劉霞, 張斌, 毛新國(guó), 李昂, 孫美榮, 景蕊蓮

1. 山西大學(xué)生物工程學(xué)院, 太原 030006;

2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程, 北京 100081

小麥tae-MIR156前體基因的克隆及其靶基因TaSPL17多態(tài)性分析

劉霞1,2, 張斌2, 毛新國(guó)2, 李昂2, 孫美榮1, 景蕊蓮2

1. 山西大學(xué)生物工程學(xué)院, 太原 030006;

2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程, 北京 100081

Squamosa-promoter binding protein (SBP)-box基因是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子, 廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育,其部分成員受miR156調(diào)控。文章克隆了小麥(Triticum aestivum) tae-MIR156前體基因, 轉(zhuǎn)錄后能夠形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。小麥10個(gè)SBP-box基因中, 僅TaSPL3和TaSPL17在編碼區(qū)存在tae-miR156識(shí)別位點(diǎn)。SPL17在普通小麥的 A基因組供體種烏拉爾圖小麥(Triticum urartu, AA) UR209和 B基因組供體種擬斯卑爾脫山羊草(Aegilops speltoides, BB) Y2001中均為多拷貝(SPL17-A1、SPL17-A2和SPL17-A3; SPL17-B1、SPL17-B2和SPL17-B3), 在D基因組供體種粗山羊草(Aegilops tauschii, DD) Ae38中僅檢測(cè)到一種序列(SPL17-D); SPL17-A2與SPL17-B2, SPL17-A3與SPL17-B3、SPL17-D兩兩之間序列的一致性程度均大于99%, 且與普通小麥(中國(guó)春、衡觀(guān)35和雙豐收)的 TaSPL17序列具有較高的一致性, 提示它們可能來(lái)源于共同的祖先基因, 并且在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。靶基因 TaSPL17中的 tae-miR156識(shí)別位點(diǎn)非常保守, 在根據(jù)單株穗數(shù)和基因型多樣性挑選的 SubP1和SubP2群體中均未檢測(cè)到tae-miR156識(shí)別位點(diǎn)存在變異堿基。

miR156; SBP-box基因; 多態(tài)性分析; 普通小麥

轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò) DNA結(jié)合域(DNA-binding domains)激活或者抑制基因的表達(dá), 從而調(diào)控植物進(jìn)行正常的生長(zhǎng)、分化和代謝[1]。Squamosa-promoter binding protein (SBP)-box基因(SBP-box)也稱(chēng)作SPL (SQUAMOSA promoter-binding protein-like)基因,是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子, 廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育[2], 其部分成員受 miR156的調(diào)控。MicroRNA (miRNA)在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要調(diào)節(jié)作用, 包括開(kāi)花時(shí)序、新陳代謝以及對(duì)多種脅迫的應(yīng)激反應(yīng)等[3]。miR156是植物中一個(gè)高度保守的miRNA基因家族, 在苔蘚(Bryophyta)及高等植物中都存在, 其靶向的 SBP-box基因通過(guò)調(diào)控 miR172,進(jìn)而調(diào)節(jié)植物幼年期和成年期之間的轉(zhuǎn)變[4]。Wu等[5]揭示了 miR156通過(guò)其靶基因 SPL9/SPL10調(diào)控miR172的表達(dá)。miR156在苗期表達(dá)量最高, 隨著植物的生長(zhǎng)表達(dá)量降低, 其靶向的 SBP-box基因含量則逐漸上升。當(dāng)靶向 SBP-box基因的表達(dá)量達(dá)到一定程度時(shí), 則激活下游基因的表達(dá), 從而誘導(dǎo)植物開(kāi)花[4,5]。

