雍康 張傳師 楊慶穩(wěn) 姚學萍 曹隨忠

摘要：Ｓ１００Ａ１２屬于Ｓ１００蛋白家族成員，具有上調(diào)內(nèi)皮細胞黏附分子、活化炎性細胞、趨化特性和抗菌活性等功能。綜述了Ｓ１００蛋白的分類及分布、Ｓ１００Ａ１２基因、ｍＲＮＡ和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及離子結(jié)合特性、與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體的關(guān)系、組織及亞細胞定位、在不同疾病與組織中的表達、重組蛋白的抗菌活性等的研究進展。旨在為進一步研究Ｓ１００Ａ１２基因功能和篩選炎性早期診斷指標奠定基礎，同時為開發(fā)重組多肽控制炎癥提供相應資料。

關(guān)鍵詞：鈣結(jié)合蛋白Ｓ１００Ａ１２；表達；抗菌；炎癥

中圖分類號：Ｑ５１文獻標識碼：Ａ文章編號：０４３９－８１１４（２０１４）０８－1742－０4

Ｔｈｅ Advance ｏｆ Studying Ｓ１００Ａ１２

ＹＯＮＧ Ｋａｎｇ１，ＺＨＡＮＧ Ｃｈｕａｎ－ｓｈｉ１， ＹＡＮＧ Ｑｉｎｇ－ｗｅｎ１，ＹＡＯ Ｘｕｅ－ｐｉｎｇ２，ＣＡＯ Ｓｕｉ－ｚｈｏｎｇ２

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｗａｎｚｈｏｕ ４０４１５５，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａａｎ６２５０１４，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓ１００Ａ１２， ａｓ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ Ｓ１００ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ， ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ ｖａｒｉｏｕｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ， ｃｈｅｍｏ ｔａｃｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｉｏｓｉｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Tｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ１００ ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｓ１００Ａ１２ ｇｅｎｅ， ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ and ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｓ１００Ａ１２ ａｎｄ ＲＡＧＥ， ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｓｕｂ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ of Ｓ１００Ａ１２， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ Ｓ１００Ａ１２ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ， ａｎｄ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ were revieuled． Ｔｈｅ ｓｕｍｍａｒｙ will be helpful ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙing ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓ１００Ａ１２ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｉｎｄｅｘｅｓ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， and proviting ｒｅｌｅｖａｎｔ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐing ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅs ｃｏｎｔｒｏｌling ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓ１００ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ１２（Ｓ１００Ａ１２）； ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ； ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ

S100A12基因是1994年首先在豬粒細胞中發(fā)現(xiàn)的［1］。它曾有多種命名：鈣粒蛋白C（CAGC）、MRP6、Co-Ag、CGRP、EN-RAGE以及CAAF1［2］。醫(yī)學臨床發(fā)現(xiàn)， S100A12具有重要的細胞外活性，在川崎病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病和慢性肺囊性纖維化、子宮內(nèi)膜炎等疾病患者的不同組織中高度表達［3-7］，已成為診斷這些疾病的可靠指標。

1S100蛋白的分類及分布

S100蛋白是Moore等1965年首先在牛腦組織中發(fā)現(xiàn)的鈣調(diào)節(jié)蛋白，屬肌鈣蛋白C家族［2］。這是一組低分子量（9～14 kDa）的酸性蛋白質(zhì)，是鈣結(jié)合蛋白家族中最大的子群。到目前為止，發(fā)現(xiàn)了包括S100A1~A13、S100P、S100B、Reperin、前絲凝蛋白（Profilaggrin）及毛透明蛋白（Trychohyalin）等在內(nèi)的21個S100蛋白家族成員，它們在氨基酸水平上存在20%~80%程度不等的一致性序列［8，9］。

