尹榮江 尹敏 張凱

【摘要】通過RT-PCR方法檢測凋亡抑制因子PED/PEA-15在不同食管癌細胞株中的表達差異性及意義。從而進一步研究PED/PEA-15是否可作為食管癌靶向治療的新靶點。采用不同食管癌細胞株TE1、TE2、TE3。將細胞株經過細胞復蘇、傳代等步驟進行擴增，然后將 TE1、TE2、TE3三種癌細胞分別分為20個備份，分別提取其RNA。通過RT-PCR 方法檢測三種癌細胞中PED/PEA-15表達的差異性。結果：凋亡抑制因子PED/PEA-15在不同食管癌細胞株均有表達，但其表達無明顯差異。

【關鍵詞】凋亡抑制因子；PED/PEA-15；食管癌細胞株

食管癌在我國常見的消化道惡性腫瘤中的發(fā)病率居第四位。食管癌預后較差，五年總的生存率不足20%，嚴重威脅人類健康。研究表明，食管癌的發(fā)生是食管上皮細胞發(fā)生增殖性病變的過程。在食管上皮細胞發(fā)生癌變的過程中，細胞凋亡紊亂為其中重要的環(huán)節(jié)。細胞凋亡紊亂與食管癌的發(fā)生和發(fā)展有著直接性的關系，是影響食管癌發(fā)生發(fā)展的重要因素。

細胞凋亡（apoptosis）是指細胞的程序性死亡（programmed cell death，PCD），凋亡蛋白抑制因子（inhibitors of apoptosis protein，IAPs），與細胞凋亡耐受呈正相關。PED/PEA-15 與 IAPs 的抗凋亡機制相似，這種凋亡抑制蛋白首先于1998年在2型糖尿病患者中被發(fā)現(xiàn)。本研究通過通過 RT-PCR 方法檢測凋亡抑制因子PED/PEA-15 在不同食管癌細胞株中的表達差異性。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)、細胞總 RNA 的提取和 RT-PCR

1.1.1細胞培養(yǎng)

1.1.1.1細胞復蘇：將存放細胞株TE1、TE2、TE3的細胞凍存管從-160℃冰箱內快速取出后立即放入37℃水浴箱內 2min，使其完全融化。然后在無菌操作臺內向其中加入5ml含10%FBS的RPMI1640 完全培養(yǎng)液，放入離心機中以1000rpm離心5min。棄掉上清液，加入含10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)液后反復吹打均勻，移入培養(yǎng)基內，放入5%CO2培養(yǎng)箱內，調至37℃靜置培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)液。

1.1.1.2 細胞傳代：當細胞鋪滿培養(yǎng)基時就可以進行細胞傳代，首先棄掉舊培養(yǎng)液，用PBS沖洗2次，加入胰酶消化液，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，將瓶壁上的細胞全部沖洗下來，棄掉胰酶消化液，加入少量培養(yǎng)液反復吹打。用移液管將瓶內的細胞懸液移入離心管內，放入離心機內，以1000rpm離心5min，棄掉上清液，加入足量培養(yǎng)液，反復吹打后分到兩個培養(yǎng)瓶內，然后同上所述放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.1.1.3 細胞凍存：在凍存細胞前24小時進行換液一次。同上所述常規(guī)進行消化、離心、棄上清液，加入凍存液（10%DMSO）1ml，用移液管反復吹打后按照 1ml/管將細胞懸液移入凍存管內。分別放入 4℃冰箱內 1h，-20℃冰箱內 2h，-80℃內過夜，最后放入-160℃冰箱內凍存。

1.1.2 組織總 RNA 的提取：

細胞經復蘇、傳代后，選取合適的TE1、TE2、TE3細胞株，分別將兩種細胞株分為20個備份，用于提取RNA。

1.1.2.1 將細胞放入研磨器內，分別向其中加入1 ml Trizol/1 mg，然后進行反復研磨，使組織充分裂解。

1.1.2.2 分別將兩組研磨液導入離心管中并做好標記，并放置冰中5min。

1.1.2.3 從冰中將兩組離心管取出，并加入200μl 氯仿/1 ml Trizol，劇烈震蕩15s。

1.1.2.4 取出離心管，再次放入冰中靜置3min。

1.1.2.5 取出離心管放置 4℃離心機中調至12000 rpm，離心15min。

1.1.2.6 此時離心管中的液體分為3層，由上而下分別是無色液相，中間相，紅色酚-氯仿層。

1.1.2.7 用無菌移液器將無色液相移入另一組離心管中，并標記好。

1.1.2.8 在兩組無色液相中加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻直至分層消失，放入冰中靜置10min。