SBP-box基因最早在金魚(yú)草(Antirrhinum majus)中發(fā)現(xiàn)(SBP1和SBP2), 能夠結(jié)合花器官分生組織決定基因SQUAMOSA的啟動(dòng)子[6]。根據(jù)對(duì)基因組序列進(jìn)行分析, SBP-box基因在萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中有 19～22個(gè)成員(CrSPL), 小立碗蘚(Physcomitrella patens)中有14個(gè)成員(PpSBP), 江南卷柏(Selaginella moellendorffii)中有 13個(gè)成員(SmSBP), 擬南芥(Arabidopsis thaliana)中有17個(gè)成員(AtSPL), 水稻(Oryza sativa)中有19個(gè)成員(OsSPL),玉米(Zea mays)中有31個(gè)成員(ZmSBP)[1,7,8]。最近研究表明, SBP-box基因除了促進(jìn)植物不同生育相之間的轉(zhuǎn)變, 在調(diào)控花和果實(shí)發(fā)育方面也具有重要作用,進(jìn)而影響產(chǎn)量。在水稻中, OsSPL16控制籽粒大小和形狀, 進(jìn)而影響稻米的產(chǎn)量和品質(zhì)。OsSPL16中存在 miR156的識(shí)別位點(diǎn), 對(duì)該位點(diǎn)的多態(tài)性分析結(jié)果表明：來(lái)自伊朗水稻品種Amol3的OsSPL16基因中的miR156識(shí)別位點(diǎn)處存在2 bp的插入缺失, 將這種新的等位變異位點(diǎn)導(dǎo)入高產(chǎn)水稻品種HJX74中,可以顯著提高稻米品質(zhì), 同時(shí)產(chǎn)量保持不變; 將該基因?qū)胨酒贩N Basmati中, 在保證優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)上, 可以使產(chǎn)量提高14%左右[9]。OsSPL14能夠調(diào)控水稻的株型進(jìn)而增加產(chǎn)量, 同時(shí) OsSPL14也受miR156的調(diào)控。例如在粳稻品系Shaoniejing和Ri22中發(fā)現(xiàn)該識(shí)別位點(diǎn)的一個(gè)點(diǎn)突變擾亂了 miR156對(duì)OsSPL14的調(diào)控, 使水稻分蘗減少, 穗粒數(shù)和千粒重增加, 同時(shí)莖稈變得粗壯, 抗倒伏能力增強(qiáng), 進(jìn)而提高產(chǎn)量; 將該變異位點(diǎn)導(dǎo)入粳稻品種秀水11中,可使產(chǎn)量提高約10%[10]。

迄今為止, 關(guān)于 tae-miR156與小麥 SPL基因(Triticum aestivum SQUAMOSA promoter-binding protein-like, TaSPL)家族成員的研究報(bào)道較少, 兩者的靶向關(guān)系還不清楚, 尚未見(jiàn)到靶基因中tae-miR156識(shí)別位點(diǎn)(miRNA responsive element, MRE)處的多態(tài)性研究報(bào)道。本研究以本實(shí)驗(yàn)室前期克隆的 10個(gè)小麥 TaSPL基因?yàn)榛A(chǔ), 克隆了tae-MIR156前體基因(pre-miRNA), 研究其與TaSPL基因的靶向關(guān)系, 明確具有tae-miR156識(shí)別位點(diǎn)的TaSPL基因。同時(shí)對(duì)小麥前體tae-MIR156和TaSPL17進(jìn)行基因序列結(jié)構(gòu)分析, 根據(jù)單株穗數(shù)和基因型的多態(tài)性, 從300份普通小麥中挑選出兩個(gè)小群體(31份和30份材料)檢測(cè)tae-miR156識(shí)別位點(diǎn)處的多態(tài)性, 以期為深入研究 TaSPL17的功能、揭示tae-miR156與TaSPL17對(duì)小麥生長(zhǎng)發(fā)育的影響、篩選優(yōu)異等位基因提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)材料由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。普通小麥品種偃展4110用于基因克隆。3份普通小麥(AABBDD, 2n=6x=42)中國(guó)春、衡觀(guān)35和雙豐收用于檢測(cè)基因全長(zhǎng)序列多態(tài)性; 3份普通小麥的二倍體野生近緣種：烏拉爾圖小麥 UR209(Triticum urartu, AA, 2n=2x=14)、擬斯卑爾脫山羊草Y2001(Aegilops speltoides, SS, 2n=2x=14)和粗山羊草Ae38(Aegilops tauschii, DD, 2n=2x=14)用于判斷普通小麥中目的基因序列的基因組來(lái)源。

