朱 娟 王 欣 韋博尤 唐順明 黃金山 郝碧芳 沈興家

(1江蘇科技大學(xué)，江蘇鎮(zhèn)江 212003;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，農(nóng)業(yè)部蠶桑遺傳改良重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江 202018;3廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧 530007)

家蠶山梨醇脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄水平特性分析

朱 娟1，2王 欣1，2韋博尤3唐順明1，2黃金山1，2郝碧芳1，2沈興家1，2

(1江蘇科技大學(xué)，江蘇鎮(zhèn)江 212003;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，農(nóng)業(yè)部蠶桑遺傳改良重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江 202018;3廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧 530007)

為了探究家蠶山梨醇脫氫酶基因(BmSDH)在家蠶各發(fā)育時期和組織的轉(zhuǎn)錄水平，根據(jù)家蠶二化性品種子代滯育性受親代胚胎期催青條件調(diào)控的原理，利用半定量RT－PCR分析25.0℃常溫明催青和17.5℃低溫暗催青對家蠶品種“秋豐”各發(fā)育時期蠶體和組織中BmSDH轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示，BmSDH－1、BmSDH－2a和BmSDH－2b在家蠶的各個發(fā)育階段均有表達(dá):在幼蟲期5齡3 d，BmSDH－1在常溫明催青組脂肪體中轉(zhuǎn)錄水平較高;BmSDH－2a和BmSDH－2b在常溫明催青條件下的血液、脂肪體和卵巢中轉(zhuǎn)錄水平均高于低溫暗催青;在蛹期3 d，BmSDH－2a和BmSDH－2b在常溫明催青條件下血液和卵巢中的轉(zhuǎn)錄水平均低于低溫暗催青;在次代卵產(chǎn)下后6～24 h期間，BmSDH－2a和BmSDH－2b的轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高。因此，BmSDH－1和蠶卵滯育與否沒有直接關(guān)系，而BmSDH－2a和BmSDH－2b與家蠶二化性品種卵滯育與否有重要的平行關(guān)系，為從分子水平闡明家蠶滯育的分子機(jī)制積累了試驗數(shù)據(jù)。

家蠶;滯育;山梨醇脫氫酶;基因表達(dá);半定量RT－PCR

滯育是由神經(jīng)激素調(diào)節(jié)的、呼吸代謝速率緩慢的一種動態(tài)過程，是昆蟲為躲避不良環(huán)境而中止發(fā)育的一種適應(yīng)，也是昆蟲生活周期與季節(jié)變化保持一致的一種基本手段［1］。昆蟲滯育類型很多，其中蛹期滯育和卵滯育是比較典型的滯育方式［2－4］。對昆蟲滯育機(jī)制的研究有利于經(jīng)濟(jì)昆蟲的開發(fā)利用和農(nóng)林害蟲的防治;因此，昆蟲滯育研究一直受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，而家蠶(Bombyx mori)則是研究滯育機(jī)理的優(yōu)良模式昆蟲。

家蠶是卵滯育型昆蟲［5］。家蠶卵內(nèi)山梨醇含量與滯育的發(fā)動、持續(xù)與解除具有密切的平行關(guān)系［6－7］。隨著滯育的發(fā)動，蠶卵中儲存的糖原轉(zhuǎn)化為山梨醇和70%的甘油［8－12］，隨著滯育的終止，山梨醇又轉(zhuǎn)化為糖原［8，11－12］。目前的研究只發(fā)現(xiàn)山梨醇在穩(wěn)定亞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能上起作用［13－14］，而且高濃度的山梨醇可能是抑制胚胎發(fā)育的原因［15－16］。山梨醇脫氫酶 (Sorbitol Dehydrogenase，SDH)是調(diào)節(jié)山梨醇代謝的關(guān)鍵酶，它催化山梨醇脫氫轉(zhuǎn)化為糖原，從而改變昆蟲的發(fā)育狀態(tài)［17］。研究顯示，家蠶在滯育過程中BmSDH的轉(zhuǎn)錄受到抑制，滯育卵經(jīng)5℃低溫長期冷藏或者短期冷藏并浸酸處理，可以解除這種抑制，從而使BmSDH表達(dá)，進(jìn)而促使滯育卵內(nèi)山梨醇的轉(zhuǎn)化。非滯育卵BmSDH的轉(zhuǎn)錄則不受抑制，隨著胚胎發(fā)育而適時表達(dá)［18］。作為與滯育有著密切關(guān)系的BmSDH，在家蠶卵期的表達(dá)情況已較為明確，但其在家蠶的其他時期和組織中的表達(dá)情況不甚了解。

