王嫻君，吳尚勤，姚青海，董國峰

（1. 天津醫(yī)科大學(xué)第四中心臨床醫(yī)院，天津 300000；2. 天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)科，天津 300000）

碘克沙醇對于腎功能不全大鼠腎損傷分子-1水平及腎小管上皮細胞凋亡率的影響

王嫻君1，吳尚勤2，姚青海2，董國峰2

（1. 天津醫(yī)科大學(xué)第四中心臨床醫(yī)院，天津 300000；2. 天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)科，天津 300000）

目的 碘克沙醇對于腎功能不全大鼠腎損傷分子-1(kidney injury molecule-l，KIM-1)及腎小管上皮細胞凋亡率的干預(yù)研究。方法 將48只Wistar雄性大鼠隨機分為正常對照組，模型組，碘克沙醇組1、碘克沙醇組2 (n=12)。模型組與碘克沙醇組均采用右腎切除及左腎動脈縮窄法制作腎損傷模型。分別在術(shù)前、術(shù)后2周內(nèi)隔日經(jīng)內(nèi)眥靜脈取血測定BUN、SCr及取尿測KIM-1值。術(shù)后第3周對模型組靜脈注射生理鹽水，碘克沙醇組1注射碘克沙醇（5 mL/kg）碘克沙醇組2注射碘克沙醇（10 mL/kg），觀察碘克沙醇組在應(yīng)用對比劑前與應(yīng)用對比劑后3 h、24 h、48 h、72 h、7 d血尿素氮、肌酐和尿KIM-1的變化；術(shù)后第24 h、72 h、第7天，每組隨機選取3只大鼠處死。采取TUNEL法測定并比較這四組動物的腎小管上皮細胞凋亡率。結(jié)果 （1）與對照組相比，模型組血清BUN、SCr水平于術(shù)后第2天急劇升高(P＜0.01)，達術(shù)前2倍左右。之后逐步下降，手術(shù)后2周時穩(wěn)定于術(shù)前1.5～2.0倍水平，但尿KIM-1無顯著變化(P＞0.05)。（2）與模型組相比，碘克沙醇組2在注射后24 h、72 h、第7天BUN、SCr、KIM-1、腎小管上皮細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01），碘克沙醇組2尿KIM-1水平在碘克沙醇注射后3 h即升高，明顯早于碘克沙醇組1的升高，差異具有顯著性（P＜0.01）。結(jié)論 通過采用左腎動脈縮窄及右腎切除的方法能制備慢性輕中度腎衰竭動物模型；碘克沙醇可引起慢性腎衰竭動物的急性腎損傷，具體機制可能和該對比劑誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡有關(guān)。KIM-1能作為對比劑腎病的早期預(yù)測指標。不同濃度的對比劑對腎小管的損傷作用是不同的。

急性腎損傷；腎損傷分子-1；碘克沙醇；腎小管損傷；Wistar大鼠

隨著近年來介入技術(shù)的廣泛開展，對比劑大量應(yīng)用于臨床，由此引起對比劑腎病的發(fā)病率亦逐漸增高。對比劑腎病（contrast-induced nephropathy，CIN）是指血管內(nèi)注射碘對比劑后48h內(nèi)，在排除其他病因前提下，腎功能發(fā)生損害，血肌酐（serum creatinine，SCr）較應(yīng)用前升高≥25%或≥44.2μmol/L[1-3]，通常以醫(yī)院獲得性急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)的形式出現(xiàn)。但是，在CIN的發(fā)生和傳統(tǒng)指標SCr、BUN升高之間有一定的時間間隔，而早期診斷CIN標志物的缺乏致使延誤治療，導(dǎo)致CIN的病死率增加。因此如何早期診斷和早期治療是改善CIN患者預(yù)后的重要措施[4-5]。KIM-1是一種新的I型跨膜糖蛋白，它在正常腎組織中幾乎沒有表達。但在各種損傷因素所導(dǎo)致的急性腎損傷可使腎小管上皮細胞呈高表達[6]，是一種敏感性和特異性都較高的診斷腎小管損傷的標志物，并且尿KIM-1的升高早于血肌酐。但其能否作為CIN的早期生物標志物，目前還無相關(guān)報道。另外，隨著老齡化以及合并疾?。ㄈ绺哐獕翰?、糖尿病、腎動脈硬化等）發(fā)病率逐年升高，臨床患者往往會同時伴有不同程度慢性腎衰竭，為了貼近臨床，本實驗擬通過前瞻性研究，探討對比劑對于慢性腎衰竭大鼠急性腎損傷早期預(yù)測指標KIM-1的影響，并探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

1.1.1 動物來源

3～4月齡健康Wistar雄性大鼠48只，體質(zhì)量180～260 g（解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，經(jīng)內(nèi)眥靜脈取血，測BUN、SCr值。