一套由 300份普通小麥組成的自然群體于2010～2011年同時(shí)種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所昌平和順義兩個(gè)實(shí)驗(yàn)基地[11]。在越冬前、拔節(jié)期、開(kāi)花期和灌漿期各灌溉一次, 每次灌水量為75 mm。每份材料種4行小區(qū), 行長(zhǎng)2 m, 行距0.3 m,每行點(diǎn)播40粒種子。開(kāi)花期以后調(diào)查單株穗數(shù), 即有效分蘗。在每個(gè)小區(qū)的中間行中間區(qū)段調(diào)查 6株的單株穗數(shù), 取平均值。本研究從該群體中挑選兩個(gè)小群體, 命名為SubP1和SubP2, 通過(guò)測(cè)序來(lái)檢測(cè)靶基因中tae-miR156靶位點(diǎn)的多態(tài)性。SubP1是根據(jù)單株穗數(shù)調(diào)查結(jié)果挑選出的31份材料, 其中多穗材料16份, 少穗材料15份。SubP2是根據(jù)126個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性信息挑選出的 30份多態(tài)性高的材料[11]。SubP1和 SubP2材料的基本情況見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA、RNA的提取及RT-PCR

利用CTAB法提取普通小麥偃展4110葉片中基因組DNA。取偃展4110苗期頂端分生組織、葉片以及拔節(jié)期 2 cm 左右的幼穗, 液氮速凍, 采用TRIZOL法提取總RNA, 用DNase I去除DNA, 利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。以總RNA為模板, 用M-MLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司)合成cDNA第一鏈?；旌仙鲜鋈硬牧系腸DNA, 用于基因克隆。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增和測(cè)序

PCR擴(kuò)增體系為 15 μL, 其中 TransStart Fast Pfu DNA Polymerase 0.3 U。PCR擴(kuò)增條件為：96℃5 min; 96℃ 1 min, 52～62℃ 45 s, 72℃ 3 min, 32個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min; 4℃保存。按照北京百泰克生物技術(shù)有限公司 DNA回收試劑盒操作說(shuō)明回收目標(biāo)產(chǎn)物。將回收的產(chǎn)物連接到 pEASY-Blunt Simple Cloning Vector, 轉(zhuǎn)化 Trans1-T1 Phage Resistant E. coli 感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司),挑取陽(yáng)性克隆, 根據(jù)BigDye Terminator Kit(ABI公司)說(shuō)明進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 小麥tae-MIR156前體基因與TaSPL17的克隆

根 據(jù) tae-MIR156 前 體 序 列 (miRbase: MI0016450), 參照其所在小麥基因組位點(diǎn)的兩側(cè)序列(GenBank登錄號(hào)：CL902915.1), 分別于前體結(jié)構(gòu)(pre-miRNA)兩端外10 bp左右處設(shè)計(jì)引物MIRF和MIRR。以普通小麥偃展4110的基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 長(zhǎng)度約為300 bp。在小麥基因組中擴(kuò)增TaSPL17所用的引物為T(mén)aS17F和TaS17R。中間測(cè)序引物為 TaSF2、TaSR2和 TaSR3。檢測(cè)靶基因 TaSPL17中 tae-MIR156識(shí)別位點(diǎn)所用引物為miR-TaSF和miR-TaSR。本實(shí)驗(yàn)所用引物(表2)均利用 Primer 5.0 設(shè)計(jì), 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.4 基因結(jié)構(gòu)和序列分析

利用Mfold 和 RNAfold軟件預(yù)測(cè) tae-MIR156前體基因序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)[12,13]。通過(guò) psRNATarget進(jìn)行 tae-miR156靶基因的預(yù)測(cè)[14], 分析與 10個(gè)TaSPL基因[15](TaSPL1、TaSPL3、TaSPL6、TaSPL8、TaSPL15、TaSPL17、TaSPL20-TaSPL23)的靶向關(guān)系。利用DNAStar軟件包的SeqMan和MegAlign軟件進(jìn)行序列拼接、分析和比對(duì)。

