電轉(zhuǎn)化技術將質(zhì)粒導入新生小鼠視網(wǎng)膜下，并獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，要注意以下幾個方面。第一，所需質(zhì)粒需要去除內(nèi)毒素，最好利用高濃度、高純度的質(zhì)粒，為成功轉(zhuǎn)化提供前提條件。第二，需要操作者掌握熟練的技巧，準確將DNA溶液注射入視網(wǎng)膜下腔。第三，劃開眼瞼暴露眼球時，操作者應注意控制劃開力度和面積，以免劃傷眼球和周圍血管，將Hamilton平末端針頭插進眼球時應注意避開晶狀體，并穿過玻璃體進入到視網(wǎng)膜下正中央，直到感覺來自鞏膜的壓力時再緩慢注射質(zhì)粒，使其均勻擴散于整個視網(wǎng)膜。第四，電極需保證具有適當?shù)膶щ娦?，使用完的電極鑷子需保證干凈，防止被氧化影響電極接觸面積而影響轉(zhuǎn)化效率。第五，電轉(zhuǎn)化時電極鑷子的位置應適當，保證注射的質(zhì)粒在兩電極范圍內(nèi)。第六，電壓、脈沖次數(shù)和時間要不斷優(yōu)化，將細胞損傷降低并可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。

任何技術都存在一定的缺點，電轉(zhuǎn)化技術也不例外。首先，與整合型的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，外源基因表達持續(xù)時間較短，不合適進行遺傳性視網(wǎng)膜疾病等基因治療。Matsuda和 Cepko[20]研究表明GFP在視網(wǎng)膜中表達至少50 d，對于視網(wǎng)膜的發(fā)展研究時間足夠，包括晚期成熟的視桿細胞(Rod cell)、雙極細胞(Bipolar cell)及Muller細胞。其次，與病毒載體法相比，外源基因表達效率低于病毒載體。再次，電轉(zhuǎn)化技術可能會引起局部細胞損害和炎性反應等不良反應的風險。相信隨著該技術的不斷發(fā)展，上述缺點會逐一解決，活體電轉(zhuǎn)化技術將會更廣泛地應用于基礎與臨床研究。

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(責任編委: 許執(zhí)恒)

In vivo electroporation of newborn mouse retina

Lirong Xiao, Danian Chen, Naihong Yan

Ophthalmic Laboratories & Department of Ophthalmology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China

In vivo electroporation is the process referred to a transient increase in the permeability of cell membranes upon high electric field pulses and delivery of engineered constructs into cells. Compared with the viral-mediated gene transfer system, the in vivo electroporation technique has several advantages, such as safe, high efficiency, rapid, stable and wide application. Thus, this technique has been widely used in the studies of many tissues or organs, including the eye. Here, we report the application of in vivo electroporation in the newborn mouse retina. DNA plasmid of GFP expression vector with high concentration was directly injected into the subretinal space of neonatal mouse pups. The DNA was then transfected into the retinal cells after several pulses of high voltage. Transfected GFP allowed clear visualization of cell morphologies in cryo-sections and the GFP was highly expressed in retinal outer nuclear layer. The results showed that this technique can effectively transfer the genes into retinal cells. In vivo electroporation will be a useful tool for the study of retinal development and function.

in vivo electroporation; newborn mouse; retina; cryo-sections

2014-10-14;

2014-10-14

國家自然科學基金項目(編號：81371024)和四川省科技廳科技支撐項目(編號：2014SZ0030)資助

肖麗容，學士，專業(yè)方向：醫(yī)學技術學。E-mail: lirongxiao@126.com

閆乃紅，博士，副教授，研究方向：醫(yī)學遺傳學。E-mail: yannaihong@126.com

10.3724/SP.J.1005.2014.1173

時間: 2014-10-16 10:07:36

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141016.1007.001.html