1.1.2.9 將兩組裝有無色液相的離心管放入4℃離心機中調至12000rpm，離心 10min。

1.1.2.10 取出離心管將上層清液倒掉，用75%乙醇1ml洗滌沉淀。

1.1.2.11 再次將離心管放入4℃離心機中調至7500rpm，離心5 min。

1.1.2.12 倒掉上層清液，晾干后可見管底白色沉淀。

1.1.2.13 加入1‰DEPC 蒸餾水20μl后，進行吹打混勻使其溶解，放入-80℃冰箱中保存。

1.1.3 RNA 的鑒定和定量

1.1.3.1 總 RNA 完整性的鑒定

將提取的總 RNA 與 6x 上樣緩沖液按 5：1 進行混合，在 1.5%瓊脂糖凝膠中以 3-5V 電壓進行電泳。待上樣緩沖液中的溴酚藍遷出一定距離后，停止電泳。將凝膠移至紫外凝膠成像儀下，在 300nm 紫外光線照射下進行觀察，RNA 的電泳帶 28s、18s、5s 應清晰無降解。

1.1.3.2 總 RNA 純度的鑒定和定量

將鑒定合格的總 RNA 溶解液用無菌去離子水稀釋適當倍數(shù)后，在紫外分光光度儀上測 260nm 和 280 nm 兩個波長的吸光度（OD260 和OD280），當 OD260/OD280在 1.7-1.8 以上，證明沒有污染，方可使用。RNA含量（ug/ml）=OD260x40x 稀釋倍數(shù)。

1.1.4 RT-PCR

1.1.4.1 RNA 逆轉錄成 cDNA

逆轉錄體系如下：

反應條件：將混合反應體系依次放入25℃溫箱中l(wèi)0min、42℃溫箱中60min、99℃溫箱中5min，再將其置于4℃冰箱中5min，最后將其放入-80℃冰箱中保存。

1.1.4.2 PCR 的擴增

以適量反轉錄所得的cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶催化下進行PCR擴增。釆用Primer5.0軟件設計PED/PEA-15基因PCR引物（產物大小為 393bp）所用PED/PEA-15引物及擴增片段序列如下：

1.1.5 PCR 擴增產物的鑒定：

將 2μl6x 上樣緩沖液加入到 6μlPCR 產物中，在 1.5%瓊脂糖凝膠中進

行電泳，用 100bpDNAmarker 作 DNA 分子量標準帶，用 EB 進行染色，在紫外凝膠成像儀上進行觀察并拍照。如出現(xiàn) 393bp 的電泳帶，則為PED/PEA-15 陽性；同時出現(xiàn) 604bp 電流帶，則為 GAPDH 陽性。

2 結果

根據(jù)RT-PCR實驗結果進行統(tǒng)計學分析得出：凋亡抑制蛋白 PED/PEA-15 的 mRNA 在兩種不同食管癌細胞株 TE1、TE2、TE3中表達的結果為：TE1（1.513±0.118）、TE2（1.491±0.064）、TE3（1.501±0.089）。該mRNA在兩種不同癌細胞中均有表達，但表達水平無明顯差異（P>0.05）。

3 討論

食管癌是較常見的消化道惡性腫瘤之一。在我國食管癌發(fā)病率和死亡率較高，全國每年發(fā)病人數(shù)占全世界發(fā)病人數(shù)一半以上。研究表明，食管癌的發(fā)生是多種基因變化先后累積或疊加綜合作用的是一個進行性的多階段過程，是一個由多因素累積、多基因變異參與并相互作用的復雜過程。細胞凋亡（apoptosis）是由 Kerr 等人命名的，是一個由基因控制的高度有序、有一系列酶參與的主動過程。細胞凋亡紊亂直接影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有，被認為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。由于各種抑制細胞凋亡的因素使得細胞的生存期得以延長，從而使得轉化突變的細胞生長得以積累，最終導致腫瘤的發(fā)生。PED/PEA-15 是一種新近發(fā)現(xiàn)的具有廣譜抗凋亡功能的小分子蛋白質。PED/PEA-15能使腫瘤細胞的凋亡受到抑制，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程產生促進作用。

我們的實驗通過RT-PCR方法，檢測到PED/PEA-15基因在三種不同的食管癌細胞株中的均有表達，但表達率無明顯差異，說明PED/PEA-15在不同食管癌細胞株中的表達具有普遍性。

參考文獻：

[1]Ferlay J，Bray F，Pisani P，et al.Globocan 2002：Cancer Incidence，Mortali-ty and Prevalence Worldwide，Version 2.0.LARC Cancer Base No5.Lyon，IARCPress，2004

[2]喬穎，左靜，劉巍.食管癌發(fā)生發(fā)展過程中的相關癌基因.臨床薈萃，2009，24（4）：366-368

[3]張勤麗，牛僑等.細胞凋亡機制概述.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學，2007，24（1）：102-107