1.2.5 TaSPL17基因序列相似性分析

根據(jù)普通小麥中TaSPL17的序列從GenBank中搜索到水稻(OsSPL14)、擬南芥(AtSPL9)、垂枝樺

(Betula pendula)、江南卷柏、小立碗蘚(SBP13)、萊茵衣藻的SPL基因以及金魚(yú)草SBP1和SBP2基因,登錄號(hào)依次為GU136674、CAB56591.1、CAD90157.1、XP_002978761.1、ABM67305.1、EDP04027.1、Q38741.1和Q38740.1。將上述搜索到的基因與小麥TaSPL17序列進(jìn)行相似性分析, 利用SMART軟件分析基因的保守結(jié)構(gòu)域; 用 MEGA 4.1軟件構(gòu)建系譜進(jìn)化樹(shù)[16,17]。

表1 小麥SubP1和SubP2群體材料名稱(chēng)及其來(lái)源

表2 本文所用的引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥 tae-MIR156前體基因序列及轉(zhuǎn)錄后二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

以普通小麥偃展 4110的基因組 DNA為模板,擴(kuò)增 tae-MIR156前體基因(miRbase: MI0016450),對(duì)檢測(cè)到的24個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序, 結(jié)果表明小麥偃展4110的tae-MIR156前體基因主要有兩種序列,分別命名為tae-MIR156-1和tae-MIR156-2, 兩種序列的一致性為96.9%。tae-MIR156-1與miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的 tae-MIR156核苷酸序列一致性為97.8%; tae-MIR156-2與 tae-MIR156序列一致性為95.5% (圖 1)。利用 Mfold 和 RNAfold軟件預(yù)測(cè)tae-MIR156前體基因 3種序列的二級(jí)結(jié)構(gòu), 偃展4110的兩種序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄后均形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖2)。在tae-MIR156 3種序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)中, 其莖環(huán)結(jié)構(gòu)基本相似, 不過(guò)由于三者在中間部位都存在 21 bp的InDel位點(diǎn), 故 tae-MIR156-1和 tae-MIR156-2比tae-MIR156在中間部位多形成一個(gè)由21 bp組成的莖環(huán)狀突起, 其余結(jié)構(gòu)相似, 3種序列中成熟tae-miR156所在臂的位置基本一致(圖2)。

2.2 tae-miR156靶基因預(yù)測(cè)及TaSPL17基因結(jié)構(gòu)

植物 miRNA與靶基因高度互補(bǔ), 并引起靶向mRNA的降解, 可以進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)[18,19]。在10個(gè)小麥 TaSPL家族成員中[15], 僅 TaSPL3和 TaSPL17在編碼區(qū)存在tae-miR156的靶位點(diǎn)(圖3), 表明其受tae-miR156的調(diào)控。利用引物TaS17F和TaS17R擴(kuò)增偃展4110中TaSPL17基因的基因組和cDNA序列,其片段長(zhǎng)度分別為4.1 kb和1.2 kb, 該基因結(jié)構(gòu)中包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子(圖4：A、B), tae-miR156的靶位點(diǎn)位于第3個(gè)外顯子(圖4C)。

2.3 TaSPL17基因同源性分析

將TaSPL17的SBP保守結(jié)構(gòu)域在NCBI中進(jìn)行BLASTP比對(duì), 在氨基酸水平上發(fā)現(xiàn)與水稻(OsSPL14)、擬南芥(AtSPL9)、SBP_垂枝樺、石松門(mén)(SBP_江南卷柏)、苔蘚(SBP13_小立碗蘚)和藻類(lèi)(SBP_萊茵衣藻)的 SPL基因一致性依次為 82.3%、77.2%、65.8%、76.0%、75.9%和 53.8%; 與最早在金魚(yú)草中報(bào)道的SBP1和SBP2的一致性為65.8%和67.1% (圖5A)。根據(jù)上述SPL基因的SBP保守結(jié)構(gòu)域構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 結(jié)果表明, TaSPL17與OsSPL14親緣關(guān)系最近, 與SBP_萊茵衣藻中的SPL基因親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖5B)。另外, SBP結(jié)構(gòu)域中包含兩個(gè)典型的鋅指結(jié)構(gòu)(Cys3His和Cys2HisCys), 其保守位點(diǎn)見(jiàn)圖5C, 這一結(jié)構(gòu)在綠色植物中普遍存在。