1.1.2 實驗試劑盒

KIM-1 ELISA檢測試劑盒（購自上海蘭基因公司）、TUNEL檢測試劑盒（購自上海羅氏公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 腎衰竭模型的制作

模型組動物通過縮窄左側(cè)腎動脈30%，切除右側(cè)腎臟的方法構(gòu)建慢性腎衰竭模型。具體方法：術(shù)前禁食，僅給予葡萄糖水8 h。預(yù)先生理鹽水配好3%的戊巴比妥鈉，將大鼠稱重后，按照40 mg/kg方法進行腹腔注射麻醉。腹部正中切口，鈍性分離右側(cè)腎靜脈及輸尿管，將上述結(jié)構(gòu)一起結(jié)扎后切除右側(cè)腎臟。從腹主動脈分支處鈍性分離左側(cè)腎動脈，將左腎動脈輕輕挑起后，平行放置7號鈍針頭（直徑0.7 mm），將腎動脈與針頭一起結(jié)扎后，腎臟由于缺血變白色，緩慢平行抽出針頭，使腎動脈部分縮窄，狹窄處直徑為 0.7 mm，確認腎臟恢復(fù)粉紅色，結(jié)扎部位無出血后關(guān)閉腹腔。術(shù)后禁食并予以葡萄糖鹽水耳緣靜脈間斷注射12 h，后逐步恢復(fù)正常飲食。模型組術(shù)前、術(shù)后2周隔日經(jīng)內(nèi)眥靜脈取血測定血清BUN、SCr值。

1.2.2 動物分組

將上述48只動物隨即分為對照組、模型組、碘克沙醇組1及碘克沙醇組2，于術(shù)后第3周對模型組靜脈注射生理鹽水和碘克沙醇組1靜脈注射碘克沙醇5 mL/kg，碘克沙醇組2靜脈注射碘克沙醇10 mL/kg。

1.2.3 血清及尿液指標測定

兩組動物內(nèi)眥靜脈取血測定BUN、SCr值。分別于注射前、注射后第1、3、7天隨機選取3只大鼠，經(jīng)下腔靜脈取血測定BUN、SCr值；對比劑注射前、術(shù)后第3 h及第1、3、7天分別收集大鼠尿液， ELISA法檢測尿中KIM-1值。

1.2.4 腎臟病理及腎小管上皮細胞凋亡率檢測

術(shù)后第24 h、72 h、第7天，每組隨機選取3只大鼠處死。切除左側(cè)腎臟，剝離腎包膜后置于10%甲醛中固定，制備石蠟包埋切片。每張切片于400倍顯微鏡下隨機選取10個腎小管間質(zhì)視野，鏡下計數(shù)高倍視野中調(diào)亡腎小管上皮細胞的百分比即腎小管細胞凋亡率，以每張切片10個高倍視野凋亡率的總和的均值作為腎小管細胞的凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對各變量作統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料均采用x ± s表示，組間資料比較采用單因素方差分析，組內(nèi)資料比較采用配對樣本t 檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 動物模型效果檢測

模型組大鼠血清BUN、SCr水平在術(shù)后第2天開始急劇升高至術(shù)前2倍水平；然后逐漸下降，手術(shù)后2周時穩(wěn)定于術(shù)前1.5～2.0倍水平。說明腎衰竭大鼠的模型制作的成功。手術(shù)前后KIM-1無明顯變化，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明該模型成功做成慢性腎衰竭模型。見表1。

表1 模型組與對照組大鼠手術(shù)前后血清BUN、SCr、KIM-1的變化（，n=12）

表1 模型組與對照組大鼠手術(shù)前后血清BUN、SCr、KIM-1的變化（，n=12）

**與對照組組同時刻相比，P＞0.05(t術(shù)后24h=1.259，t術(shù)后72h=1.362，t術(shù)后7d=1.355) 。

?

2.2 不同劑量對比劑使用前、后血清SCr及尿KIM-1的變化

碘克沙醇組KIM-1顯著升高，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明對比劑對腎臟的急性損傷作用是顯著的，術(shù)后3 h 的KIM-1水平明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 不同劑量對比劑使用前、后血清SCr及尿KIM-1的變化（，n=12）

表2 不同劑量對比劑使用前、后血清SCr及尿KIM-1的變化（，n=12）

**與模型組同時刻相比，P＜0.01。

?