本試驗將家蠶二化性品種“秋豐”的活化越年蠶卵用蛾區(qū)半分法分成2組，分別進(jìn)行常溫(25.0℃)明催青和低溫(17.5℃)暗催青處理，采用半定量RT－PCR方法，分析各發(fā)育時期蠶體組織中BmSDH基因的3種mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，探討常溫明催青和低溫暗催青對BmSDH轉(zhuǎn)錄水平的影響，為闡明家蠶二化性品種胚胎期的催青條件決定子代滯育性的分子水平機(jī)制提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蠶品種:秋豐，二化性，3個卵圈，由本實驗室保存。

主要試劑和儀器:RNAiso Plus，PrimeScriptTMRT reagents Kit(Perfect Real Time)為大連寶生物公司(TaKaRa)產(chǎn)品。A10型Milli-Q超純水凈化儀由美國Millipore公司生產(chǎn);Mini－Sub Cell?GT型瓊脂糖電泳裝置由美國伯樂公司生產(chǎn);Veriti 96孔型梯度PCR儀由美國ABI公司生產(chǎn);G:BOX F3型凝膠成像儀由英國SYNGENE公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)置和材料的準(zhǔn)備 將已解除滯育的越年蠶卵每個卵圈一分為二(蛾區(qū)半分法)，第1組進(jìn)行常溫明催青處理:溫度25.0℃，相對濕度70% ～85%，光照10～12 h/d;第2組進(jìn)行低溫暗催青處理:溫度17.5℃，相對濕度70% ～85%，保持黑暗。

孵化后的蟻蠶采用常規(guī)方法新鮮桑葉飼養(yǎng)，在家蠶的不同發(fā)育時期分別取蟻蠶，2～4齡的起蠶，5齡3 d的蠶，化蛹3 d的蛹，未交配的成蟲(處女蛾)，產(chǎn)卵后保護(hù)6、12、24 h的子代卵;其中，5 齡3 d的蠶、化蛹3 d的蛹和未交配的成蟲各取血液、脂肪體、卵巢;取材后的樣品于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 家蠶總RNA的提取及cDNA的合成 按RNAiso Plus說明書提取各發(fā)育時期蠶體和組織的總 RNA，用PrimeScriptTMRT reagents Kit(Perfect Real Time)將各發(fā)育時期蠶體和組織總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得單鏈cDNA。

1.2.3 BmSDH－1、BmSDH－2a和 BmSDH－2b mRNA轉(zhuǎn)錄水平的半定量RT－PCR檢測 參照參考文獻(xiàn)［19］的方法設(shè)計引物(表1)，以合成的各樣本cDNA為模板，以家蠶Actin－3基因為內(nèi)參，通過半定量RT－PCR檢測BmSDH在家蠶各發(fā)育時期的水平。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30 個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果利用Gene tools凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行分析計算，3個重復(fù)。

表1 引物及其序列

2 結(jié)果與分析

2.1 BmSDH在蟻蠶和2～4齡起蠶中的轉(zhuǎn)錄水平

分別以蟻蠶和2～4齡起蠶個體為材料，以1 μg總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(其他時期及組織相同)，用半定量RT－PCR方法分析了BmSDH的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明:從蟻蠶至各齡起蠶期，BmSDH－1轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高;但BmSDH－2a和BmSDH－2b的轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化。不論是BmSDH－1，還是BmSDH－2a和BmSDH－2b，在2種不同催青條件(常溫明催青組，低溫暗催青組)處理后的轉(zhuǎn)錄水平均無明顯差別(圖1)。