2.4 TaSPL17蛋白質(zhì)序列多態(tài)性

以小麥偃展4110的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序, 檢測(cè)48個(gè)陽(yáng)性單克隆序列。測(cè)序結(jié)果表明TaSPL17基因主要分為5種序列, 將其蛋白質(zhì)序列分別命名為YZ4110_cDNA_1、YZ4110_cDNA_2、YZ4110_cDNA_3、YZ4110_cDNA_4和 YZ4110_ cDNA_5(圖6)。在SBP結(jié)構(gòu)域和tae-miR156的靶位點(diǎn)處(圖6), 5種序列沒(méi)有差異, 說(shuō)明結(jié)構(gòu)域和識(shí)別位點(diǎn)具有高度保守性。

2.5 普通小麥及其二倍體野生近緣種 SPL17基因組DNA序列多態(tài)性

圖1 tae-MIR156前體基因3種序列的比對(duì)

圖2 tae-MIR156前體基因轉(zhuǎn)錄后形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)A：miRBase中tae-MIR156前體莖環(huán)結(jié)構(gòu); B：偃展4110 tae-MIR156-1轉(zhuǎn)錄后的莖環(huán)結(jié)構(gòu); C：偃展4110 tae-MIR156-2轉(zhuǎn)錄后的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。圖中黑色方框表示tae-MIR156前體基因序列中成熟tae-miR156的位置。

圖3 tae-miR156靶基因預(yù)測(cè)

以3份小麥二倍體野生近緣種及3份普通小麥為材料, 用引物 TaS17擴(kuò)增 SPL17, 每份材料檢測(cè)24個(gè)單克隆序列。測(cè)序結(jié)果表明烏拉爾圖小麥(UR209)中有3種序列, 命名為SPL17-A1、SPL17-A2和SPL17-A3; 擬斯卑爾脫山羊草(Y2001)中也有到3種序列, 命名為SPL17-B1、SPL17-B2和SPL17-B3;在粗山羊草(Ae38)中僅擴(kuò)增到 1種序列, 命名為SPL17-D。因此, SPL17在普通小麥的A基因組供體種烏拉爾圖小麥(UR209)和 B基因組供體種擬斯卑爾脫山羊草(Y2001)中均為多拷貝, 而在D基因組供體種粗山羊草(Ae38)可能為單拷貝。普通小麥 3個(gè)野生近緣種中的 SPL17序列具有高度的一致性, 其中 SPL17-A2與 SPL17-B2的序列一致性為 99.2%, SPL17-A3與SPL17-B3、SPL17-A3與SPL17-D的一致性分別為 99.9%和 99.4%, SPL17-B3與 SPL17-D的序列一致性為99.4%(表3)。

圖4 TaSPL17基因cDNA全長(zhǎng)及其編碼的氨基酸序列A：TaSPL17基因結(jié)構(gòu)圖; B：小麥偃展4110 基因組DNA中擴(kuò)增的TaSPL17產(chǎn)物; C：TaSPL17基因SBP結(jié)構(gòu)域與tae-miR156的靶位點(diǎn)。圖C方框中的序列表示TaSPL17基因的SBP結(jié)構(gòu)域; 星號(hào)表示TaSPL17基因中的靶位點(diǎn)。

圖5 TaSPL17基因與其他物種SBP-box基因的SBP保守結(jié)構(gòu)域序列A：不同物種SBP-box基因的SBP保守結(jié)構(gòu)域序列一致性分析; B：不同物種SBP-box基因的SBP保守結(jié)構(gòu)域系譜進(jìn)化分析; C：不同物種SBP-box基因的SBP保守結(jié)構(gòu)域序列多重比對(duì)?！硎維BP結(jié)構(gòu)域中兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的保守位點(diǎn), 即：Cys、Cys、Cys、His(Cys3His)和Cys、Cys、His、Cys (Cys2HisCys)。