2.3 碘克沙醇組2與模型組腎小管細胞凋亡的比較

高倍顯微鏡觀察到：模型組僅可見極少凋亡現(xiàn)象，而碘克沙醇組2可見腎小管細胞大量凋亡（圖中腎小管細胞核被染成褐色），通過計算碘克沙醇組2為56.12±10.56，模型組為5.20±4.49，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.60，P＜0.01）。詳見圖1、2。

圖1 模型組生理鹽水注射后腎小管細胞凋亡情況

圖2 碘克沙醇組2注射后腎小管細胞凋亡情況

3 討論

CIN是臨床上導(dǎo)致患者住院時間延長以及有較高病死率的主要疾病之一，為老年患者常見不良事件[7]。隨著老齡化的到來，以及合并疾病（如高血壓病、糖尿病、腎動脈硬化等）發(fā)病率亦逐年升高，臨床患者往往會同時伴有不同程度慢性腎衰竭，因此，如何早期發(fā)現(xiàn)、早期治療急性腎損傷顯得尤為重要。關(guān)于大鼠腎衰竭模型的制作方法，有多種方法，如大鼠腎臟部分切除術(shù)[8]、藥物引起腎功能不全[9]、雙側(cè)腎血管結(jié)扎[10]等均取得成功。本試驗在結(jié)合上述幾種腎衰竭模型的基礎(chǔ)上，最終采用左側(cè)腎動脈縮窄、右側(cè)腎臟切除的方法制作成慢性衰竭大鼠的模型。結(jié)果表明對比劑造成了碘克沙醇組BUN、SCr、KIM-1變化，而模型組上述指標無明顯變化，有效除外手術(shù)因素對于KIM-1的影響，提示該慢性腎衰竭動物模型制作成功，也就為對比劑造成KIM-1升高排除了干擾。應(yīng)用對比劑后3 h模型組KIM-1即升高，差異具有顯著性，表明對比劑成功誘導(dǎo)急性腎損傷。本文成功制成慢性腎衰竭大鼠急性腎損傷模型，更貼近臨床。

本研究觀察到，尿KIM-1在模型組大鼠應(yīng)用造影劑后3 h就開始升高，明顯提前于BUN、SCr的升高，差異具有顯著性。表明KIM-1對急性腎損傷而言是一種新型的敏感的指標，可以成為診斷急性腎損傷并動態(tài)監(jiān)測腎損傷全部過程的指標之一。本研究之所以采用尿KIM-1，一是因為尿液方便收集；二是多數(shù)患者對于密集采取血標本的依從性差；三是因為尿KIM-1的靈敏度高，對于早期腎損傷較敏感。

碘克沙醇即威視派克是一種新型的、第三代非離子型、六碘化、雙體與血液等滲的X線對比劑。它的滲透壓為290 mOsm/kg，是一種真正意義上的等滲造影劑。故本動物實驗最大程度模擬臨床對比劑引起的急性腎損傷，為對比劑腎病的早期診斷提供指導(dǎo)。作為反映腎小管急性損傷更為敏感及精確的指標，腎小管細胞的凋亡率碘克沙醇組明顯高于模型組（P＜0.01），說明該實驗在大鼠慢性腎衰竭基礎(chǔ)上成功制作了對比劑誘導(dǎo)的急性腎小管損傷的模型，同時說明等滲型非離子造影劑碘克沙醇對腎小管的急性損傷作用是顯著的。碘克沙醇組1的腎小管細胞的凋亡率明顯低于碘克沙醇組2（P＜0.01）差異具有顯著性，說明低濃度的對比劑對腎小管細胞的損傷較小，為臨床低濃度造影劑、小劑量造影劑或水化法應(yīng)用造影劑提供了理論支持，證明了在CIN中腎小管上皮細胞的凋亡確實存在，對CIN的發(fā)病機制有一定的研究意義。碘克沙醇在繼ACC/AHA PCI 指南中作為Ⅰa 類推薦造影劑應(yīng)用于慢性腎病患者冠脈造影或行PCI 術(shù)治療后，又被作為Class I /A 推薦給高風險慢性腎病患者行冠脈造影或行PCI 術(shù)治療，碘克沙醇是至今唯一得到這一最高級別推薦的造影劑[11]。

本研究表明KIM-1在ClN中是具有早期預(yù)警作用的生化指標之一，具有很好的臨床應(yīng)用前景，值得進一步的探討與關(guān)注。

[1] STOLKER J M, McCULLOUGH P A, RAO S, et al. Preprocedural glucose level sand the risk for constrast-induced acute level stand the risk for contrast-induced acute kidney injury in patients undergoing coronary angiography[J]. J Am Coll Cardiol, 2010, 55 (14) : 1433-1440

[2] HUO Wei, ZHANG Kai, NIE Zheng, et al. Kidney injury molecule-1(KIM-1): a novel kidney-specific injury molecule playing potential double-edged functions in kidney injury[J]. Transplant Rev (Orlando), 2010, 24(3): 143-146.

[3] WU C T, SHEU M L, TSAI K S, et al. The role of endoplasmic reticulum stress-related unfolded protein response in the radiocontrast medium-induced renal tubular cell injury[J]. Toxicol Sci, 2010, 114(2): 295-301.