S100蛋白具有兩個EF手型結(jié)構(gòu)，末端序列較短。除了S100G，所有S100蛋白都是嚴格對稱的。N端呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通常由14個氨基酸組成，與鈣離子的親和性低，C端由12個氨基酸組成，與鈣離子則有較高的親和性。兩個螺旋位于每個EF手型的鈣離子結(jié)合環(huán)兩側(cè)。除了S100G外，每個S100蛋白包含可變長度的中央鉸鏈區(qū)、C-端可變區(qū)和N-端可變區(qū)［2，8］。S100蛋白一直被認為是一種鈣傳感器蛋白，這是因為它與鈣離子結(jié)合后，其構(gòu)象會發(fā)生改變，一些靶蛋白的結(jié)合位點會暴露出來，進而通過與相應的靶蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)某些多肽的功能或亞細胞分布，在細胞增殖、分化、凋亡、基因表達、分泌及肌肉收縮過程中發(fā)揮重要作用［2，8］。

目前研究認為， S100蛋白發(fā)揮生物學功能的重要形式是二聚體。細胞內(nèi)S100A12以反平行二聚體形式存在，經(jīng)鈣離子激活與靶蛋白相互作用調(diào)節(jié)細胞功能。胞外S100A12主要以二聚體及六聚體形式存在，分別表現(xiàn)出細胞因子樣特性。S100B蛋白不僅可以結(jié)合鈣離子，還能結(jié)合鋅離子，并且親和力較高。鋅離子與S100B蛋白中的組氨酸殘基結(jié)合后，可以使C端構(gòu)象發(fā)生改變，鈣結(jié)合位點之間的距離得到縮短［2］。編碼人類S100A1~S100A16這16種蛋白的基因都定位于1q21，該區(qū)段染色體穩(wěn)定性較差，易發(fā)生雜合性缺失、易位、重疊等多種染色體重排，與腫瘤關(guān)系十分密切［2］。S100蛋白的生物學功能多涉及調(diào)節(jié)鈣離子穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)酶活性、調(diào)節(jié)細胞生長分化，參與細胞骨架建立、蛋白質(zhì)的磷酸化，作為轉(zhuǎn)錄因子參與炎癥反應等［2］。

2S100A12基因，mRNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及離子結(jié)合特性

S100A12基因定位于人類染色體1q21.2-1q22（1q21.3），其染色體定位介于S100A8和S100A9之間，其蛋白相對分子質(zhì)量為10 575，由92個氨基酸組成［2］。雖然在染色體上S100A12與S100A8、S100A9之間的距離較近，但其并不與S100A8、S100A9或者S100A8/S100A9復合物形成復合體［2］。人類S100A12基因長約4.1 kbp。聚腺苷酸完全拉伸，mRNA含有466個堿基（No.NM_005621）。該基因有3個外顯子，被兩個900bp和400bp的內(nèi)含子分開。第一外顯子（48個核苷酸）是非編碼區(qū)，它包含了5′-UTR。一個經(jīng)典的TATA盒（TATAAA）位于30個核苷酸轉(zhuǎn)錄起始位點的上游。外顯子2含有部分5′-UTR（20個核苷酸），外顯子3包含3′-UTR（122個核苷酸）。外顯子2（138個核苷酸）和3（138個核苷酸）編碼蛋白質(zhì)，EF手型的蛋白質(zhì)分別由第二和第三外顯子編碼［2］。成熟S100A12包含91個氨基酸，缺少N-末端蛋氨酸殘基。發(fā)現(xiàn)S100主要在脊椎動物表達，而在軟骨動物體內(nèi)不表達［2］。

人類S100A12序列與豬、兔有70％的同源性，與牛有66％的同源性［2］。人類S100A12分別與人S100A8（鈣粒蛋白A，髓相關(guān)蛋白8）、S100A9（鈣粒蛋白B，髓相關(guān)蛋白14）有40％、46％的同源性。在嚙齒動物中未曾發(fā)現(xiàn)S100A12基因的表達，S100A8似乎是一個功能同源基因［2］。與大多數(shù)S100蛋白家族成員一樣，S100A12蛋白也由兩個EF手型結(jié)構(gòu)組成，EF手型結(jié)構(gòu)又由結(jié)合于鈣離子的螺旋-環(huán)-螺旋配基組成，中央為鉸鏈區(qū)，兩側(cè)為疏水區(qū)，主要以共價二聚體形式存在［2］。