圖6 偃展4110中TaSPL17蛋白質(zhì)序列比對(duì)第一個(gè)方框中的序列表示SBP結(jié)構(gòu)域, 第二個(gè)方框中的序列表示tae-miR156的靶位點(diǎn)。

表3 小麥二倍體野生近緣種中SPL17基因組DNA序列的一致性分析

圖7 普通小麥及其二倍體野生近緣種SPL17的DNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

在普通小麥中國(guó)春(CS)和衡觀(guān) 35(Heng)基因組DNA中均擴(kuò)增到3種序列, 命名為T(mén)aSPL17-CS1、TaSPL17-CS2、TaSPL17-CS3和 TaSPL17-Heng1、TaSPL17-Heng2、TaSPL17-Heng3。在雙豐收(Shuang)基因組 DNA中擴(kuò)增到 2種序列 TaSPL17-Shuang1和 TaSPL17-Shuang2。其中 TaSPL17-CS1、 TaSPL17-CS2、TaSPL17-Heng1、TaSPL17-Heng2、TaSPL17-Shuang1與小麥二倍體野生近緣種的SPL17-A2、SPL17-B2和SPL17-B1聚在同一個(gè)進(jìn)化分枝中(圖 7), 而 TaSPL17-CS3、TaSPL17-Heng3、TaSPL17-Shuang2與SPL17-A3、SPL17-B3、SPL17-D聚在一起。SPL17-A1與普通小麥TaSPL17的序列相似性最低。

2.6 靶基因TaSPL17中tae-miR156識(shí)別位點(diǎn)的多態(tài)性

在本實(shí)驗(yàn)室前期克隆的10個(gè)小麥TaSPL家族成員中, 僅TaSPL3和TaSPL17受tae-miR156調(diào)控。對(duì)TaSPL17基因結(jié)構(gòu)及其在普通小麥和二倍體野生近緣種中的序列多態(tài)性分析結(jié)果表明：TaSPL17在普通小麥的A基因組供體種和B基因組供體種中均為多拷貝, 而在 D基因組供體種中可能為單拷貝,并且其在 3個(gè)野生近緣種中存在高度一致的序列,在六倍體普通小麥中也克隆到多種序列。本研究從300份普通小麥中根據(jù)單株穗數(shù)和基因型的多態(tài)性挑選出兩個(gè)小群體, 即SubP1和SubP2, 重點(diǎn)檢測(cè)靶基因中 tae-miR156識(shí)別位點(diǎn)的多態(tài)性, 為篩選優(yōu)異等位變異提供依據(jù)。小群體SubP1的單株穗數(shù)如圖8所示。利用引物miR-TaS擴(kuò)增小麥TaSPL17的DNA序列, 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 700 bp。每份材料至少檢測(cè)12個(gè)單克隆序列。測(cè)序結(jié)果表明在SubP1的31份材料和 SubP2的 30份材料中均未檢測(cè)到 TaSPL17中tae-miR156識(shí)別位點(diǎn)處存在變異的材料, 這表明TaSPL17中miR156識(shí)別位點(diǎn)高度保守。

圖8 SubP1群體材料的單株穗數(shù)

3 討 論

miRNA屬于小RNA的一種, 由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄生成, 廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程調(diào)控, 可以在不同層次上對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控, 包括轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯等[20]。miRNA靶基因大多為編碼調(diào)控蛋白的轉(zhuǎn)錄因子, 例如miR156的靶基因?yàn)镾BP-box基因家族[21]、miR159/319的靶基因?yàn)镸YB基因家族[22]、miR160的靶基因?yàn)锳RF基因家族[23]、miR164的靶基因?yàn)镹AC基因家族[24]、miR172的靶基因?yàn)锳P2基因家族[25]。研究miRNA所調(diào)控的靶基因, 以及兩者的相互作用關(guān)系對(duì)于詮釋其功能至關(guān)重要。由于植物miRNA與其靶基因的互補(bǔ)程度較高, 也使得預(yù)測(cè)miRNA的靶基因更加方便可靠[26]。