[4] THOMSON V, NARAYANAN K，SINGH J. Contrast induced nephropathy in urology[J]. Indian J Urol, 2009, 25 (4): 437- 445.

[5] 李慧凜, 張金元. 腎損傷分子-1與腎臟疾病[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志, 2008, 9(2): 182-184.

[6] McCULLOUGH P S，WOLYN R，ROCHER L L, et al. Acute renal failure after coronary intervention: incidence, risk factors, andrelationship to mortality[J]. Am J Med, 1997, 103(5): 366-375.

[7] HARDIEK K J，KATHOLI R E, ROBBS R S, et al. Renal effects of contrast medial in diabetic patients undergoing diagnostic or interventional coronary angiography[J]. J Diabetes Complications, 2008, 22(3): 171-177.

[9] HOUGHTON D C, ENGLISH J, BENNETT W M. Chronic tubulointerstitial nephritis and renal insufficiency associated with longterm “subtherapeutic” gentamicin[J]. J Lab Clin Med, 1988, 112(6): 694-703.

[10] 李廣宇, 周南, 王利民, 等. 小鼠急性缺血-再灌注損傷模型的建立及體會[J]. 嶺南現(xiàn)代臨床外科, 2005, 5(4): 308-310.

[11] 鄧增潮, 陳華棟, 梁增杰, 等. 碘克沙醇在高?；颊咴煊爸械陌踩訹J]. 中國醫(yī)院用藥評價與分析, 2013, 13(4): 368-369.

（責任編輯：裘永強）

The impact of Iodixanol against kidney injury molecule-1 and the renal tubular cell apoptosis in rats with renal insufficiency

WANG Xianjun1, WU Shangqin2, YAO Qinghai2, DONG Guofeng2
(1. The Fourth Central Clinical Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300000, China; 2. Department of Cardiology, Tianjin Chest Hospital, Tianjin 300000, China)

Objective To observe the impact of Iodixanol against kidney injury molecule-1 and the renal tubular cell apoptosis in rats with renal insufficiency. Methods 48 male wistar rats were randomly divided into four groups: normal control group, model group, Iodixanol group1, Iodixanol group2 (n=12). Iodixanol groups and model group were applied the methods of left renal artery narrowing (30%), right nephrectomy to produce renal insufficiency model in rats respectively, in the preoperative and postoperative 2 weeks every other day bymeasuring the angular vein blood BUN, SCr and taking urine test of urinary kidney injury molecule-1 (KIM-1) values. After the first three weeks of intravenous saline model group, iodixanol (5 mL/kg)injection of iodixanol group 1, iodixanol (10 mL/kg)injection of iodixanol group 2, the changes of blood urea nitrogen, creatinine and urinary KIM-1 of the two iodixanol groups before applying the contrast agent, after 3 h, 24 h, 48 h, 72 h and 7 d were observed. Three rats of each group were sacrified in 24 h, 72 h and 7th day after injection of contrast agent. The renal tubular cell apoptosis rates were measured by TUNEL and the differences of each group were compared. Results After in the first two days of surgery, serum BUN, SCr levels in model group were significantly higher than that of the normal group (P＜0.01) and rised sharply up to about 2 times before surgery, Then gradually decreased after surgery stable at 1.5-2.0 times the preoperative levels two weeks. But the values of KIM-1 were no significant difference (P＞0.05). Compared with the model group, in 24 h, 72 h and 7th day after the injection of contrast agents, the values of BUN and SCr, the value of KIM-1 in urine and the rates of apoptosis of renal tubular cells in iodixanol group 2 were significantly increased higher than that of the model group (P＜0.01). After three hours iodixanol injection of iodixanol group 2, urinary KIM-1 levels that increased significantly earlier than the rise in the iodixanol group1, the difference was significant (P＜0.01). Conclusion By using the left renal artery narrowing and right nephrectomy method can be prepared with mild to moderate chronic renal failure in animal models; iodixanol can cause acute kidney injury of chronic renal failure animals and the specific mechanisms may induce renal contrast agent tubule epithelial cell apoptosis. KIM-1 can be used as a contrast agent nephropathy early predictors. Different concentrations of contrast agents for renal tubular injury are different.

acute kidney injury; kidney injury molecules-1; Iodixanol; tubular injury; wistar rat

R3

A

1674-490X(2014)02-0007-05

2014-02-27

王嫻君（1977—），女，天津人，主治醫(yī)師，在讀碩士，主要從事冠心病的發(fā)病機制及介入治療研究。

吳尚勤（1952—），女，天津人，主任醫(yī)師，碩士，碩士生導(dǎo)師，主要從事冠心病的發(fā)病機制及介入治療、心律失常電生理機制及治療研究。E-mail: wushangqin1952@126.com