大部分S100蛋白構(gòu)象及功能的不同取決于細胞內(nèi)外鈣、鋅、銅的離子濃度［2］。一般來說，S100蛋白每個二聚體上可以結(jié)合4個鈣離子，與C-末端EF手型親和力較高，而與N端EF手型親和力則較低。人類S100A12在六聚體結(jié)構(gòu)上，除了EF-手型結(jié)合2個鈣離子外，每個亞基還能結(jié)合鈣離子。這就使得每個六聚體上額外地增加了6個鈣離子，增加的6個鈣離子被來自兩個相鄰的二聚體殘基所協(xié)調(diào)［2］。像其他EF-手型蛋白，S100蛋白還能在EF-手型部位結(jié)合鎂離子，但親和力比較低。相對于鎂、鈣離子的選擇性是非常高的。S100A12蛋白上也有鋅離子結(jié)合位點，這個結(jié)合位點由亞基和密切位于二聚體的接口構(gòu)成。值得一提的是，二價銅離子可能與鋅離子結(jié)合在同一位點。這些陽離子可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外S100A12的功能［2］。從豬粒細胞分離S100A12單體研究表明，通過鋅離子，S100A12與鈣離子結(jié)合的親和力有了巨大的調(diào)節(jié)。當銅離子與S100A12二聚體密切接觸時可能使它們的靶蛋白結(jié)合位點或低聚物的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。目前，S100A12是否成為其他銅調(diào)節(jié)蛋白的伴侶或充當銅穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)者被廣泛討論［2］。

3S100A12與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體的關(guān)系

晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced glycation end products，AGE）受體（The receptor for advanced glycation end products，RAGE）是一種具有重要生物學功能的多配體受體，其配體中包括AGE、S100/鈣粒蛋白家族、β淀粉樣肽及兩性素/高速泳動族盒1蛋白等［9］。RAGE能夠結(jié)合一些S100蛋白家族成員，包括S100A12、S100A1、S100B和S100P［10］。是否結(jié)合其他S100蛋白如S100A4、S100A13、S100A8和S100A9，至今仍有爭議［2］。S100A12與RAGE結(jié)合后通過NF-KB和MAPK通路進行信號傳導，增強細胞間黏附分子-1（ICAM-1），血管細胞黏附分子-1（VCAM-1），核因子KB和腫瘤壞死因子（TNF-α）的表達，直接引起單核吞噬細胞、淋巴細胞和內(nèi)皮細胞活化，結(jié)果導致促炎性細胞因子的合成與分泌［11］。因此，這個作用的中斷成功地阻礙了小鼠遲發(fā)型過敏和結(jié)腸炎。此外，RAGE途徑的活化對傷口愈合和腫瘤生長代謝以及淀粉樣變性很重要。有證據(jù)表明，S100A12也可能與細胞表面不存在RAGE配體的結(jié)合位點結(jié)合，比如與肥大細胞結(jié)合，從而證實了RAGE不是S100A12的惟一受體這一觀點。最近證實，一個G-蛋白偶聯(lián)機制對非RAGE介導的肥大細胞和單核細胞發(fā)揮作用［2］。此外，S100A12和S100A13以鈣依賴的方式結(jié)合抗過敏藥物，如肥大細胞穩(wěn)定劑氨來占諾、色甘酸鈉、曲尼司特和奧洛他定等［2］。這表明S100A12和S100A13可能以非RAGE依賴的方式參與了肥大細胞脫顆粒［2］。有研究顯示，S100B和S100A12均可作為RAGE的內(nèi)源性配體，二者作用于RAGE后可激活多種免疫細胞和炎性細胞，在機體的免疫反應和炎癥反應中發(fā)揮著重要作用［2］。研究發(fā)現(xiàn)，S100P也可以作為RAGE的配體，兩者相互作用后可以調(diào)節(jié)胰腺癌細胞的存活、生長及侵襲［12］。RAGE在正常組織及血管中表達量較低而在肺組織、糖尿病患者的內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞及單核巨噬細胞中呈現(xiàn)高表達［2］。