圖1 不同催青處理后Bm SDH在蟻蠶和各齡起蠶期中的轉(zhuǎn)錄水平

2.2 BmSDH在家蠶5齡3 d各組織的轉(zhuǎn)錄水平

分別以家蠶5齡3 d幼蟲的血液、脂肪體和卵巢為材料，提取總RNA，用半定量RT－PCR的方法分析BmSDH在各組織中的轉(zhuǎn)錄水平。如圖2所示，BmSDH－1在血液中的轉(zhuǎn)錄水平很低，幾乎檢測不到;而在脂肪體中，常溫明催青組的轉(zhuǎn)錄水平高于低溫暗催青組;BmSDH－1在卵巢中的轉(zhuǎn)錄水平也較低，且2種催青處理間沒有明顯變化。BmSDH－2a在血液、脂肪體和卵巢中的轉(zhuǎn)錄水平都很低，且常溫明催青組高于低溫暗催青組，說明BmSDH－2a在5齡3 d血液、脂肪體和卵巢中的轉(zhuǎn)錄水平受胚胎期催青條件的影響。BmSDH－2b在血液、脂肪體和卵巢中的轉(zhuǎn)錄水平也較低，且常溫明催青組高于低溫暗催青組，說明BmSDH－2b在5齡3 d血液、脂肪體和卵巢中的轉(zhuǎn)錄水平也受胚胎期催青條件的影響，但是它在脂肪體和卵巢中的轉(zhuǎn)錄水平略高于血液。

圖2 不同催青處理后BmSDH在家蠶5齡3 d不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平

2.3 BmSDH在蛹期3 d各組織的轉(zhuǎn)錄水平分析

分別以家蠶化蛹3 d蛹的血液、脂肪體和卵巢為材料，對BmSDH進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析。如圖3所示，在脂肪體中BmSDH－1在常溫明催青處理的轉(zhuǎn)錄水平低于低溫暗催青處理組，而血液和卵巢組織中BmSDH－1在2種不同催青條件下的轉(zhuǎn)錄水平無明顯區(qū)別。BmSDH－2a在血液中的轉(zhuǎn)錄水平很高，且常溫明催青處理組明顯低于低溫暗催青組;在脂肪體中其轉(zhuǎn)錄水平較低，且2種催青處理下的變化不明顯;BmSDH－2a在常溫明催青處理組卵巢中幾乎未檢測到，但在低溫暗催青組中有很高的轉(zhuǎn)錄水平。同時，BmSDH－2b顯示出和BmSDH－2a相同的變化特征，說明BmSDH－2a和BmSDH－2b與子代蠶卵滯育與否有密切的平行關(guān)系。在滯育卵中需要大量的山梨醇提高卵的抗寒能力，非滯育卵中需要BmSDH將山梨醇轉(zhuǎn)化為糖原，為胚胎發(fā)育提供能量。這一結(jié)果從分子水平上證實以往推測的滯育激素抑制BmSDH的轉(zhuǎn)錄［18］。

2.4 BmSDH在家蠶成蟲期各組織的轉(zhuǎn)錄水平

圖3 不同催青處理后Bm SDH在蛹期3 d不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平

以羽化1 d處女蛾的血液、脂肪體和卵巢組織為材料，通過半定量RT－PCR的方法分析BmSDH的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果如圖4所示:BmSDH－1在血液、脂肪體和卵巢組織轉(zhuǎn)錄水平都較低，尤其是在血液中最低;BmSDH－2a在血液和脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平較低，而在卵巢中的轉(zhuǎn)錄水平很高;不同催青處理對BmSDH－1和BmSDH－2a的轉(zhuǎn)錄水平基本沒有影響;BmSDH－2b在不同組織和不同催青處理組中，轉(zhuǎn)錄水平均無明顯變化。由此可見，成蟲期BmSDH的轉(zhuǎn)錄水平與子代滯育與否沒有直接的關(guān)聯(lián)。

圖4 不同催青處理后BmSDH在成蟲期不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平

2.5 BmSDH在子代卵中的轉(zhuǎn)錄水平

在光線明亮的條件下將雌蛾與雄蛾交配6～8 h，讓其集中產(chǎn)卵，為減少試驗誤差，將產(chǎn)卵時間控制在30 min內(nèi)，分別以不同催青處理產(chǎn)卵后6、12、24 h的子代卵為材料，分析BmSDH的轉(zhuǎn)錄水平。由圖5可以看出，在胚胎期不同催青處理的家蠶所產(chǎn)的子代卵中，BmSDH－1的轉(zhuǎn)錄水平較低，其轉(zhuǎn)錄水平從產(chǎn)卵后6～24 h沒有明顯變化，2種不同催青處理間也沒有明顯差別。BmSDH－2a的轉(zhuǎn)錄水平隨著產(chǎn)卵后保護(hù)時間的延長而逐漸提高，產(chǎn)卵后6 h的蠶卵未檢測到轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)卵后12 h的蠶卵達(dá)到較高水平，這一結(jié)果與滯育卵在產(chǎn)卵后36 h之內(nèi)BmSDH－2a的轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高［20］相一致。BmSDH－2b的轉(zhuǎn)錄水平也隨產(chǎn)卵后保護(hù)時間的延長而升高;但BmSDH－2a和BmSDH－2b的轉(zhuǎn)錄水平在不同催青處理的子代卵中未見明顯變化。