SBP-box基因家族成員的多樣性使其能夠調(diào)控植物的眾多生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程, 比如花的形成和發(fā)育[27,28]、葉片形狀及表皮性狀[21]、對(duì)環(huán)境信號(hào)的應(yīng)答[29]、育性[30]和果實(shí)的成熟和產(chǎn)量[9]等。小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一, 對(duì)其 miRNA156及其靶基因的研究具有十分重要的意義。本研究以普通小麥偃展4110為材料, 克隆了小麥tae-MIR156前體基因, 主要分為兩種序列, 與 miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的序列相似, 經(jīng)轉(zhuǎn)錄后均形成莖環(huán)結(jié)構(gòu), 3種序列中成熟tae-miR156所在臂的位置基本一致(圖2)。前人研究表明, 在擬南芥和水稻中各有11個(gè)AtSPL和OsSPL家族成員存在miR156識(shí)別位點(diǎn), 大多數(shù)位于編碼區(qū), 少數(shù)位于非編碼區(qū)(UTR), 如擬南芥中的AtSPL3、AtSPL4和 AtSPL5, 水稻中的 OsSPL4和OsSPL13均位于3′-UTR區(qū)域[2,26,31]。然而, 在小麥的 10個(gè) TaSPL基因中[15], 僅檢測(cè)到兩個(gè)成員TaSPL3和TaSPL17編碼區(qū)存在tae-miR156的靶位點(diǎn)(miRNA responsive element, MRE)(圖3)。其原因一方面可能是研究中所用的 10個(gè) TaSPL基因[15]并不是小麥中所有的 SBP-box家族成員, 或者這 10個(gè)TaSPL基因并未包含全部的5′-UTR和3′-UTR區(qū)域,因此需要通過(guò) 5′-RACE和 3′-RACE獲得全長(zhǎng)的UTR區(qū)域進(jìn)一步確定; 另一方面也可能是由于小麥SBP-box基因受tae-miR156調(diào)控的模式與擬南芥和水稻中SBP-box基因家族成員不盡相同。

SBP-box基因早在綠藻和陸生植物的祖先分化之前就已經(jīng)產(chǎn)生, 在其最后一個(gè)共同祖先分化之后,陸生植物的SBP-box基因就開(kāi)始分化[7]。SBP-box靶基因中 miR156的識(shí)別位點(diǎn)普遍存在于陸生植物中, miRNA識(shí)別位點(diǎn)的保守性也說(shuō)明了其與靶基因的相互作用對(duì)于植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要性。在苔蘚和石松門(mén)植物中, 僅有少數(shù)幾個(gè) SBP-box基因受到miR156的調(diào)控; 然而被子植物(如擬南芥和水稻)的SBP-box基因家族成員中普遍存在miR156的識(shí)別位點(diǎn)[7]。在小麥的10個(gè)TaSPL基因中僅檢測(cè)到兩個(gè)成員的編碼區(qū)存在tae-miR156靶位點(diǎn)[15], 這是否暗示小麥SBP-box基因是由古老的SBP-box祖先基因進(jìn)化而來(lái), 并且在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中, 未獲得tae-miR156的識(shí)別位點(diǎn), 有待進(jìn)一步研究。