4S100A12組織及亞細胞定位

在人體組織中，S100A12基因的表達幾乎完全局限于嗜中性粒細胞，大約占總靜息中性粒細胞胞漿蛋白的5％［2］。單核細胞也表達S100A12，但較中性粒細胞少。在分化的早期階段，上皮細胞和樹突狀細胞中也發(fā)現(xiàn)了S100A12的表達［2］。在正常條件下，S100A12的表達可以在中性粒細胞和單核/巨噬細胞最豐富的組織和器官（如脾和肺）中觀察到。在缺乏鈣離子的情況下，細胞內(nèi)S100A12主要存在于細胞質(zhì)中，當鈣離子濃度增加時，可誘導S100A12分別向膜和細胞骨架組成部分遷移［2］。

5S100A12在不同疾病與組織中的表達

Ebihara等［3］以實時定量PCR檢測了川崎病患兒急性期及緩解期白細胞中S100蛋白家族基因的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)S100A6、S100A8、S100A9、S100A11、S100A12、S100P及S100Z在急性期均呈現(xiàn)高表達，特別是S100A8、S100A9及S100A12；Foell等［4］用免疫組化對42例內(nèi)風濕性關(guān)節(jié)炎患兒關(guān)節(jié)滑膜中S100A12的表達情況檢測時發(fā)現(xiàn)，S100A12在炎癥性滑液組織中增量表達，但是，在對照組和已經(jīng)成功控制病情患兒的關(guān)節(jié)滑膜中幾乎檢測不到，據(jù)此推測S100A12蛋白可作為類風濕性關(guān)節(jié)炎的診斷指標。Kaiser等［5］提出糞便中粒細胞分泌的S100A12蛋白有助于鑒別炎癥性腸病與腸激惹綜合征。相對于腸激惹綜合征者和健康對照者，活動性炎癥性腸病患兒的糞便中S100A12蛋白表達水平明顯增高。Wittkowski等［6］、 Lorenz等［7］先后對急性肺傷和急慢性肺部疾病患者支氣管肺泡灌洗液中S100蛋白進行檢測時發(fā)現(xiàn)，S100A8/A9、S100A12、RAGE的表達明顯高于健康組，而S100A12的表達水平在病情好轉(zhuǎn)后明顯下降。據(jù)報道，S100A12、S100A8、S100A9也是檢測子宮內(nèi)膜炎和胎兒是否流產(chǎn)的可靠指標［13］。同樣，在幽門螺桿菌感染兒童的胃黏膜中也發(fā)現(xiàn)了這三種基因的表達［14］。Chen等［15］利用半定量RT-PCR技術(shù)對圓環(huán)病毒感染豬不同組織中S100A12基因進行檢測時發(fā)現(xiàn)其増量表達。另外，Chen等［16］還利用Affymetrix基因芯片技術(shù)從感染副豬嗜血桿菌豬的脾臟中檢測到了大量與炎癥有關(guān)的高表達基因，其中就有S100A12基因（上調(diào)高達16.6倍）。Buhimschi等［17］運用蛋白質(zhì)組技術(shù)對羊水的研究表明，鈣粒蛋白C（S100A12）在內(nèi)的4個生物分子可用于檢測子宮內(nèi)感染炎癥的狀態(tài)。Wathes等［18］研究證實，奶牛在產(chǎn)后2周內(nèi)，子宮中S100A12、S100A8、S100A9等抗性基因明顯上調(diào)。有學者首次通過SELDL-TOF質(zhì)譜技術(shù)證實了S100A12和S100A8在懷孕和未孕婦女子宮頸中的存在，并推測生物標記的S100A8和S100A12是子宮頸陰道分泌物的組成部分，參與機體的防御系統(tǒng)，很可能對上行性感染提供持久保護［19，20］。楊永新等［21］研究發(fā)現(xiàn)鈣粒蛋白C類似物在臨床型乳房炎奶牛乳腺組織中表達量增加，據(jù)此推測，鈣粒蛋白C類似物也具有活化吞噬細胞遷移到組織炎癥位點的作用。Buitenhuis等［22］對2頭奶牛乳腺人工感染大腸桿菌24 h后基因表達分析得知，相對于健康奶牛乳腺組織，S100A2、S100A8、S100A9和S100A12 4種基因重復上調(diào)。雍康［23］、曹隨忠等［24］分別應用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)S100A12基因在奶牛、牦牛乳腺和生殖系統(tǒng)（卵巢、輸卵管、子宮頸、子宮體、陰道）上皮組織中均有表達，推測其在抵御奶牛、牦牛乳腺和生殖系統(tǒng)感染中可能發(fā)揮一定的作用。