圖5 不同催青處理后BmSDH在子代卵中的轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

家蠶卵內(nèi)山梨醇含量與滯育開始、持續(xù)和解除的過程具有密切的平行關(guān)系［6－7］，而SDH是調(diào)節(jié)山梨醇代謝的酶。之前的文獻(xiàn)大都側(cè)重于家蠶卵期的研究，而對家蠶其他時期和組織的研究未見報道。根據(jù)二化性品種胚胎期常溫明催青和低溫暗催青處理分別產(chǎn)滯育卵和非滯育卵的原理，本試驗利用半定量RT－PCR方法，在mRNA水平上分析了滯育卵和非滯育卵形成前期BmSDH在不同時期和組織中的轉(zhuǎn)錄水平。試驗結(jié)果表明:BmSDH的表達(dá)具有時空特異性，不同催青溫度條件、不同發(fā)育時期和組織的轉(zhuǎn)錄水平存在差異。

在5齡3 d，BmSDH－1在常溫明催青組的脂肪體中有較高的轉(zhuǎn)錄水平，說明其具有組織特異性;BmSDH－2a和BmSDH－2b在常溫明催青條件下血液、脂肪體和卵巢中的轉(zhuǎn)錄水平均高于低溫暗催青處理組。已有研究顯示，常溫明催青條件下5齡3 d的保幼激素的分泌水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于低溫暗催青［21］，保幼激素可能與BmSDH－2a和BmSDH－2b的轉(zhuǎn)錄水平具有相關(guān)性，至于如何影響還需進(jìn)一步研究。

在化蛹3 d，BmSDH－2a和BmSDH－2b在脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平較低，且不同催青處理之間無明顯差別，在常溫明催青條件下血液和卵巢中的轉(zhuǎn)錄水平均明顯低于低溫暗催青。胚胎期常溫明催青處理發(fā)育而來的雌蛹，其咽下神經(jīng)節(jié)分泌大量的滯育激素并通過血液輸送到卵巢;而低溫黑暗催青處理發(fā)育而來的雌蛹滯育激素水平很低［22］，由此我們推斷滯育激素可能參與BmSDH－2a和BmSDH－2b的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

在子代卵中，BmSDH－2a和BmSDH－2b的轉(zhuǎn)錄水平雖然在24 h內(nèi)呈逐漸增強(qiáng)的趨勢，但在2種催青處理間沒有明顯的差異。有學(xué)者認(rèn)為，產(chǎn)卵后36 h內(nèi)蠶卵需要一定的營養(yǎng)供給［20］，BmSDH－2a和BmSDH－2b轉(zhuǎn)錄水平的逐漸升高，可能將一部分山梨醇由醇轉(zhuǎn)化為單糖被胚胎利用。而BmSDH－1的轉(zhuǎn)錄水平較低，且不隨時間的延長而變化，說明BmSDH－1的表達(dá)產(chǎn)物和家蠶卵滯育與否沒有直接關(guān)系，其原因還需進(jìn)一步的研究。

本試驗結(jié)果為研究家蠶滯育的分子機(jī)理提供了新的試驗數(shù)據(jù)，相信隨著研究的不斷深入，家蠶滯育的分子機(jī)制將更加明晰。

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S881.2

A

1007－0982(2014)01－0004－05

2014－03－23;

2014－03－30

國家自然科學(xué)基金(編號31172266);江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目(編號CXZZ12_0726)。

朱娟(1988—)，女，江蘇鹽城，碩士研究生。

E-mail:zhujuan0647@sina.com

沈興家，研究員，博士生導(dǎo)師

Tel:0511－85616543，E-mail:shenxjsri@163.com