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中, 基因或基因組的復(fù)制是普遍存在的現(xiàn)象, 這也是基因獲得新功能, 進(jìn)而促使植物進(jìn)化形成新物種的內(nèi)在動(dòng)力[32]。普通小麥?zhǔn)怯葾、B和D3個(gè)染色體組組成的異源六倍體物種, 從原始的二倍體物種進(jìn)化到現(xiàn)代的六倍體, 普通小麥經(jīng)歷了兩次異源多倍化過(guò)程。本研究以小麥tae-miR156靶向的 TaSPL17進(jìn)行多態(tài)性分析, 以普通小麥偃展4110的cDNA為模板, 擴(kuò)增獲得5種序列; 以小麥二倍體野生近緣種烏拉爾圖小麥(UR209)、擬斯卑爾脫山羊草(Y2001)和粗山羊草(Ae38)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 分別獲得3、3和1種序列(圖6, 表3)。因此, SPL17在普通小麥的A基因組供體種和B基因組供體種中均為多拷貝。并且SPL17-A2與SPL17-B2, SPL17-A3與SPL17-B3, SPL17-A3與SPL17-D和SPL17-B3與SPL17-D之間序列的一致性程度均大于 99%, 據(jù)此推測(cè)其可能來(lái)源于共同的祖先基因, 在進(jìn)化過(guò)程中比較保守, 并且與普通小麥中克隆到的TaSPL17基因序列聚在一起, 屬于直系同源。而SPL17-A1與普通小麥中克隆到的TaSPL17基因序列關(guān)系最遠(yuǎn), 相似性最小(圖7)。另外, 本研究根據(jù)單株穗數(shù)和基因型的多樣性共挑選出61份材料, 均未檢測(cè)到tae-miR156識(shí)別位點(diǎn)的變異, 說(shuō)明六倍體普通小麥 TaSPL17基因tae-miR156的識(shí)別位點(diǎn)非常保守。對(duì)44個(gè)SBP-box基因(包括16個(gè)AtSPL、18個(gè)OsSPL和10個(gè)TaSPL基因)的 SBP保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列構(gòu)建系譜進(jìn)化樹(shù), 小麥 TaSPL17與水稻的 OsSPL14和 OsSPL17,擬南芥的 AtSPL9和 AtSPL15聚在同一個(gè)進(jìn)化分支上[15]。OsSPL14能夠調(diào)控水稻的株型, 提高產(chǎn)量; AtSPL9/15也參與調(diào)控花器官的形態(tài)建成并促進(jìn)分枝[9,33]。我們的前期研究也表明, TaSPL17主要在莖的頂端分生組織和穗中表達(dá), 并且其表達(dá)模式響應(yīng)穗部發(fā)育[15], 這預(yù)示著 TaSPL17基因可能通過(guò)與tae-miR156的相互作用, 共同參與對(duì)小麥分蘗和穗部發(fā)育的調(diào)控, 相關(guān)研究正在進(jìn)行中。

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(責(zé)任編委: 夏先春)

Cloning of tae-MIR156 precursor gene and sequence polymorphisms of tae-miR156 targeted TaSPL17

Xia Liu1,2, Bin Zhang2, Xinguo Mao2, Ang Li2, Meirong Sun2, Ruilian Jing2

1. College of Bioengineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China;
2. National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Squamosa-promoter binding protein (SBP)-box genes, encoding plant-specific transcription factors, play an important role in plant development. Some members of the SBP-box gene family are regulated by miR156. In this study, we cloned the tae-MIR156 precursor gene, which could form a stem loop after its transcription. Sequence analysis showed thatTaSPL3 and TaSPL17 had putative targets of tae-miR156 among the ten wheat SBP-box genes. The diploid donor species of hexaploid common wheat (Triticum aestivum, genome AABBDD), i.e., Triticum urartu (AA) UR209 and Aegilops speltoides Y2001 (SS, closely related to BB) possessed more than one copy of SPL17 (SPL17-A1, SPL17-A2 and SPL17-A3 from Triticum urartu; SPL17-B1, SPL17-B2 and SPL17-B3 from Aegilops speltoides), while Aegilops tauschii (DD) Ae38 only possessed one (SPL17-D). The identities between nucleotide sequences of SPL17-A2 and SPL17-B2, SPL17-A3 and SPL17-B3 or SPL17-D were higher than 99%. They were highly similar with the sequence of TaSPL17 in common wheat cultivars Chinese Spring, Hengguan 35 and Shuangfengshou. These genes might originate from a common ancestor and were highly conserved in the process of evolution. The target site of tae-miR156 in TaSPL17 was also highly conserved in two subgroups consisted of accessions with diverse spike number per plant and genetic background.

miR156; SBP-box gene; polymorphism analysis; common wheat

2014-01-09;

2014-02-11

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(863計(jì)劃)(編號(hào)：2012AA10A308)資助

劉霞, 碩士研究生, 專(zhuān)業(yè)方向：小麥基因資源發(fā)掘。E-mail: liuxia1214lx@163.com

景蕊蓮, 博士, 研究員, 研究方向：作物抗逆生物學(xué)。E-mail: jingruilian@caas.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0592

時(shí)間: 2014-5-6 15:13:00

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140506.1513.004.html