6S100A12重組蛋白的抗菌活性

S100A12基因在中性粒細胞內(nèi)表達豐富，分泌后可結(jié)合外源抗原，有利于巨噬細胞系統(tǒng)對抗原的清除，在先天免疫過程中發(fā)揮著重要作用，具有上調(diào)內(nèi)皮細胞黏附分子、活化炎性細胞、趨化特性和抗菌活性等功能［1］。有研究表明，S100A12蛋白具有抗菌和抗寄生蟲作用［25］。由S100A12蛋白15 C-末端氨基酸組成的抗菌肽在鋅離子存在的情況下主要有抗革蘭氏陰性菌的作用［26］。Lutzow等［25］用肉湯微稀釋藥敏試驗檢測得知重組牛S100A12（rS100A12）有抑制大腸桿菌生長的能力，在0.025 mg/mL時抗菌活性最大。但在相同條件下，rS100A12在任何濃度時對金黃色葡萄球菌（ATCC25923）生長抑制都不明顯。雍康［23］將S100A12表達純化后所得到的蛋白，對雅安地區(qū)奶牛乳房炎中分離到的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行抗菌時發(fā)現(xiàn)，在0.025 mg/mL時對大腸桿菌沒有抑制作用，但隨著濃度的增加，抑菌作用逐漸增強，在0.500 mg/mL時作用最強。此外還發(fā)現(xiàn)rS100A12在稀釋的濃度范圍（0.05~0.50 mg/mL）內(nèi)對金黃色葡萄球菌沒有抑菌作用，這點與Lutzow等［25］的報道一致。研究報道， S100A7和S100A15也具有抗菌活性［27，28］。奶牛S100A12可能通過募集中性粒細胞來擴大炎癥反應，這種蛋白在抵御乳房炎方面起著重要的作用，因而可以作為一種治療和預防乳房炎的新型蛋白藥物來開發(fā)利用。

7展望

Lutzow等［25］、Mitterhuemer等［29］、Lippolis等［30］、Buitenhuis等［22］、Smolenski等［31］、曹隨忠等［32］、楊永新等［21］、周雷［33］用不同的方法證實了S100A12基因在患乳房炎奶牛的血液、乳腺、乳汁中增量表達，初步斷定可以作為乳房炎早期診斷的一個敏感指標，另外還預測S100A12可能與乳房炎的抗性有關(guān)，可以作為奶牛抗性育種的候選因子。目前，對S100A12基因的分子結(jié)構(gòu)和蛋白功能的研究還不深入。此外，S100A12的抗菌機理仍然模糊不清，還需要進一步研究證實。

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